Part 1 쥐의 소 혈청 알부민 유발 간 섬유증에 대한 Cistanche Tubulosa의 페닐에탄올 배당체 예방 효과

연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com

추상적인

배경:시스탄체 튜불로사 면역 조절에 널리 사용되는 한약재입니다.cistanche의 페닐 에탄올 배당체이 식물의 (CPhGs)는 주로 효능이 있는 물질입니다. 이 연구의 목적은 쥐의 BSA 유발 간 섬유증 및 간 성상 세포와 관련된 관련 분자 메커니즘에 대한 CPhG의 예방 및 치료 효과를 평가하는 것이었습니다. 또 다른 중국 전통 약초인 비지아랑간(BJRG)을 양성 대조군으로 사용했습니다. 방법: 생체 내 실험에서 SD 쥐 75마리를 정상(증류수 처리), 모델(BSA 처리), 양성 약물(BSA 처리 + BJRG 6)의 6개 그룹으로 무작위로 나누었습니다.0{{29} } mg/kg/일) 및 BSA 처리 + CPhG(125, 250 및 500 mg/kg/일) 그룹. 간 및 비장 지수, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST), 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 헥사데센산(HA), 라미닌(LN), III형 프로콜라겐(PCIII), IV형 콜라겐(IV-C), 하이드록시프롤린( Hyp) 및 형질전환 성장 인자 1(TGF{13}})을 쥐의 간에서 측정했습니다. 간 섬유증에 대한 조직병리학적 등급은 H&E 및 Masson's trichrome 염색을 사용하여 각 그룹에 대해 평가되었습니다. TGF{14}}, 콜라겐 I(Col-I) 및 콜라겐 III(Col-III)의 발현은 면역조직화학염색법으로 측정하였다. 이러한 효과는 정량적 실시간 PCR 분석에 의해 NF-κB p65 및 Col-I의 발현 수준을 결정함으로써 시험관 내에서 추가로 평가되었습니다. Col-I 단백질 발현은 또한 웨스턴 블롯팅에 의해 조사되었다. 결과: CPhG의 모든 용량 그룹(125, 250 및 500 mg/kg/day)은 간 및 비장 지수를 유의하게 감소시켰고, ALT, AST, HA, LN, PCIII, IV-C 혈청 수준을 감소시켰습니다. TGF{26}} 콘텐츠(P < 0.01,="" p="">< 0.01="" 및="" p="">< 0.01)="" 및="" hyp="" 콘텐츠.="" cphg는="" 또한="" 간="" 세포의="" 부종을="" 현저하게="" 완화하고="" 간세포="" 괴사와="" 염증="" 세포="" 침윤을="" 효과적으로="" 예방했습니다.="" 면역조직화학적="" 결과는="" cphg가="" tgf{33}}(p="">< 0.01,="" p="">< 0.01,="" p="">< 0.01),="" col-i="" 및="" col-iii의="" 발현을="" 유의하게="" 감소시키는="" 것으로="" 나타났습니다.="" hsc-t6에="" 대한="" cphg(100,="" 75,="" 50="" 및="" 25="" ug/ml)의="" 시험관="" 내="" 효과는="" cphg가="" nf-κb="" p65="" 및="" col-i의="" mrna="" 발현을="" 유의하게="" 감소시켰고="" cphg도="" col-i="" 단백질="" 발현을="" 하향="" 조절함을="" 보여주었습니다.="" 결론:="" cphg는="" 상당한="" 항간섬유화="" 효과가="" 있으며="" 간섬유화="" 치료를="" 위한="" 간보호제로="" 사용될="" 수="">

키워드: 간 섬유증, 세뇨관, 페닐에탄올 배당체, 케모카인 BSA, 예방 및 치료.

