파트 2: Verbascoside는 ER 스트레스로부터 췌장 세포를 보호합니다
Mar 05, 2022
연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com
알레산드라 갈리 1명, 파올라 마르치아니 1명, 알제르타 마르쿠 1명, 실비아 기슬란조니 1명, 페데리코 베르투치 2명, 라파엘라 로시 3명, 알레시아 디 지안카밀로 3명, 미켈라 카스타냐 1명, 칼라 페레고 1명,*
3.4 버바스코사이드 조절 - 세포 미토콘드리아 활성 및 역학
MTT 생존력 분석은 다음의 가능한 영향을 시사합니다.버바스코사이드이 세포 유형에서 영양 상태와 세포 생존에 대한 인슐린 분비의 커플링을 보장하는 미토콘드리아에 직접적으로 작용합니다. 모양과 막 전위는 미토콘드리아 건강의 지표입니다[42]. 우리는 먼저 농도가 내부 미토콘드리아 막 전위에 의존하는 투과성 염료인 MitoSpyw Orange CMTMRos로 세포를 라벨링하여 미토콘드리아 막 전위를 평가한 반면, MitoSpyw Green FM은 데이터를 미토콘드리아 질량으로 정규화하는 데 사용되었습니다(그림4A,B). 미토콘드리아의 막전위버바스코사이드- 기저 및 스트레스 조건 모두에서 대조군에 비해 처리된 세포가 증가하였다. 재미있게,버바스코사이드대사 산물은 다른 효과를 발휘했습니다. 카페 산은 미토콘드리아 잠재력을 개선하지 않은 반면, 하이드록시티로솔은 세포 생존율에 대한 데이터와 일치하여 미토콘드리아 기능의 용량 의존적 손상을 일으켰습니다. 이러한 효과는 H2O2 노출 후에 더 분명했습니다(그림 S3).
기능은 형태와 엄밀히 관련되어 있으므로 미토콘드리아의 페렛 직경, 면적 및 원형도를 측정했습니다. 급성 산화 스트레스는 광범위한 미토콘드리아 분열을 촉진하여 더 작은 원형 미토콘드리아를 생성합니다[42]. H2O2 스트레스 조건 하에서, 버바스코사이드 처리 세포의 미토콘드리아는 대조군보다 더 길어지고 증가된 표면을 보였다(그림 4C,D 및 그림 S4). 미토콘드리아 원형도는 대조군보다 버바스코사이드 처리된 세포에서 더 낮았고 차이는 H2O2 처리된 세포에서 더 분명했으며(그림 S3), 폴리페놀의 보호 역할을 다시 확인했습니다.
영양 상태 또는 스트레스가 많은 조건에 반응하여 모양을 수정하는 이러한 세포 소기관의 능력은 융합 및 분열 사건의 제어 하에 있으며 미토콘드리아 운동성을 필요로 합니다[39]. 미토콘드리아 움직임을 추적하면 이동한 누적 거리를 계산할 수 있었고 분석은 이미 기본 조건에서 대조군과 비교할 때 버바스코사이드 처리된 세포에서 미토콘드리아 역학의 상당한 증가를 보여주었습니다(그림 4E, F 및 비디오 S1-S4). 그 효과는 H2O2 처리 후에 더 두드러졌으며 실제로 버바스코사이드 전처리는 미토콘드리아 역학에 대한 산화 스트레스의 영향을 거의 완전히 되돌렸습니다.
종합하면 이러한 데이터는 스트레스 조건에 대한 이 세포 소기관의 신속한 적응을 촉진하는 데 중요한 미토콘드리아 역학을 보장하는 버바스코사이드의 핵심 역할을 강력하게 뒷받침합니다.
