파트 3: Drosophila Kenyon 세포의 마그네슘 유출은 정상 및 식이 강화 장기 기억에 중요합니다
Mar 17, 2022
자세한 정보:ali.ma@wecistanche.com
UEX가 신경 생리학에서보다 지속적인 역할을한다는 것을 시사하는 성인 파리로 제한되었습니다. 대조적으로, abs 또는 a{0}}b0 뉴런에서 uex 표현식을 중단해도 LTM이 손상되지 않았습니다. a{3}} b{9}} 뉴런의 활동은 학습 후 식욕을 돋우는 LTM을 통합하는 데 필요하지만(Krashes 및 Waddell, 2{10}}08), abc 및 abs KC 출력은 함께 개별적으로 다음과 같습니다. 표현에 필요합니다(Krashes and Waddell, 2008; Perisse et al., 2013). 따라서 abs 및 a0b0 뉴런에서 uex 기능 상실이 있는 파리에서 정상적인 LTM 성능을 관찰하는 것은 uex를 조작할 때 ab 뉴런 기능의 일반적인 결핍에 반대합니다.
식이 Mg2 플러스는 구성적으로 uex 돌연변이이거나 ab KC 제한 uex 기능 상실을 지닌 파리의 결함 있는 LTM 성능을 향상시킬 수 없었습니다. 그러나 uex 돌연변이 파리의 ab KC에서 uex를 발현하면 Mg2 plus의 능력이 회복되어 성능이 향상되었습니다. 따라서 ab KC는 Mg2+-enhanced에 대한 세포 유전자좌입니다.메모리즉석에서.
UEX 방향의 마그네슘 유출이 KC에서 필요하다는 것은 직관적이지 않은 것 같습니다.메모리-식이 Mg2 플러스가 KC [Mg2 플러스 ]i를 상승시킬 때 Mg2 플러스 섭식의 강화 효과. 이 단계에서 우리는 이것이 왜 그런지 추측할 수 있을 뿐입니다. 우리는 특히 뇌와 ab KC가 식이 보충제로 인한 세포 내 및 세포 외 Mg2의 더 높은 수준에 균형 잡힌 방식으로 적응해야 한다고 가정합니다. 야생형 및 uex 돌연변이 뇌에서 KC [Mg2 plus ]i의 라이브 이미징은 UEX 유도 유출이 이러한 상승된 수준의 활성 및 아마도 자극 유발, 항상성 유지에 필수적인 요소일 가능성이 있음을 시사합니다.
많은 포유동물 세포 유형은 b-아드레날린성 자극에 노출된 후 몇 분 후에 cAMP 의존 방식으로 Mg2 플러스를 내보냅니다(Romani and Scarpa, 2000; Vormann and Gu¨nther, 1987; Jakob et al., 1989; Romani와 Scarpa, 1990b; Romani와 Scarpa, 1990a; Vormann과 Gu¨nther, 1987; Gu¨nther et al., 1990; Howarth et al., 1994). CNBH 도메인의 존재는 UEX 및 CNNM이 cAMP에 의해 직접 조절될 수 있음을 시사합니다. 우리는 UEX CNBH에서 cAMP 결합을 차단해야 하는 R622K 아미노산 치환을 도입하여 CNBH의 중요성을 테스트했습니다. 이 미묘한 돌연변이는 uex 돌연변이 파리에 대한 LTM 성능을 복원하는 uexR622K 이식유전자의 능력을 폐지했습니다. 또한 CRISPR을 사용하여 기본 uex 궤적에서 CNBH를 돌연변이시켰습니다. CNNM4에서 CNBH를 삭제하면 Mg2와 유출 활성이 제거되었지만(Chen et al., 2018), uexT626NRR 병변에 대해 동형접합성인 파리가 생존할 수 있었으며, 이는 충분한 수준의 UEX 기능을 유지함을 보여줍니다. 그러나 이 파리들은 손상된 즉각적 및 장기적메모리. 또한 uexT626NRR 파리의 성능은 Mg2와 섭식으로 향상될 수 없습니다. 이 데이터는 손상되지 않은 CNBH가메모리- 관련 UEX 기능. CNNM4 CNBH에 대한 클라트린 어댑터 단백질의 결합은 기저외측 표적화와 관련이 있으며(Hirata et al., 2014), 이는 UEXT626NRR이 KC에 부적절하게 국한될 수 있음을 시사합니다. 또한, 잔류 기능을 유지하는 CNNM2 E122K 돌연변이 변이체의 KC 발현
그러나 인신매매 결함이 있고(Arjona et al., 2014) uex LTM 결함을 복원하지 않았습니다.