배경

간 섬유증은 다양한 요인에 의해 유발되는 만성 간염의 발병기전에서 발생하는 심각한 간 손상에 대한 상처 치유 반응이다. 이러한 요인은 바이러스 감염, 알코올 남용, 담즙정체, 대사 및 자가면역 질환이다[1-3]. 세포외기질(ECM)의 점진적인 축적과 리모델링 감소는 간의 정상적인 구조를 방해하여 간 섬유증을 유발합니다[4]. 간 섬유증은 만성 간 질환에서 중요하며 종종 비가역적 간경변 및 발암으로 발전합니다. 현재까지 간섬유화증을 치료할 수 있는 방법이나 효과적인 약물은 없습니다. 따라서 간 손상이 섬유화 및 암으로 진행되는 것을 약화시키는 항간섬유화 약물의 발견이 시급하다.시스탄체 튜불로사W(Orobanchaceae과)는 중국 신장 남부 지역에서 널리 자라고 있는 기생 식물이다[5]. 사람들은 일반적으로 신장을 활성화하고, 혈액에 영양을 공급하고, 장을 이완하고, 노화를 지연시키는 데 사용합니다. 중국약전[6]에 공식 등재되어 있다. C. tubulosa에는 다양한 활성 성분이 포함되어 있습니다. 여기에는 다음이 포함됩니다.cistanche의 페닐 에탄올 배당체(CPhGs), 이리도이드 및 다당류. 많은 활성 구성 요소 중 하나로C. 튜불로사, CPhGs는 생체 내 및 시험관 내 연구 모두에서 확실한 항산화, 항피로, 신경 보호 및 항염증 효과를 나타냈습니다[7]. 최근 몇 년 동안 CPhGs(cistanche의 페닐 에탄올 배당체) 간 보호 효과가 있습니다. 이러한 효과의 근저에 있는 잠재적 기전은 자유 라디칼 소거, 간막 보호, 면역 조절, 세포자멸사 억제, HBsAg 및 HBeAg 발현 억제, HBV DNA 복제 억제 등이다[8-11]. 그러나 문헌에서 그래픽의 항간 섬유증 효과를 다룬 연구는 거의 없습니다. 따라서 본 연구에서는 쥐에서 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA) 유도 간섬유화 모델을 이용하여 GPhCs의 항간섬유화 효과를 조사하고자 하였다. 관련 분자 메커니즘은 HSC-T6 세포에서 조사되었습니다.

행동 양식

화학물질 및 시약

Hydroxyproline 키트(알칼리 가수분해)(Lot: 20140616)는 Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute(중국)에서 구입했습니다. Rat TGF{1}} 샌드위치 ELISA 키트(Lot: 238240615)는 Lianke Biotech Co., Ltd.(중국)에서 구입했습니다. Rabbit Anti-Collagen I 항체(Lot: 140619), Rabbit Anti-Collagen III 항체(Lot: 980788 W) 및 Rabbit Anti-TGF{8}} 항체(Lot: 140619)는 Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., LTD(중국). Zhongshan Golden Bridge Biotech Co., Ltd.(중국)에서 일반 양 혈청(작동액)(Lot: WP141214), PV{11}}(Lot: WK141225) 및 DAB 키트(Lot: K136621D)가 포함된 제품을 구입했습니다. . 1차 항체의 검출은 2. 항체 용액(Alk-Phos. Conjugated, Anti-rabbit) 및 2. Invitrogen Company(USA)에서 구입한 항체 용액(Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse)(lot: 272387)을 사용하여 수행하였다. ). 소 혈청 알부민(BSA)(Lot: SLBG8239V)은 Sigma(USA)에서 구입했습니다. 사용 전 BSA는 생리식염수에 18g/L로 준비하고 여과하여 세균을 제거하고 4도에서 보관하였다. 양털의 지질 1g을 함유하는 프로인트 불완전 애쥬번트(Lot: AF0220LA14, Shanghai yuan ye Bio-Technology Co., Ltd.(중국))를 2g의 유동 파라핀(Lot: 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.(중국), 증기 오토클레이브에서 멸균, 4도에서 보관. 양성 약물 BJRG는 Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd.(중국)로부터 Biejiarangan 정제로 입수했습니다. BJRG 약물 스톡은 용해시켜 제조했습니다. 600 mg/kg 농도의 증류수에 녹인 BJRG 정제.