3.5 랑게르한스의 생존 및 기능에 대한 Verbascoside 영향
번역 가능성을 고려하여버바스코사이드인간 건강에 적용하기 위해 우리는 -세포에 대한 생리병리학적 및 약리학적 연구를 위한 보다 적절한 모델인 인간의 고립된 랑게르한스 섬에 대한 영향을 확인했습니다. 분리된 섬을 5일 동안 16μM 버바스코사이드로 처리하고 미토콘드리아 막 전위를 평가했습니다. 그림 5A에서 보고된 바와 같이, H2O2 노출 후 대조군 인간 섬에서 세포 소기관 전위가 손상되었지만, 버바스코사이드 전처리된 섬에서 미토콘드리아의 내막 전위는 유의하게 감소하지 않았으며, 이는 ROS 유도에 대한 버바스코사이드의 보호 역할의 가설을 뒷받침합니다. 세포 기능 장애. ER-스트레스 마커 발현의 분석은 16μM verbascoside에서 유지된 두 개의 별개의 섬 제제에서 P-eIF2 분획의 중요한 감소를 보여주었으며, 이는 인간 샘플에서도 이 경로의 하향 조절을 확인시켜줍니다(그림 5D). 폴리페놀 처리의 유익한 효과는 대조군과 비교할 때 버바스코사이드 처리 섬에서 관찰된 증가된 인슐린 함량에 의해 입증되었습니다(그림 5B). 우리 실험의 데이터 분산은 버바스코사이드 처리 섬에서 포도당 자극 인슐린 분비(GSIS)의 유의미한 차이를 입증하지 못했지만 긍정적인 경향은 기저 조건과 스트레스 조건 모두에서 명백해 보입니다(그림 5C).
4. 토론
산화 스트레스와 염증은 제2형 당뇨병 동안 발생하는 α-세포 기능 장애의 기초이므로[43,44] 기능성 식품, 기능식품, 파이토케미칼이 제2형 당뇨병을 예방하는 도구로 연구되고 있다[45]. 본 연구에서는 신경세포에서 항염 및 항산화 활성을 나타내는 것으로 알려진 verbascoside에 초점을 맞추었다[18]. 높은 구조적 복잡성에도 불구하고, 일부 대사 산물과 함께 Lippia citriodora 추출물을 먹인 쥐의 혈장에서 verbascoside와 isoverbascoside가 발견되었습니다[20]. 또한, verbascoside와 verbascoside의 세포 축적은 유방암 세포주 SKBR3에서 감지되었으며 Caco{12}} 세포에 대해 수행된 연구에 따르면 적당량의 verbascoside와 isoverbascoside가 시험관 내 소화 후에도 손상되지 않고 생체에 접근할 수 있는 것으로 나타났습니다. 프로세스. 또한 Caco{13}}는 10~100uM 범위에서 신속하고 선형적인 수송을 통해 두 분자를 모두 흡수할 수 있습니다[22]. 인간의 버바스코사이드 생체이용률에 대한 데이터는 보고되지 않았지만, 위에서 언급한 연구에 따르면 대사되지 않은 버바스코사이드가 장 장벽을 가로질러 혈장을 순환하며 내분비 세포에 항산화 효과를 발휘할 수 있다고 제안합니다. 콩팥.
우리는 기본 및 스트레스 조건 모두에서 클론 및 인간 세포에 대한 버바스코사이드의 용량 의존적(0.8–16 uM) 보호 역할을 발견했습니다. 이 효과는 16μM 농도에서 실제로 세포독성을 나타내는 대사산물인 카페인산과 하이드록시티로솔이 아니라 버바스코사이드 자체 때문입니다. 우리 실험에서 활성으로 입증된 농도는 버바스코사이드를 먹인 동물에서 설명한 농도와 일치합니다[20].
우리는 verbascoside가 막 수용체에 결합하여 세포 외에서 작용하는지, endocytosis에 의해 내재화되고 세포 내에서 작용하는지 알지 못하지만, 우리의 데이터는 verbascoside가 항산화 및 항염증 특성을 가지며 ER-스트레스 관련 기능 장애로부터 세포를 보호한다는 것을 확인했습니다. UPR 및 미토콘드리아 역학 촉진.
실제로, 우리는 HNE 및 아크롤레인 발현을 통해 측정된 지질 과산화의 감소에 의해 추가로 확인된 버바스코사이드 처리 세포에서 ROS 함량의 상당한 감소를 감지했습니다. 대부분의 식물 폴리페놀과 달리 버바스코사이드 ROS 소거 활성은 직접 경로보다는 주로 간접적(ROS 제거 효소의 상향 조절을 통해)을 따릅니다. 사실, 그것은 Nrf2(NF-E{3}}관련 인자 2) 경로의 활성화와 AhR(아릴 탄화수소 수용체) 의존 기전을 통해 일부 항산화 효소의 유전자 전사를 증가시킵니다[24,29]. 이와 같이, 우리는 버바스코사이드 처리된 세포에서 SOD1의 증가된 발현을 발견했습니다.