CNNM2/3 CNBH 도메인이 고리형 뉴클레오티드에 결합하는지 여부에 대해 의문을 제기했지만(Chen et al., 2018), 우리는 FSK가 uex 돌연변이에 민감한 ab KC [Mg2 plus ]i의 증가를 유발하고 UEX가 다음과 같은 것을 발견했습니다. :HA는 결함 돌연변이 파리를 학습하는 rut2080 아데닐산 사이클라제(Han et al., 1992) 및 dnc1 포스포디에스테라제(Dudai et al., 1976)에서 잘못 국재화되었습니다. UEX::HA 라벨은 야생형 파리에서 g, abc 및 abs KC에 고르게 분포된 반면, UEX::HA 라벨은 g 및 abs KC에서 감소되었고 rut2080 및 dnc1 돌연변이체의 abc 뉴런에서 더 강했습니다. 따라서 돌연변이체에서 cAMP의 만성적 조작은 아마도 CNBH와 상호작용함으로써 UEX 국소화에 영향을 미치는 cAMP와 일치합니다. 또한 변경된 UEX 현지화는메모리rut2080 및 dnc1 파리의 결함.
포유류 세포 배양에서 마그네슘 그린을 사용하고 ab KC에서 유전적으로 인코딩된 MagIC 리포터를 사용하는 생리학적 데이터는 비행 UEX가 Mg2 플러스 유출을 촉진한다는 것을 보여줍니다. FSK로 파리 뇌를 자극하면 야생형 대조군보다 uex 돌연변이 뇌에서 ab KC [Mg2 plus ]i가 더 크게 증가하여 UEX가 초파리 KC에서 [Mg2 plus ]i의 증가를 제한한다는 첫 번째 증거를 제공합니다. 우리의 MagIC 기록은 또한 UEX에 의존하는 ab KC [Mg2 plus ]i의 느린 진동(0.015Hz 중심, 약 1분에 한 번)을 보여주었습니다. 세포의 항상성 시스템 수준 특성을 반영할 가능성이 있지만 이 [Mg2 plus ]i 변동의 생리적 기능을 아직 이해하지 못합니다. 생화학적 진동 활동은 세포 생리학의 여러 측면에서 중요한 역할을 합니다(Nova'k and Tyson, 2008). 가장 주목할만한 것은 [Mg2 plus ]i의 24시간 주기 변동이 Mg2 + 민감한 mTOR(라파마이신의 기계적 표적) 경로를 통한 시계 제어 번역과 동적 세포 에너지 대사를 연결한다는 것입니다(Feney et al., 2016). 따라서 느린 Mg2 + 진동이 cAMP, UEX, 에너지 플럭스(Plac¸ais et al., 2017) 및 LTM 관련 시냅스 가소성의 기반이 되는 mTOR 종속 번역의 역할을 통합할 수 있습니다(Casadio et al., 1999 ; Huber et al., 2000; Beaumont et al., 2001; Hou and Klann, 2004; Hoeffer et al., 2008).
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실험 모델 및 주제 세부 정보
파리 균주
달리 명시되지 않는 한, 파리는 60% 습도 및 25˚C에서 12시간 명암 주기로 표준 옥수수 가루 식품으로 키웠습니다. GAL80ts 실험을 위한 시험 파리와 대조군 파리는 18˚C에서 사육되었습니다. 1~{7}}일령의 혼합 성파리를 실험에 사용했습니다.