식물 재료

C. 튜불로사(오로반치과과)는 중국 신장의 민펑(Minfeng) 지역에서 구입했습니다. 이 물질은 신장의 약재 연구소 위구르 의학의 핵심 연구소인 Jun Zhao 연구원에 의해 인증되었습니다. 상품권 견본은 신장의 물질 의학 연구소에 기탁되었습니다.

CPhG의 준비(cistanche의 페닐 에탄올 배당체)

말린 뿌리 줄기와 얇게 썬 뿌리 줄기C. 튜불로사(6.0 kg)을 70% 에탄올로 3회 연속 환류 추출하고 용매를 제거하여 에탄올 추출물을 얻었다. 에탄올 추출물을 AB-8 수지를 사용하여 정제하여 페닐 에탄올 배당체(CPhGs)를 얻었다. 동물 연구(각각 500mg/kg, 250mg/kg 및 125mg/kg)에서 다양한 용량 그룹에 사용된 CPhG의 스톡 용액은 0.5%(5g/L) 카르복시메틸 셀룰로오스(나트륨 염)에 용해되었습니다.

CPhG의 정량화(cistanche의 페닐 에탄올 배당체)

CPhGs의 두 성분(echinacoside 및 acteoside)의 함량은 이전에 보고된 방법을 사용하여 HPLC에 의해 결정되었습니다(Zhang et al. 2{13}}04)[12]. HPLC는 UV 검출기가 장착된 Shimadzu LC-10HPLC를 사용하여 수행되었습니다. HPLC 컬럼은 Phenomenex Gemini ODS 컬럼(250 × 4.6 mm, 5 μm)이었습니다. 등용매 이동상은 메탄올-아세토니트릴-1% 아세트산(15:10:75, v/v/v)으로 구성되었습니다. 용리는 40분 동안이었고 유속은 0.6mL/분으로 유지되었습니다. 컬럼 온도는 30도에서 일정하게 유지되었습니다. UV 검출은 334 nm에서 이루어졌다.

동물 및 HSC-T6 세포주

[등급 SPF] 건강한 성인 수컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐(180-220g)를 Xinjiang Medical University Animal Center, 라이선스 번호: SCXK(New) 2011-0004에서 구입했습니다. 쥐에게 SPF(specific-pathogen-free) 음식을 먹였습니다. 동물 실험과 관련된 모든 절차는 신장 의과대학 제1부속병원 동물윤리위원회의 승인을 받았습니다. 쥐는 통제된 환경 조건(25도 및 12시간 명암 주기)에서 우리에 수용되었으며 표준 쥐 펠릿 음식과 수돗물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 래트를 처리 전에 적응시켰다. 불멸화 랫트 간 성상 세포주, HSC-T6은 우한 프로셀 유전자 바이오테크놀로지(Wuhan Procell Gene Biotechnology Co., LTD)로부터 입수했다. (중국 우한). HSC-T6 세포를 10% 소태아혈청(Gibco, South America), 100IU/ml 페니실린 및 100ug/ml 스트렙토마이신(Beijing , 중국) 37도, 5% CO2의 가습 인큐베이터에서.

