파트 2: 단백뇨 만성 신장 질환은 적혈구 수명, 변형성 및 대사 변화와 관련이 있습니다
Mar 05, 2022
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독소루비신 유발 신장 손상은 쥐의 적혈구 수명, 형태 및 생물 물리학 적 특성을 변경합니다
DIN 도입 후 20일, 환원형 개발과 동시에신장 기능(그림 1b), 형광 염료 5(6)-CFDA, SE,24는 적혈구로 빠르게 흡수되어 생체 내 표시된 시점에서 적혈구 제거율을 조사하기 위해 iv 주입되었습니다. 그림 4a에 표시된 대표적인 히스토그램은 순환에서 표지된 RBC를 제거하고 표지되지 않은 RBC로 교체함을 나타냅니다. 증가된 RBC 손실은 염료 투여 3일 후에 이미 명백했으며 최대 37일까지 DIN을 사용한 129S1/SvImJ 마우스에서 RBC의 제거가 상당히 더 빨랐습니다. 건강한 마우스와 함께(그림 4b).
혈액 도말에서 가져온 이미지는 DIN(그림 4c) 및 Nphs2Dipod 마우스(보충 그림 S4A)가 있는 129S1/SvImJ 마우스에서 추출한 RBC의 형태학적 변화를 보여주었습니다. 건강한 생쥐에서 적혈구는 양면이 오목한 원반 모양을 나타냅니다. DIN이 있는 129S1/SvImJ 마우스에서 우리는 stomatocytes(빨간색 별), 눈물 방울 세포(검은색 삼각형), schistocytes(검은색 점) 및 microcytic cells(검은색 화살표)의 수가 증가하는 것을 관찰했습니다(그림 4c). Nphs2Dipod 마우스는 schistocytes의 증가된 비율(검정색 점, 보충 그림 S4A, 아래쪽 이미지, 왼쪽)을 보여 주었고 세포는 다색이었습니다(보충 그림 S4A, 아래쪽 이미지, 오른쪽).
RBC 기능적 변화를 추가로 조사하기 위해 30일째의 변형성 측정을 엑타사이토메트리를 사용하여 수행했습니다.32RBC 변형성은 DIN이 있는 129S1/SvImJ 마우스와 Nphs2Dipod 마우스에서 유의하게 감소했으며, 이는 감소된 최대 신장 지수(EImax)로 표시됩니다(그림 4d 및 보충 그림 S4B). EImax(그림 4e)의 5{23}}%(SS1/2)에 대한 전단 응력 및 따라서 SS1/2 EImax 비율(그림 4f)은 DIN이 있는 129S1/SvImJ 마우스에서 유의하게 증가하여 더 단단한 RBC를 나타냅니다. EImax의 SS1/2는 Nphs2Dipod 마우스에서 유사했습니다(보충 그림 S4C). SS1/2 EImax 비율은 건강한 C57BL/6 마우스와 비교하여 Nphs2Dipod 마우스에서 증가되는 경향이 있습니다. 그러나 그 차이는 통계적 유의성에 도달하지 못했습니다(P=0.06)(보충 그림 S4D).
시험관 내에서 고장성 세포외 조건에 대한 RBC의 노출이 신장 수질에서 발생하는 삼투 환경을 모방함에 따라 우주는 30일째에 수행될 수 있고 이전에 설명된 바와 같이 여러 삼투 민감성 매개변수가 결정되었습니다.33 Omin은 최소 RBC 변형성에서의 삼투압 농도를 나타내며, 그 이상에서는 RBC가 삼투압 농도의 추가 감소와 함께 용해됩니다. Omin 값은 DIN이 있는 129S1/SvImJ 마우스에서 더 높았고 오른쪽으로 이동했습니다(그림 5a 및 d). Nphs2Dipod 마우스에서 더 높은 Omin에 대한 유사한 경향이 관찰되었습니다(보충 그림 S4E). 세포의 수화 상태를 반영하는 Ohhyper의 값은 DIN이 있는 129S1/SvImJ 마우스에서 상당히 높았지만(그림 5b) Nphs2Dipod 마우스와 각각의 대조군 마우스에서는 유사했습니다(보충 그림 S4F). 등장성에서 최대 변형성(EImax)은 세포가 최대 타원에 도달한 지점입니다. 등장성의 EImax는 DIN이 있는 129S1/SvImJ 마우스에서 크게 감소했지만(그림 5c) 건강한 C57BL/6 마우스와 비교하여 Nphs2Dipod 마우스에서는 차이가 없었습니다(보충 그림 S4G). 전반적으로, 이러한 결과는 감소된 막 무결성 및 탄성을 나타내지만 129S1/SvImJ 및 Nphs2Dipod 마우스의 형태 변화 뿐만 아니라 DIN이 있는 129S1/SvImJ 마우스의 RBC의 더 높은 삼투 취약성을 나타냅니다.