Canton-S는 야생형 균주였습니다. 이 연구에 사용된 GAL4 드라이버 라인은 c739-GAL4(McGuire et al., 2001), c305a-GAL4(Krashes et al., 2007), NP{10}}GAL4(Tanaka et al., 2004), 0770-GAL4(Gohl et al., 2011), MB{16}}GAL4(Zars et al., 2000), nSyb-GAL4(Bloomington Drosophila Stock Centre, BDSC 51635), elav-GAL4 (BDSC, 8765) 및 uex-GAL4(Kvon et al., 2014); 비엔나 초파리 리소스 센터, VDRC, VT{28}}GAL4). 스톡 센터에서 얻은 UAS 라인은 UAS-CD8::GFP(BDSC, 5136), UAS-NmdarRNAi(BDSC, 25941) 및 UAS-uexRNAi(BDSC, 36116)입니다. 다양한 돌연변이 및 트랜스제닉 계통, uexMI01943(Venken et al., 2011; BDSC, 32805), uexNC1(BDSC, 7167), rut2080(Han et al., 1992) 및 dnc1(Dudai et al.)이 설명되어 있습니다. , tubP-GAL80ts(McGuire et al., 2003) 및 PhsILMiT(BDSC, 24613). uexMI01943.ex1 및 uexMI01943.ex2 미노스 절단선은 Arc et al., 1997에 설명된 절차를 사용하여 생성되었습니다. 자세한 짝짓기 체계는 그림 2-그림 보충 2A에 나와 있습니다. 노란색 몸 색깔 표현형을 나타내는 개별 파리에서 잠재적인 절제 라인이 설정되었습니다. 이러한 6개의 라인에서 게놈 DNA를 추출하고 uexMI01943 MiMIC에 인접하는 DNA를 PCR로 증폭하고 시퀀싱했습니다. uexMI01943.ex1 및 uexMI01943.ex2 라인은 야생형 게놈 서열을 복원하여 정확한 절제를 보유하는 것으로 확인되었습니다. PCR 및 시퀀싱 프라이머 시퀀스에 대한 리소스 표를 참조하십시오. uexMI01943 MiMIC 삽입 및 절제의 시퀀스 세부 도식은 그림 2(그림 보충 2B)에 나와 있습니다. UAS-uex 형질전환 파리를 구성하기 위해 전장 uex 코딩 서열(CDS)을 RT-PCR로 클로닝했습니다. TRIZOL(Thermo Fisher, 15596018)을 사용하여 야생형 파리에서 총 RNA를 분리하고 SuperScript III 첫 번째 가닥 합성 시스템(Invitrogen, 18080400)을 사용하여 cDNA로 역전사했습니다. 이 총 cDNA 믹스는 uex CDS를 증폭하기 위한 템플릿으로 사용되었습니다. 프라이머 서열은 리소스 표를 참조하십시오. PCR 산물은 SacII 및 XhoI로 분해된 다음 pUAST의 상보적 부위에 결찰되었습니다(Brand and Perrimon, 1993). pUAST 클로닝된 uex CDS는 야생형 uex cDNA 판독 프레임의 2505 bp를 나타내는 것으로 완전히 시퀀싱되고 확인되었습니다(참고, 4개의 가능한 uex mRNA 이소폼, FlyBase 릴리스 6 모두 동일한 834개 아미노산 단백질을 인코딩함). UAS-uex 형질전환 파리는 pUAST-uex 벡터로 형질전환시켜 상업적으로 생성하였다(Bestgene). 우리는 10개의 독립적인 형질전환 계통의 UAS-uex 염색체 삽입을 매핑하고 세 번째 염색체에 삽입물이 있는 UAS-uex3M, UAS-uex5M 및 UAS-uex8M으로 표시된 3개 계통을 행동 테스트했습니다. UAS-uex3M 파리는 연구 전반에 걸쳐 사용되었으며 원고에서 UAS-uex로 언급되었습니다.