BSA 유발 간 손상 및 치료

75마리의 SD 쥐를 무작위로 6개 그룹으로 나누었습니다: 정상(증류수 처리), 모델(BSA 처리), 양성 약물(BSA 처리 + BJRG 600mg/kg/일), BSA 처리 + CPhG(cistanche의 페닐 에탄올 배당체)(125, 250, 5{{2{55}}}}0 mg/kg/일) 그룹. BSA 처리 + CPhG(125, 250, 5{24}} mg/kg/day) 그룹에는 각 그룹에 13마리의 쥐가 있었고 다른 그룹에는 각 그룹에 12마리의 쥐가 있었습니다. BSA에 의한 간 손상 모델은 1차 감작과 면역 공격으로 나뉜다[13]. 정상군을 제외한 나머지 군은 일차감작을 위해 1일, 15일, 22일, 29일, 36일에 0.5ml(9mg/ml)의 BSA Freund 불완전 보조제를 여러 차례 피하주사하였다. 다섯 번째 주사 후 7일 후, 쥐의 망막 정맥 신경총을 통해 혈액을 채취하여 혈청 알부민 항체에 대해 테스트했습니다. 쥐 혈청에서 BSA 항체는 이중 한천 확산 방법으로 검출되었습니다. 공격주사는 BSA 항체 양성 랫트에 꼬리정맥을 통해 생리식염수 0.4 ml를 주 2회 10회 투여하여 수행하였다. 농도 및 주사 횟수는 5.{28}}, 5.50, 6.{32}}, 6.50, 7.{38}}, 7.50, 8.50, 9.{42}}, 9.50 및 10.00이었습니다. 46일, 50일, 53일, 57일, 60일, 64일, 67일, 71일, 74일 및 78일에 g/L. 정상군에서는 면역학적 1차(감작), 2차(공격) 주사에 BSA 대신 생리식염수를 사용하였으며, 기타 조건은 모델군과 동일하였다. 정상군은 증류수 10ml/kg/day를 경구투여하였다. 모델 그룹에는 10ml/kg/day 0.5% CMC-Na 용액을 경구 투여했습니다. 양성 약물군은 600 mg/kg/day BJRG를 경구 투여하였다. BSA 처리와 CPhG(125,

250 및 500 mg/kg/day) 그룹에는 125, 250 및 500 mg/kg/day CPhG를 경구 투여했습니다.(cistanche의 페닐 에탄올 배당체), 각각. 매일 투여하는 래트는 마지막 주사 후 2주 동안 계속되었다. 실험 기간 후 랫트는 10% chloral hydrate를 투여하기 전에 12시간 동안 금식한 후 즉시 안락사시켰다. 각 랫트로부터 혈청 샘플을 채취하여 즉시 사용하였다. (1) Hyp 키트를 위한 액체 질소에서의 보존 및 (2) 조직학 및 면역 조직화학적 검사를 위한 10% 포름알데히드에 고정의 두 가지 목적을 위해 간을 수확했습니다. 동물 연구의 전체 기간은 93일이었습니다.

간 및 비장 지수

간 및 비장을 개복술로 절개하고 4도 생리 식염수로 세척하였다. 여과지로 과량의 물을 흡수한 후 간과 비장의 무게를 측정하여 해당 지수를 계산했습니다. 상대 장기 중량=장기 질량(g)/개체 체질량(g) × 100%[14].

세포 실험

HSC-T6 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅했습니다. 초기에, 세포는 48시간 동안 10% FBS를 함유하는 DMEM으로 배양되었습니다. 그런 다음 배지를 FBS가 없는 DMEM으로 교체하여 세포를 12시간 동안 굶기게 했습니다. 그런 다음 세포를 5.0ng/mL TGF- 1(FBS 제외)가 포함된 DMEM으로 24시간 동안 배양했습니다. 마지막으로 다양한 농도의 CPhG(cistanche의 페닐 에탄올 배당체)(100ug/ml, 50ug/ml, 25ug/ml), 악테오사이드(6ug/ml, 3ug/ml, 1.5ug/ml), 에키나코사이드(500ug/ml, 250ug/ml, 125ug/ml) 4중 웰의 플레이트에서 수행하고 48시간 동안 인큐베이션했습니다.