RBC는 생쥐에서 단백뇨 신장 질환 동안 대사적으로 재프로그래밍됩니다.
RBC 풍부 및 형태의 변화와 관련된 분자 적응을 신장 손상의 기능으로 더 잘 이해하기 위해 DIN 및 Nphs2Dipod 마우스가 있는 129S1/SvImJ 마우스의 RBC를 질량 분석 기반 대사체학으로 분석했습니다(그림 6a 및 보충 그림 S5A). 이 접근 방식을 사용하여 129S1/SvImJ 마우스 및 Nphs2Dipod 마우스에 대해 256개 대사 산물의 상대적 수준을 결정했습니다. 이러한 데이터를 체계적으로 분석하기 위해 부분 최소 제곱 판별 분석 및 계층적 클러스터링 분석을 포함한 다변량 분석을 수행했습니다. 흥미롭게도 두 모델의 RBC 대사체에 대한 부분 최소 제곱 판별 분석은 유사한 클러스터링 패턴을 보여주었습니다.
구체적으로, 모델 유도 시점의 샘플이 모든 시점의 건강한 샘플과 함께 클러스터링되었지만, 신장 마우스의 샘플은 구성 요소 1과 함께 건강한 대조군 샘플과 독립적으로 클러스터링되었습니다(그림 6b 및 보충 그림 S5B). 두 모델에서 명백한 클러스터링 패턴에 따라, 각 모델에 대한 대사체학 데이터의 계층적 클러스터링 분석은 산화 스트레스 관리와 관련된 대사 산물뿐만 아니라 뉴클레오티드, 아미노산, 아실카르니틴 및 지방산에 대한 유사한 경향을 강조했습니다(그림 6c). 및 보충 그림 S5C, S6 및 S7). 예를 들어, 퓨린 대사산물이자 적혈구의 산화 스트레스 지표인 알란토인의 수치는34 및 감소된 글루타티온은 두 신증 마우스 모델에서 시간이 지남에 따라 유의하게 축적되어 활성 산소 종 생성 및 항산화 글루타티온 시스템의 활성화를 나타냅니다(그림 6d 및 보충 그림 S5D). 마찬가지로, 코엔자임 A(CoA) 전구체 판토텐산염의 수준은 시간이 지남에 따라 축적되었습니다(그림 6e 및 보충 그림 S5E).
유사한 패턴이 유리 지방산 헥사데센산(C16:1), 옥타데센산(C18:1) 및 도코사펜타엔산(C22:5)의 수준에서 분명했지만, 각 모델에는 고유한 시간 패턴이 있었습니다(그림 6f 및 보충 그림 S5F).
지방산 외에도 하이드록시옥타노일-카르니틴(AC C{1}}OH), 하이드록시데카노일-카르니틴(AC C{3}}OH) 및 도데카노일-카르니틴(AC C12:1)을 포함한 아실카르니틴도 반응했습니다. 두 모델 모두에서 단백뇨 신병증의 유도에 영향을 미칩니다(그림 6g 및 보충 그림 S5G).
종합하면, 이러한 발견은 단백뇨의 유도에 대해 시사한다.신장병2개의 유사한 마우스 모델에서 증가된 수준의 산화 스트레스는 막 지질의 아실 사슬에 손상을 줄 수 있습니다. 적혈구는 새로운 지질을 합성할 수 있는 능력이 없기 때문에 손상된 아실 사슬의 포스포리파제 매개 제거 및 손상되지 않은 지방산으로의 교체에 의존하는 시스템을 사용합니다. Lands 주기35라고 하는 이 시스템은 막 교체를 위해 아실카르니틴과 평형을 설정하는 CoA에 대한 접합에 의한 아실 사슬 활성화에 의존합니다(그림 6h 및 보충 그림 S5H).
빈혈이 있는 단백뇨 CKD 환자는 증가된 적혈구 사망을 나타냅니다.