UAS-uexR622K 형질전환 파리는 UAS-uex 파리와 유사하게 생성되었습니다. 미스센스 돌연변이가 CNBH 도메인 내 UEX의 코돈 622에 도입되어 단백질 키나제 A의 조절 소단위의 cAMP 결합 도메인에서 이전에 조작된 것을 모방했습니다(Bubis et al., 1988). 돌연변이는 Arg를 인코딩하는 CGT 코돈을 Lys를 인코딩하는 AAA로 변경합니다. 돌연변이는 'Gibson Assembly Master Mix를 사용하여 부위 지정 돌연변이 유발을 위한 개선된 방법'(NEB 애플리케이션 노트)에 설명된 대로 Gibson Assembly Master Mix(New England Biolabs, E2621S)를 사용하여 야생형 uex CDS에 도입되었습니다. 사용된 프라이머 세트는 리소스 표에 자세히 설명되어 있습니다. Gibson 어셈블리의 생성물을 PCR에 의해 추가로 증폭하고 생성된 생성물을 pUAST 벡터에 클로닝하고 시퀀싱하였다. 이식유전자 삽입은 UAS-uex에 대해 매핑되었고 세 번째 염색체에 매핑된 두 삽입 중 하나는 행동 실험에 사용되었습니다.
UAS-CNNM2, UAS-CNNM2E122K, UAS-CNNM2E357K, UAS-CNNM2S269W 및 UAS-CNNM2T568I 형질전환 파리주는 HA(mCNNM2: HA), Arjona et al., 2014에 설명되어 있습니다. CNNM2의 야생형 또는 돌연변이 버전은 pCiNEO_IRES{22}}GFP 플라스미드의 원래 mCNNM2::HA 클론에서 증폭되었습니다(Arjona et al., 2014). 입문서는 리소스 표에 자세히 설명되어 있습니다. PCR 산물은 XhoI 및 XbaI로 분해되고 pUAST의 상보적 부위에 결찰되었습니다. 세 번째 염색체에 대한 각 구성의 삽입은 위에서 설명한 대로 매핑에 의해 식별되었고 행동 실험에 사용되었습니다. 연구에 사용된 모든 CNNM2 인코딩 구성은 HA 태그가 지정되지만 간결함을 위해 표기법이 생략되는 경우가 많습니다.
UAS-MagFRET-1 형질전환 파리 계통은 MagFRET-1 CDS를 포함하는 pJFRC-MUH 구성으로 형질전환하여 생성되었으며, 이는 Lindenburg et al. , 2013. 프라이머는 리소스 표에 자세히 설명되어 있습니다. PCR 산물은 XhoI 및 XbaI로 분해되었고 pJFRC-MUH의 상보적 부위에 결찰되었습니다. 구조물의 삽입은 부위 특이적 형질전환 시스템에 의해 매개되었고 착륙 부위는 attP2(세 번째 염색체에 있음)입니다.
UAS-MagIC 및 UAS-MARIO 형질전환 파리 계통은 T. Nagai가 친절하게 제공한 MagIC/pcDNA3 및 MARIO/pcDNA3 플라스미드에서 서브클로닝된 MagIC/MARIO CDS를 포함하는 pTW 구성물로 형질전환하여 생성되었습니다. (Maeshima et al., 2018 및 Koldenkova et al., 2015). MagIC/MARIO CDS는 각각 MARIO/pcDNA3 및 MagIC/pcDNA3에서 먼저 PCR 증폭되었고 pENTR/D-TOPO 벡터에 클로닝되었습니다. 입문서는 리소스 표에 자세히 설명되어 있습니다. MARIO 센스 프라이머는 MARIO의 삽입 부위에서 pcDNA3의 서열과 겹치도록 설계되었습니다. MagIC/MARIO CDS는 게이트웨이 대상 벡터 pTW(Drosophila Gateway Vector Collection)에 추가로 클로닝되었습니다.