실시간 PCR 분석

NF-κB, p65 및 콜라겐 I의 mRNA 발현 수준은 실시간 PCR에 의해 결정되었다. HSC-T6 세포에서 mRNA 발현을 결정하기 위해 세포(4 × 105 세포)를 10% FBS가 포함된 3mL DMEM이 포함된 6웰 플레이트에 시딩하고 37도 및 5% CO2에서 밤새 배양한 후 세포 배양 배지 무혈청 DMEM으로 변경되었습니다. 다음으로 CPhGs(cistanche의 페닐 에탄올 배당체)(1{17}}0 ug/ml, 50 ug/ml, 25 ug/ml), 악테오사이드(6 ug/ml, 3 ug/ml, 1.5 ug/ml), 에키나코사이드(500 ug/ml) , 250 ug/ml 및 125 ug/ml)을 웰에 첨가하였다. CPhG 또는 단량체 조성물과 함께 48시간 동안 배양한 후, TRIzol 시약(Invitrogen, USA)을 사용하여 전체 RNA를 추출하고 15초 동안 클로로포름으로 격렬하게 교반했습니다. 실온에서 3분 동안 방치한 후, 용해물을 4도에서 12,{14}} × g에서 15분 동안 원심분리했습니다. 수상의 RNA를 이소프로판올로 침전시키고, 상부 수상을 새로운 미세원심분리관으로 옮겼다. 0.75% 에탄올을 첨가하여 RNA를 침전시킨 후, 마이크로원심분리 튜브를 사용하고 4도에서 12,{20}} x g에서 5분 이하로 원심분리했습니다. 상층액을 제거하고 RNA를 실온에서 5-10분 동안 건조시켰다. 쥐-액틴[GenBank: NM_031144.3], 콜라겐 I[GenBank: NM_ 053304.1] 및 NF의 증폭에 사용된 특정 프라이머 세트(Sangon, Shanghai, China) -κB p65 [GenBank: NM{32}}.2] 유전자는 Batch Primer 3을 사용하여 설계되었습니다. 정방향(fw) 및 역방향(rv) 프라이머는 다음과 같습니다. 콜라겐 I(fw: GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG , rv: GGG ACT TCT TGA GGT TGC CA), NF-κB p65(fw: CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG, rv: TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA), -액틴(fw: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT G, rv: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). 결과는 내부 대조군으로서 하우스키핑 유전자 -액틴의 mRNA에 대해 정규화되었고 상대 mRNA 수준으로 제시된다. 반응은 8 μL iQ SYBR Green Supermix, 1 μL 10 pM 프라이머 쌍, 8.5 μL 증류수 및 2.5 μL cDNA로 수행되었습니다. 각 중합효소연쇄반응은 95도에서 3분간 진행한 후 95도에서 10초, 55도에서 30초, 55도에서 10초 - 95도 확장의 40주기를 수행한 후 단일 형광 측정을 수행했습니다. . 최종 결과는 상대 값(2-ΔΔCt)으로 설명되었습니다. 계산 및 분석은 iQ5 Real-Time PCR Detection System으로 수행되었습니다.

웨스턴 블롯 분석

Collagen I(Abcam, Cambridge, UK, Art No: ab34710) 단백질 발현 수준은 하우스키핑 대조군으로 -actin(Lot: 60008-1-lg; Proteintech, China)을 사용하여 웨스턴 블로팅에 의해 결정되었습니다. 전체 세포 추출물은 1% Halt 프로테아제 억제제 칵테일(Thermo Scientific, USA) 및 1% Halt 포스파타제 억제제 칵테일(Thermo Scientific, USA)이 포함된 Radioimmunoprecipitation assay(RIPA)(Thermo Scientific, USA) 완충액을 사용하여 제조되었습니다. 단백질 농도는 Bradford 방법[18]에 의해 측정되고 정량화되었다. 단백질(10-50ug)을 10% SDS-PAGE 젤에서 분리하고 PVDF 멤브레인(Millipore, USA)으로 옮겼습니다. 막을 5% BSA로 실온에서 1시간 동안 차단하고 1차 항체(Anti-Colla gen I 항체, 1:200 희석액 또는 α-액틴의 마우스 mAb, 1:5000 희석액)를 4도에서 밤새 인큐베이션했습니다. 해당 Alk-Phos. 접합된 이차 항체를 실온에서 인큐베이션하였다. 마지막으로, 막을 0.1% Tween 20이 포함된 1 x Tris-HCl 염수로 3회 세척하고 신호를 스캔하고 GEL DOC XR Imaging System(Bio-Rad)으로 시각화했습니다. 농도계 분석을 관심 단백질에 대해 수행하고 GEL DOC Image Studio 소프트웨어(Bio-Rad)에 의해 α-액틴으로 정규화했습니다. -액틴은 내부 대조군으로 사용되었습니다.