ROS 항상성은 세포 병리학에서 매우 관련이 있습니다. 항산화 효소의 부족으로 인해 증가된 ROS 생성을 중화할 수 없으며 단백질 미스폴딩을 촉진하는 ER 스트레스가 유도됩니다. ER 스트레스는 UPR의 활성화를 통해 인슐린 전사 및 번역의 감소로 이어진다[44,46]. 이 경로는 유전자 발현의 재프로그래밍을 통해 ER 기능을 회복하는 것이 주 목적이지만, 과도하게 자극되면 세포자멸사를 유발합니다. 우리의 데이터는 verbascoside의 중요한 작용이 UPR을 완화하여 세포자멸사를 일으키지 않고 ER 기능 장애를 복구하는 데 필요한 수정을 허용하는 것임을 시사합니다. 이러한 가능성에 따르면, 버바스코사이드 처리 세포에서 BIP, HSP70 및 PERK 단백질의 발현이 감소하였고, 튜니카마이신으로 유도된 ER 스트레스에 반응하여 PERK 경로의 활성화가 약화되었다. 인슐린종 NIT{6}} 세포주에서 티로솔에 대해서도 유사한 작용이 보고되었습니다[47].
특히 흥미로운 것은 UPR의 PERK 분지의 활성화를 조절하는 verbascoside의 능력입니다. α-세포에서 이 경로는 기저 분비 항상성과 α-세포 생존을 유지하는 데 필요하며 당뇨병에서는 심각하게 조절되지 않습니다[41,48]. 더욱 흥미롭게도 PERK의 일반적인 변이체는 당뇨병 전단계의 위험에 기여하고 EIF2AK3 유전자(PERK를 인코딩)의 열성 돌연변이는 신생아 인슐린 의존성 영구 당뇨병을 특징으로 하는 Wolcott-Rallison 증후군에 대한 감수성의 기초가 됩니다[49,50].
IKB -NFKB 염증 경로의 하향 조절은 또한 verbascoside의 존재하에 우리 시스템에서 감지되었습니다. NFKB는 α-세포의 주요 염증 경로를 나타내며, NFKB의 지속적인 활성화는 β-세포 사멸에 이르는 일련의 사건을 시작합니다. 스트레스를 받은 세포에서 NFKB 발현의 감소는 당뇨병 유발 인자로부터 췌장 세포를 보호하고[27,51], 당뇨병 예방에서 버바스코사이드 적용을 더욱 지원합니다. 흥미롭게도, PERK 신호전달은 전사 인자 NFR2(산화환원 항상성에 연루됨)와 NFKB를 활성화하여 버바스코사이드의 항산화 및 항염 효과를 설명합니다[40,52].
우리의 데이터는 또한 미토콘드리아 활동과 역학에 대한 버바스코사이드의 중요한 역할을 보여줍니다.
미토콘드리아 작동 품질의 지표는 미토콘드리아 수, 분포, 형태 및 막 전위를 조절하는 융합 및 핵분열 사건의 조정된 주기를 특징으로 하는 과정인 역학입니다[39]. 이러한 가능성에 따라, verbascoside는 기초 및 스트레스 조건 모두에서 tc3 미토콘드리아 막 전위를 향상시킵니다. 다시 말하지만, 카페인 산은 미토콘드리아 기능을 개선하지 않고 하이드록시티로솔은 세포 소기관 잠재력을 현저하게 감소시키기 때문에 그 효과는 대사 산물이 아니라 verbascoside 때문입니다. 증가된 미토콘드리아 역학과 형태의 변화는 미토콘드리아 운동을 추적함으로써 관찰되었으며, 따라서 버바스코사이드가 유사 분열 프로그램을 촉진함을 시사합니다. 세포 미토콘드리아 네트워크의 재형성은 호흡 사슬 초복합체의 조립에 영향을 미치므로 세포 대사뿐만 아니라 산화 환원 상태도 변경하고 세포가 산화 스트레스와 염증에 더 잘 대응할 수 있도록 합니다[5,37,39].