CRISPR/Cas9 편집된 uexD 유전자좌는 GenetiVision에 의해 상업적으로 생성되었습니다. 편집 방식은 그림 2에 나와 있습니다. 그림 보충 2C. uex 유전자좌는 위치 3,900,285와 3,949,425(FlyBase, 릴리스 6) 사이의 49,141bp 영역에 걸쳐 있는 염색체 2R에서 역방향으로 위치합니다. 다음 설명은 uex 궤적 내의 이러한 좌표와 관련됩니다. uexD를 생성하기 위해 2개의 gRNA 플라스미드와 1개의 이중 가닥 DNA 공여자(dsDNA) 플라스미드를 구성하고 nos-Cas9 배아(BDSC, 54591)에 주입했습니다. 그림 2 - 그림 보충 2C에 표시되고 리소스 표에 자세히 설명되어 있는 것처럼 업스트림 gRNA1은 Exon 6에 있고 표적 서열 30,930.30,952입니다. 해당 다운스트림 gRNA2는 33,988에서 34,010 사이의 Exon 7과 Exon 8 사이에 있습니다. 두 gRNA 모두 pCFD{32}}dU63gRNA에 개별적으로 클로닝되었습니다(Addgene, 49410). gRNA1의 절단 부위는 30,946에서 30,947 사이여야 하고 gRNA2는 33,993에서 33,994 사이의 절단으로 이어져야 합니다. 795 bp 업스트림 상동성 암(30,152.30,946) 및 977 bp 다운스트림 상동성 암(33,994.34,970)을 공여자 DNA 플라스미드에 클로닝했습니다. 종결 코돈(STOP, 3개의 판독 프레임 모두에서)을 2개의 상동성 암 사이에 삽입한 다음 3xP3 프로모터에 의해 구동되는 GFP 카세트를 삽입했습니다. 기증자 DNA 백본은 GenetiVision에 의해 설계되었으며 uexD 계통에 대한 완전한 기증자 서열은 요청 시 제공됩니다. 파리 눈에서 GFP의 발현으로 성공적인 편집이 확인되었고 게놈 PCR 및 시퀀싱으로 확인되었습니다. uexD 파리에서 30,947에서 33,993 사이의 3047 bp 단편이 기증자 플라스미드의 두 상동성 암(주로 STOP 신호 및 GFP 카세트) 사이의 서열로 대체되었습니다. uexD 대립유전자는 uex ORF를 자릅니다. 게놈 PCR 검증에 사용되는 프라이머는 리소스 표에 자세히 설명되어 있습니다. nos-Cas9 이식유전자(X 염색체에 있음)는 교차에 의해 제거되었습니다.
CRISPR/Cas{0}}편집된 uex::HA 파리는 Kate O'Connor-Giles 연구소에서 개발한 ScarlessDsRed 시스템을 사용하여 WellGenetics에서 생성했습니다(미공개, Addgene에 기증된 원본 플라스미드, #80822). 6XHA 태그는 UEX 유전자좌의 네이티브 STOP 코돈 바로 앞에 6XHA 코딩 서열을 삽입하여 UEX의 카르복시 말단에 프레임 내에서 융합되었습니다(그림 3 - 그림 보충 1A). 이 프로세스에는 두 가지 주요 단계가 포함되었습니다. 1단계에서 DsRed 카세트를 포함하는 pBAC 트랜스포존과 함께 6XHA 태그를 uex의 STOP 코돈이 있는 프레임에 삽입하고 1gRNA를 사용하는 상동성 지정 복구(HDR)에 의한 CRISPR/Cas 매개 게놈 편집을 사용하고 하나의 dsDNA 플라스미드 기증자. gRNA는 uex STOP 코돈에서 50bp 떨어져 있으며 48,587에서 48,588 사이의 절단을 지시해야 합니다. gRNA를 pCFD{19}}dU63gRNA 플라스미드에 클로닝했습니다. 1,200bp 업스트림 암(47,438.48,637) 및 1,033bp 다운스트림 암(48,641.49,673)을 pUC{33}Kan(2579bp) 백본이 있는 공여자 DNA 플라스미드에 클로닝했습니다. gRNA 및 프라이머 서열은 리소스 표를 참조하십시오. HDR을 촉진하기 위해 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 돌연변이(TCC에서 TCG로, 48,581.48,583)가 기증자에 도입되었습니다. 