통계 분석

정규성을 검증하기 위해 Shapiro-Wilk 정규성 검정과 Levene의 분산 동질성 검정을 적용하였으며 You et al. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 4/13페이지 분산의 동질성. 분산 분석(ANOVA)에 이어 Tukey의 사후 검정을 사용하여 비균질 정규 분포 데이터의 통계적 차이를 식별했습니다. Kruskal-Wallis 비모수 검정은 정규 분포가 아니거나 동질적이지 않은 데이터를 분석하는 데 사용되었습니다. 결과는 평균 ± SD로 표시되었습니다. 유의성은 P < 0.05로="" 설정되었습니다.="" 모든="" 데이터는="" spss="" 16.0="" 소프트웨어(xinjiang="" medical="" university)로="">

결과

CPhG의 정량적 측정

C. tubulosa의 CPhGs는 2개의 phenylethyl alcohol glycosides, echinacoside 및 acteoside를 함유하고 있으며, CPhGs의 함량은 HPLC 분석(그림 1)에 의해 42.71 ± 0.42% 및 14.27 ± {{7 }}.18%, 각각.

간 및 비장 지수

표 1에 나타난 바와 같이 모델군의 간 및 비장 지수는 유의하게 상승하였다[P < 0.01,="" p="">< 0.05].="" 다른="" 용량="" 그룹에서="" 양성="" 약물="" bjrg="" 및="" cphg의="" 간="" 및="" 비장="" 지수는="" 모델="" 그룹[pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0에" 비해="" 유의하게="" 감소했습니다.="" 004,="" pliver="0.005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024," pspleen="0.070]." 간="" 및="" 비장="" 지수는="" 모델="" 그룹보다="">

ALT, AST 활성 및 간 섬유증 마커에 대한 CPhG의 효과

본 연구에서 간효소 AST와 ALT의 혈청 수준은 BSA로 유도된 간 섬유증 쥐의 간세포 손상을 반영하여 모델 그룹에서 유의하게 증가했습니다. 그러나 실험.

BJRG(600 mg/kg) 및 CPhG(125, 250 및 5{{10}}0 mg/kg) AST [PAST < 0="" 유의미하게="" 감소했습니다.0{{60}}1,="" past="">< 0.001,="" past="">< 0.001,="" past="">< 0.001="" ,="" 각각]="" 및="" alt="" [palt="0.117," palt="0.139," palt="0.189," palt="0.255]" 수준="" 간="" 섬유증="" 쥐="" .="" (표="" 2).="" 모델="" 쥐에서="" ha,="" ln,="" pc="" 및="" iv-c의="" 수준은="" 유의하게="" 증가했습니다[각각="" pha="">< 0.001,="" pln="">< 0.001,="" ppciii="0.002," piv-c="">< 0.001].="" 모델군과="" 비교하여="" ha[각각="" pha="0.009," pha="0.007," pha="0.009," pha="0.023]" 수준,="" ln="" [pln="0.011," p="" ln="0.004," p="" ln="0.026," p="" ln="0.069," 각각],="" pc="" iii="" [p="" pciii="" {="" {47}}.006,="" ppciii="0.067," ppciii="0.136," ppciii="0.296]" 및="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0.001,="" p="" iv-c="">< 0.001,="" p="" iv-c="">< 0.001,="" p="" iv-c="">< 0.001]="" 랫트에서="" bjrg(600="" mg/kg)="" 및="" cphg에="" 의해="" 다른="" 용량="" 그룹(125,="" 250="" 및="" 500="" mg/kg)(표="" 3).="" hyp="" 함량="" 및="" tgf{73}}="" 콜라겐="" 함량은="" 간="" 조직에서="" hyp="" 수준을="" 측정하여="" 또한="" 검출되었습니다.="" 표="" 4와="" 같이="" 평균="">모델 그룹의 수준은 정상 그룹보다 유의하게 높았지만 BJRG 그룹과 다른 CPhGs 용량 그룹에서 현저히 감소했습니다. 쥐에서 모델 그룹의 TGF{{0}}의 간 농도가 유의하게 증가했습니다[P < 0.001].="" 모델="" 그룹과="" 비교하여="" 양성="" 약물="" 및="" 다양한="" cphg="" 용량="" 그룹의="" tgf-="" 1="" 수치가="" 현저히="" 감소했습니다[ptgf-="" 1="">< 0.001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" p="" tgf{10}}="">< 0.001,="" ptgf-="" 1="">< 0.001].="" 결과는="" 표="" 4에="" 요약되어="">