To confirm that PS-exposing RBCs occur also in human CKD, as described earlier,37 we analyzed blood samples from 25 patients treated by our outpatient clinic. To match the mouse models that represent nephrotic syndrome with preserved GFR during the first 10 days, and then advanced CKD with reduced GFR from day 20 onwards (Figure 1 and Supplementary Figure S2), we analyzed 10 patients with primary nephrotic syndrome representing proteinuric CKD with preserved GFR (>1.73m2당 60ml/min) 및 신 범위 단백뇨 및 GFR이 있는 CKD 환자 15명<60 ml/min="" per="" 1.73="">2. 환자 특성은 표 1에 나와 있습니다. 헤모글로빈 농도로 정의되는 신장 질환 관련 빈혈<13.5 g/dl="" in="" men="" and=""><12 g/dl="" in="" women,="" was="" observed="" in="" 4="" of="" the="" 10="" primary="" nephrotic="" patients="" (red="" triangles="" in="" figure="" 7),="" whereas="" 14="" of="" 15="" ckd="" patients="" with="" nephrotic-range="" proteinuria="" and="" reduced="" gfr="" were="" anemic="" (figure="" 7a).="" in="" the="" latter="" group,="" plasma="" epo="" concentrations="" and="" reticulocyte="" production="" index="" were="" not="" increased="" (figure="" 7b="" and="" c),="" consistent="" with="" reduced="" erythropoiesis.="" in="" fluorescence-activated="" cell="" sorting="" analysis,="" primary="" nephrotic="" patients="" and="" patients="" with="" advanced="" ckd="" had="" a="" higher="" rate="" of="" ps-exposing="" cells="" (mean,="" 1.0%="" 0.3%="" and="" 1.4%="" 0.7%,="" respectively)="" compared="" with="" healthy="" subjects="" (mean,="" 0.6%="" 0.1%;="" figure="" 7d).="" rbc="" cell="" death="" in="" patients="" with="" primary="" nephrotic="" syndrome="" and="" advanced="" ckd="" was="" triggered="" by="" higher="" levels="" of="" reactive="" oxygen="" species="" (figure="" 7e)="" and="" increased="" ceramide="" levels="" (figure="" 7f).="" augmented="" intracellular="" calcium="" concentration="" was="" found="" in="" patients="" with="" advanced="" ckd="" (figure="">
원발성 신증후군 및 진행성 CKD 환자의 인간 RBC는 마우스 모델에서 관찰된 바와 같이 형태학적 변화를 보였습니다(그림 4c 및 7j–l 및 보충 그림 S4A). RBC 형태는 대조군에서 정상이었지만, 원발성 신증후군이 있는 빈혈 환자와 진행성 CKD 환자는 눈물방울 세포(검은색 삼각형)와 극피세포(검은색 십자가) 수가 증가했습니다(그림 7k 및 l). 또한, 표적 세포는 빈혈이 있는 원발성 신증 환자와 진행성 CKD 환자에서 발생했습니다(적십자, 그림 7k 및 l). 빈혈이 없는 원발성 신증 환자를 포함한 모든 환자 그룹은 구형구의 비율이 증가했습니다(파란색 화살표, 그림 7j-l). 인간 RBC의 변형성을 분석하기 위해 ektacytometry를 수행했습니다. 건강한 대조군과 비교하여 최대 변형성(EImax)은 진행된 CKD 환자에서 감소했습니다(그림 7h). EImax는 통계적 의미에 도달하지 못한 원발성 신증후군 환자에서 더 낮은 경향이 있었습니다(그림 7h). 등장성에서 매개변수 SS1/2, Omin, Ohyper 및 EImax는 건강한 대조군, 원발성 신증 환자 및 진행성 CKD 환자 간에 유의하게 다르지 않았습니다(보충 그림 S8A-D).