분자 메커니즘은 아직 알려져 있지 않지만, 우리는 다른 폴리페놀과 같이 verbascoside가 ROS 농도를 감소시켜 미토콘드리아 DNA를 보호하고[53], 미토콘드리아 투과성 전이 구멍[54]의 열림을 방지하여 생리학적 미토콘드리아 활성을 보장한다고 가정할 수 있습니다. 또 다른 흥미로운 가능성은 미토콘드리아 역학 및 활동의 수정이 UPR에 대한 버바스코사이드의 작용에 의해 다시 매개된다는 것입니다. 실제로, 미토콘드리아 분야의 최근 연구는 ER-미토콘드리아 상호작용 부위가 산화 스트레스에 대한 반응으로 미토콘드리아 역학 및 활성의 제어에 중요한 역할을 하고 PERK가 이 현상에 관여함을 나타냅니다[55]. 폴리페놀에 대한 대부분의 시험관 내 연구는 대사 및 ROS 생산 측면에서 원래 세포와 다른 종종 종양 기원의 세포주에서 수행되었습니다. 우리는 여기에서 verbascoside가 당뇨병 중재의 최종 목표인 Langerhans의 인간 고립 섬에도 보호 효과를 발휘한다는 증거를 제공합니다. 흥미롭게도 폴리페놀은 이미 기저 조건에서 PERK 신호 활성화를 완화하여 인슐린 함량을 증가시키고 산화 스트레스 매개 미토콘드리아 기능 장애를 예방합니다. 인슐린 함량에 대한 폴리페놀 효과가 다른 폴리페놀 화합물에 대해 나타난 바와 같이 세포 사멸을 예방하고 ER 스트레스를 완화하거나 인슐린 유전자 발현을 직접 제어하는 화합물의 능력을 반영하는지 여부는 아직 밝혀지지 않았습니다[56]. 이러한 데이터는 당뇨병 치료에서 보완 요법으로 버바스코사이드의 사용 가능성을 고려할 때 특히 관련이 있습니다.
5. 결론
클론 및 인간 세포에 대해 여기에 보고된 시험관 내 연구에 따르면 버바스코사이드는 ER 스트레스 관련 기능 장애에 대한 보호 효과를 발휘하여 UPR의 PERK 분지의 활성화를 완화하고 미토콘드리아 역학을 개선합니다. ER 항상성의 파괴가 -세포 손상 및 당뇨병을 유발함에 따라, 이러한 데이터는 질병 예방 및 치료에서 기능식품으로서 버바스코사이드의 가능한 사용에 대한 근거를 제공합니다. 그러나 버바스코사이드의 효과적인 임상 적용을 위해서는 많은 문제가 해결되어야 합니다. 풍부한 실험실 연구에도 불구하고 생체 내에서 버바스코사이드의 건강 효과를 확인하는 신뢰할 수 있는 임상 연구는 제한적입니다. 또한 향후 인체 건강에 이 화합물을 적용하려면 안정성과 생체 이용률을 높이는 것이 필수적입니다. 이 점에서, 버바스코사이드는 스캐폴드가 조합 화학에 의해 수정될 수 있는 다른 반응성 부위를 가지고 있기 때문에 흥미로운 분자입니다. 우리는 이러한 연구에서 얻은 정보가 천연 화합물을 사용하여 병리학적 상태에서 산화 스트레스 및 염증의 치료 조절을 위한 길을 열 것으로 기대합니다.
보충 자료: 다음은 http://www.mdpi.com/2227-9059/8/12/582/s1에서 온라인으로 제공됩니다. 그림 S1: α-세포 생존력에 대한 카페인산 및 히드록시티로솔의 효과. 그림 S2: 튜니카마이신 유도 ER 스트레스에 대한 버바스코사이드의 효과. 그림 S3: 미토콘드리아 막 전위에 대한 카페인산 및 히드록시티로솔의 영향. 그림 S4: 카페인산과 하이드록시티로솔로 처리된 세포에서 미토콘드리아의 정량적 이미지 분석. 비디오 S1, S2 비디오: 버바스코사이드의 부재(S1) 또는 존재(S2)에서 기저 조건에서 기록된 미토콘드리아 역학. 비디오 S3, S4: 버바스코사이드의 부재(S3) 또는 존재(S4)에서 산화 스트레스 조건에서 기록된 미토콘드리아 역학.
저자 기여: 개념화, AG, PM 및 CP; 데이터 큐레이션, AG 및 PM; 공식 분석, AG 및 PM; 자금 조달, CP; 조사, MC; 방법론, AM 및 SG; 자원, FB, RR 및 ADG; 감독, CP; 검증, AM, SG 및 MC; 시각화, AG 및 AM; 쓰기 - 원본 초안, AG; 쓰기 - 검토 및 편집, PM, AM, FB, RR, ADG, MC 및 CP 모든 저자는 원고의 출판된 버전을 읽고 동의했습니다.
자금: 이 연구는 외부 자금 지원을 받지 않았습니다.
감사의 말: 시약과 유용한 토론에 대해 Carlo Corino와 Mario Dell'Agli에게 감사드립니다.
이해 충돌: 저자는 이해 충돌을 선언하지 않습니다.
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