조직병리학적 검사

H&E 및 Masson's trichrome으로 염색된 정상 간 조직 섹션의 관찰은 뚜렷한 간 소엽과 간 정현파를 나타냅니다. 모델 쥐의 간 조직 구조는 무질서했고, 간 조직과 간 정현파는 많은 양의 결합 조직으로 대체되었습니다. 그러나, 모델 그룹보다 처리 그룹에서 더 많은 정상 세포 구조와 더 적은 결합 조직이 검출되었습니다.

H&E 염색

정상군에서는 간문맥 부위의 이상과 간동굴곡선이 없는 간소엽의 구조적 완전성이 관찰되었다. 간줄은 중심이 둥글고 투명하며 질서정연하게 배열되어 있습니다. 핵은 세포질과 함께 세포의 중앙에 위치합니다. 문맥 영역에만 소량의 섬유 조직이 있습니다(그림 2a). 모델 그룹에서는 소엽 구조가 심하게 손상되었습니다. 간 세포는 경미한 수분 변성, 대부분 풍선 변성 및/또는 지방 변성을 보였다. 염증 세포 침윤의 형성, 광범위한 섬유 조직 증식, 많은 수의 섬유 중격 형성, 분열 소엽 및 상당한 간 세포 증식도 관찰되었습니다. 이러한 관찰은 간 섬유증의 쥐 면역 손상 동물 모델 확립의 성공을 확인시켜주었다(그림 2b). 모델 그룹과 비교하여 다른 CPhG에서 염증 세포 침윤이 감소했습니다. 또한 간 세포의 괴사 및 지방 변성이 감소하고 섬유증이 완화되는 것으로 관찰되었습니다. CPhGs는 쥐에서 BSA로 유발된 간 섬유증의 병리를 상당히 완화시키고 간 세포의 부종을 완화하며 간세포 괴사와 염증 세포 침윤을 효과적으로 방지하여 CPhG가 BSA로 인한 쥐 간 섬유증에 보호 효과를 발휘함을 시사합니다. (그림 2c-f). Masson's trichrome 염색 정상군에서 간조직은 정상이었다. 간문맥 부위는 적은 수의 청색 콜라겐 섬유를 보였고 간 조직은 정상적으로 구조화되어 있었다(Fig. 3a). 정상군의 간조직과 비교하여 섬유조직이 중심엽에 의해 증식되어 간실질로 확장되었다. 콜라겐 섬유가 확장되고 연결되어

전체 소엽을 감싸고 중심 정맥을 둘러싸고 있습니다. 간세포 섬유증, 소엽 구조적 손상, 문맥 주변 섬유증 및 가소엽 형성과 함께 이러한 효과는 모델이 확립되었다는 증거를 제공했습니다. 모델 그룹과 비교하여 양성 약물 대조군의 콜라겐 섬유는 말초 문맥 영역에서 바깥쪽으로 약간 확장되었습니다(그림 3c). 모델 그룹과 비교하여 다른 CPhGs 투여 그룹에서 콜라겐 섬유가 유의하게 감소하고 섬유 증식이 억제되었으며 간 실질 내 섬유 조직의 증식이 유의하게 감소했습니다. 이러한 결과는 CPhG가 BSA 유발 간 섬유증으로부터 쥐를 보호한다는 것을 시사했습니다(그림 3d-f).

면역조직화학염색

중요하게, 콜라겐 유형 I 및 콜라겐 유형 III의 발현은 간 섬유증의 발달에 필수적인 역할을 하며, 이들의 생성 및 간 조직에서의 침착은 항간 섬유증 효능의 중요한 결정인자 역할을 할 수 있다. 결과는 표 5에 요약되어 있습니다.