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논의
현재 연구는 단백뇨의 2 쥐 모델에서 신장 질환 관련 빈혈로 이어지는 새로운 병태 생리 학적 메커니즘을 보여줍니다신장병심하게 손상된신장 기능. 우리의 연구는 이러한 모델에서 빈혈이 PS에 대한 노출 및 가속화된 식세포 제거에 의해 유발된 감소된 RBC 수명의 결과임을 보여줍니다. 흥미롭게도, 이 생쥐에서 적혈구 생성 촉진에도 불구하고 빈혈이 발생했으며, 이는 적혈구 세포 사멸 증가를 통한 적혈구 수명 감소가 이러한 발견에 대한 대안적 설명이 될 수 있음을 시사합니다. 빈혈이 있는 CKD 환자(도 77)와 대조적으로, 두 마우스 모델 모두 증가된 혈장 EPO 농도를 특징으로 합니다. 이것은 아마도 신장의 간질에 위치한 EPO 분비 세포를 보존하는 이러한 모델에서 EPO 분비 능력의 보존으로 추측할 수 있습니다. 그러나 이러한 모델에서 증가된 EPO 분비는 RBC 세포 사멸이 신장 질환 관련 빈혈의 발병기전에 주요 역할을 한다는 결론을 무효화하지 않습니다. 반대로 EPO 분비 증가에 의한 적혈구 생성의 자극은신부전이 모델에서. 이러한 라인을 따라, 증가된 비장 용적과 함께 증가된 골수외 적혈구 생성이 최근에 빈혈이 있는 다른 단백뇨 마우스 모델에서 관찰되었습니다.38
단백뇨 CKD 및 수반되는 빈혈이 있는 환자에서 우리는 또한 활성 산소 종 및 세라마이드의 더 높은 수준과 함께 PS 노출 RBC의 증가된 비율을 관찰했습니다. 이것은 가속된 적혈구 사망이 인간 CKD에서 신장 질환 관련 빈혈의 발병기전에 관련될 수 있음을 시사합니다. 혈장 EPO 농도와 망상적혈구 생성 지수는 빈혈성 CKD 환자에서 증가하지 않았으며 적혈구 생성 감소를 가리키며 적혈구 사망과 함께 신장 질환 관련 빈혈을 악화시킬 것으로 예상됩니다. 인간 CKD에서 신장의 EPO 분비 손실에 대한 이유는 불분명합니다. 놀랍게도 GFR이 정상인 모든 환자에서 빈혈이 있는 것은 아니지만 GFR이 감소한 환자는 모두 빈혈이 있어 장기 및 진행성 CKD의 영향을 나타냅니다. 특히, CKD의 상대적인 EPO 결핍은 새로운 종류의 프롤릴 하이드록실라제 억제제를 사용하여 극복할 수 있습니다.39EPO 저분비의 가능한 원인으로 교란된 산소 감지를 제안합니다.
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우리의 데이터는 증가된 세포질 Ca2þ 수준과 직접적으로 관련될 수 있는 단백뇨 신병증의 두 마우스 모델에서 감소된 RBC 변형성을 보여줍니다.40 함께, 이러한 메커니즘은 RBC 세포 사멸의 유도 및 혈액 순환에서 노화되고 손상된 RBC의 제거를 촉진하기 위해 협력하여 작용할 수 있습니다.15또한, 우리는 산화 스트레스와 막 지질 리모델링을 나타내는 이러한 세포에서 대사 재프로그래밍을 관찰했습니다. CoA와 acyl-CoA는 이 샘플에서 직접 측정되지 않았지만 카르니틴 팔미토일 트랜스퍼라제에 의해 적혈구에서 활발히 아실카르니틴으로 전환됩니다.36후자의 화합물 클래스의 축적 수준은 이러한 대사 산물이 RBC 막을 통해 쉽게 운반되지 않기 때문에 신병증에서 이러한 기전의 활성화를 나타냅니다.41 추가 지원으로 판토텐산염을 포함한 CoA 전구체의 두 모델 모두에서 축적이 관찰되었습니다.42그리고 대사43유리 지방산을 증가시키고 유리 카르니틴을 감소시키는 것과 동시에 적혈구에 의해. 흥미롭게도, 우리는 이전에 이러한 변화가 세포 내 Ca2þ의 초생리학적 수준과 관련하여 발생한다는 것을 발견했습니다.16이러한 결과는 생체 외에서 생성되었지만 생체 내에서도 유사한 반응을 보고합니다. 또한, 아실카르니틴은 막 특성을 직접 조절할 수 있습니다.44RBC 변형성과 상관관계,45, 삼투 및 산화 용혈뿐만 아니라.46비접합 유리 카르니틴은 막 단백질 간의 상호작용을 매개하여 막 변형성을 촉진합니다.47 아마도 아실카르니틴 생성을 위한 소비 증가로 인해 신장병이 있는 마우스의 적혈구에서 카르니틴 수준이 현저히 감소한 것을 관찰한 결과 우리가 동시에 관찰한 유변학적 매개변수 손상에 기여할 수 있습니다.