콜라겐 유형 I

정상군은 주로 혈관과 문맥 부위에서 I형 콜라겐을 발현하였다. 모델 그룹은 문맥 영역에서 콜라겐 유형 I 혈관 섬유증을 고도로 발현했습니다. Disse의 공간에서, 콜라겐 타입 I 염색은 줄무늬 또는 고르지 않은 분포로 관찰되었다. 콜라겐이 섬유질 격막을 감싸 유사소엽을 형성합니다. 이 실험에서 BJRJ(600mg/kg) 및 CPhGs(125, 250 및 500mg/kg)의 다양한 용량 그룹에 대해 더 적은 수의 섬유질 격막이 형성되었습니다[PCol I=0.002, PCol I {{ 6}}.001, PCol I=0.023 및 P Col I=0.044]. 반정량적 결과는 I형 콜라겐의 발현이 모델군에 비해 유의하게 낮은 것으로 나타났다(Fig. 4).

콜라겐 유형 III

Collagen type III은 정상군에서 약하게 발현되었고, 문맥과 간정맥 주변의 주변부는 연속적인 섬유질 대신 미세한 황색을 소량 나타냈다(Fig. 5a). 모델 그룹에서 콜라겐 섬유는 넓고 두꺼운 코드를 나타내어 주로 문맥 및 섬유 조직 영역에 위치하여 강한 발현을 나타냅니다(그림 5b). BJRJ의 콜라겐 섬유(600mg/kg)와 CPhG의 다른 용량 그룹(125, 250, 500mg/kg)은 사상체였으며 중심 정맥과 문맥 주위에 분포했습니다. 모델 그룹과 비교하여 콜라겐 섬유가 크게 감소하고 염색이 창백하고 가늘며 면역 조직 화학적 염색이 약하게 양성이었습니다 (그림 5c-f). 이러한 반정량적 결과는 양성 및 다른 용량 그룹에서 양성으로 발현된 세포가 [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PCol III=0.010 및 P Col III=0.037, 각각]은 모델군과 달랐다.

TGF{0}}

TGIF{0}}는 정상 쥐의 간세포에서 거의 발현되지 않았습니다. 발현은 소수의 간질 세포로 제한되었습니다(그림 6a). 모델 그룹에서 TGF- 1 발현은 문맥, 섬유성 공간, 간 성상 세포, 염증 세포, 정현파벽 및 세포질에 널리 분포하였다. 특정 포털 영역은 갈색-노란색 염색과 함께 강한 양성 발현을 나타냈다(그림 6b). BJRJ(600 mg/kg) 및 CPhG의 다른 용량 그룹(125, 250 및 500 mg/kg)의 문맥 및 섬유성 격막에서 소량의 발현이 있었습니다. 이 그룹의 양성 염색 정도는 모델 그룹에 비해 유의하게 감소했습니다. 섬유질 격막의 간질 세포와 염증 세포의 세포질 염색이 감소했습니다(그림 6c-f). 반정량적 결과에 따르면 BJRJ와 CPhG의 다른 용량 그룹 [PTGF{11}}.001, P TGF{13}} < 0.001,="" p="" tgf{16}}.009,="" ptgf{18}}="" 각각="" .004]로="" 모델군에="" 비해="" 유의한="" 차이를="" 보였다.="" 이="" 기사의="" 앞부분에서="" 언급했듯이="" tgf{20}}는="" 간의="" 병태생리학에서="" 중요한="">

섬유증, 세포외 기질 생성 자극 [19]. 우리는 TGF{1}} 수준이 간 섬유증의 중증도와 일치하는 방식으로 모델 그룹에서 증가함을 보여주었습니다. 간에서 TGF- 1의 발현 수준은 혈청 TGF{3}} 수준과 일치했습니다. 이는 CPhG가 ECM의 합성 및 분해에 참여함으로써 TGF{4}} 발현으로 인한 간 섬유화를 유의하게 감소시킬 수 있음을 나타냅니다. 콜라겐 I형, III형 콜라겐 및 TGF- 1의 발현은 간 섬유증의 병리학적 과정을 감지할 수 있습니다. 치료 그룹에서 이들의 발현 수준은 유의하게 감소되었고 CPhG가 콜라게나제 활성을 개선하여 간 ECM 합성 및 분해의 동적 평형을 유지하여 간 섬유증의 형성을 지연 및 예방할 수 있음을 설명했습니다.