우리의 연구 결과는 DIN과 포도신 결핍이 모두 있는 생쥐에서 RBC 사망으로 이어지는 일반적인 기전을 제안하며, 이는 신 범위의 단백뇨와 더 중요한 것은 중증의신부전20일째부터 관찰된 마우스 모델에서. 인간에서 GFR이 감소된 진행성 CKD는 빈혈의 강력한 예측인자입니다.48RBC 사망의 자극은 요독 환경과 관련될 수 있습니다. 진행성 CKD에서는 많은 요인과 이상이 작용하여 신장 질환 관련 빈혈을 촉진할 수 있음을 인정해야 합니다. RBC 사망의 자극에 대한 무거운 단백뇨의 기여는 불분명하지만 입증되지는 않았지만 트랜스페린 또는 RBC 대사를 조절하는 다른 요소와 같이 소변에서 소실되는 요인과 관련이 있을 수 있습니다.49지금까지 신장질환 관련 빈혈의 현재 치료는 철 또는 EPO 치환에 의한 적혈구 생성 증가에 중점을 두고 있습니다.50경구 저산소증 유발 인자 단백질 안정제의 적용으로,51또는 경구 또는 정맥내 철 투여에 의해.52그러나 이러한 치료법은 증가된 적혈구 사망을 고려하지 않습니다. 혈액 투석 및 복막 투석 환자에 대한 이전 단면 연구에서 우리는 PS 노출 RBC의 비율이 더 높은 환자가 더 높은 EPO 용량으로 치료되었음을 발견했습니다.14 따라서 RBC 세포 사멸의 개선은 신장 질환 관련 빈혈을 치료하는 가능한 치료 접근법이 될 것으로 약속합니다. 이러한 맥락에서 RBC 세포 사멸53에 대한 다양한 약리학적 제제의 억제 효과는 인간 및 동물 연구가 더 필요합니다.
결론적으로, 변경된 세포 대사는 증가된 혈청 EPO 수준에도 불구하고 단백뇨 CKD의 마우스 모델에서 RBC 기능 장애, 증가된 RBC 사멸 및 따라서 빈혈에 기여합니다. 이 연구 결과는 인간의 CKD와 관련된 빈혈의 기전을 부분적으로 설명할 수 있습니다.
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폭로
기사의 내용과 관련이 없지만 ADA와 TN은 Omix Technologies, Inc.의 설립자입니다. 다른 모든 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않았습니다.
데이터 진술
데이터는 합당한 요청에 따라 제공됩니다.
감사의 말
저자는 Andrea Janessa의 전문 기술 지원을 인정합니다. 이러한 연구는 독일 연구 재단에서 RB(BI 2149/2-1) 및 FA(AR 1092/2-2)에 대한 보조금으로 지원되었습니다. LS는 Tübingen University의 의학 교수진이 IZKF(Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung) 보조금으로 지원했습니다. SMQ는 Canadian Blood Services의 리소스에 의해 지원되었습니다. 캐나다 정부 자금 지원의 조건으로 이 보고서에는 "여기에 표현된 견해가 반드시 캐나다 연방 정부의 견해를 나타내는 것은 아닙니다."라는 문구가 포함되어야 합니다.
저자 기여
RB와 FA가 연구를 설계했습니다. 데이터 수집은 RB, TN, MG, TD, DE, MW, LS, MX, JMB, MZK, KO, LK, IG-M 및 BF에 의해 수행되었습니다.
통계 분석은 RB, TN, MG, TD, LS, JMB, LK, IG-M 및 ADh로 수행되었습니다. 및 수치는 RB, TN, MZK, IG-M, LQ-M, BF 및 ADh에 의해 생성되었습니다. RB, TN, ADA, MG, BNB, LS, AS, TB, MS, ALB, FG, SMQ,
FA는 데이터를 해석했습니다. 원고는 RB, TN, ADA, MG, BNB, TB, ALB, FG, SMQ 및 FA에서 작성, 검토 및 편집했습니다.
보충 자료
보충 파일(PDF)
보충 자료 및 방법.
그림 S1. 129S1/SvImJ 및 Nphs2Dipod 마우스에 대한 연구의 실험적 설계.
그림 S2. Nphs2Dipod 생쥐에서 podocin 발현의 삭제 및 신증후군의 특징.
그림 S3. Nphs2Dipod 생쥐의 실험적 신 증후군에서 적혈구 생존율 감소.
그림 S4. Nphs2Dipod 마우스에서 변형된 형태 및 적혈구의 변형 감소.
그림 S5. 대사체학은 Nphs2Dipod 마우스의 적혈구 내 산화 스트레스의 축적 및 막 지질 리모델링의 활성화를 나타냅니다.
그림 S6. 대사체학은 129S1/SvImJ 마우스에서 얻은 적혈구 내에서 변경된 대사를 나타냅니다.
그림 S7. 대사체학은 Nphs2Dipod 마우스로부터 받은 적혈구 내에서 변경된 대사를 나타냅니다.
그림 S8. 최대 적혈구(RBC) 변형성의 1/2에서 전단 응력과 적혈구 삼투압 민감도는 원발성 신증후군과 만성 신장 질환(CKD)이 있는 진행 환자에서 유의하게 다르지 않습니다.
참조
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