6XHA 태그에 이어 3XP3 프로모터 구동 DsRed 카세트를 포함하는 pBAC 트랜스포존을 두 상동성 암 사이에 삽입했습니다. pBAC 인식 모티프 TTAA는 6XHA의 STOP 코돈에 내장되어 있습니다. 완전한 기증자 순서는 요청 시 제공됩니다. 기증자와 gRNA 플라스미드를 nos-Cas9 배아(NIG-FLY, CAS0002)에 주입했습니다. 성공적인 편집은 파리 눈에서 DsRed의 발현에 의해 확인되었고 게놈 PCR 및 시퀀싱에 의해 확인되었습니다. 6개의 독립적인 양성 라인이 확인되었고 4개가 PCR 검증을 통과했습니다. 이 4개 라인 중 하나는 시퀀싱 검증을 더 통과했으며 그림 3(그림 보충 1A)에 표시된 중간 라인입니다. 이 라인에서 4개의 isogenized 및 균형 잡힌 주식이 설정되었습니다. 2단계에서, DsRed 선택 마커는 도우미 라인 Tub-PBac(BDSC, 8285)를 사용한 PiggyBac(PBac) 전위에 의해 절단되었습니다. 성공적으로 절제된 5개의 동형 접합 생존 라인이 게놈 PCR 및 시퀀싱에 의해 검증되었습니다. 하나의 지정된 uex::HA가 원고의 실험에 사용되었습니다.
CRISPR/Cas{{0}}편집된 uexT626NRR 파리를 구성하기 위해 우리는 gRNA를 설계 및 복제하고 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ssODN)를 설계 및 주문(Sigma)했습니다. gRNA 및 ssODN 시퀀스는 리소스 표에 자세히 설명되어 있습니다. UEX CNBH 도메인에서 단일 아미노산 치환 R622K를 만들 계획이므로 120bp ssODN 기증자는 코돈 R622를 중심으로 하고 코돈 변경 CGT를 R622K에 해당하는 AAA(31,179.31,181)로 전달합니다. gRNA의 예상 절단 부위(31,192에서 31,193 사이)는 예상 돌연변이 지점에서 불과 11bp 떨어져 있습니다. ssODN을 기증자로 사용하여 보고된 낮은 HDR 가능성을 높이기 위해 상업적으로(GenetiVision) 편집 재료를 250개의 lig4 KO vasa-Cas 배아에 주입했습니다(Zimmer et al., 2016). 우리는 주입된 배아에서 37개의 생존 가능한 G0 파리를 얻었다. 총 224마리의 G1 파리를 단일 파리 게놈 PCR 및 시퀀싱하여 예상 돌연변이를 스크리닝했습니다. 리소스 표에 자세히 설명되어 있는 입문서. 우리는 1차 심사에서 59개의 추정 편집 라인을 확인했으며 이 중 12개가 확인되었습니다. lig4 KO vasa-Cas9를 사용했음에도 불구하고 HDR 매개 점 돌연변이 대신 NHEJ(비상동 말단 연결) 이벤트만 감지했습니다. 편집된 12개 라인 중 6개는 동형 접합체로 치명적이었고 나머지 6개는 생존 가능했습니다. 4개의 동형 접합체에서 31,192와 31,193 사이에 ATCTTC의 6bp 프레임 내 삽입과 함께 위치 31,192에서 G가 T로 대체됨을 발견했습니다. 이 NHEJ 편집은 T626에 해당합니다! UEX의 단백질 서열의 NRR 변화(그림 5A). X 염색체 vasa-Cas9는 교차에 의해 이들 라인에서 제거되었고 uexT626NRR이라고 하는 하나의 라인이 원고의 행동 실험에서 사용되었습니다.
방법 세부 정보
행동 실험
행동 T-미로 실험을 위해 1~{2}}일 된 혼성 파리를 사용했습니다. 냄새는 ~1:103으로 희석된 4-메틸시클로헥산올(MCH) 및 3-옥탄올(OCT)이었습니다(구체적으로는 8ml 광유 중 9ml MCH 또는 7ml OCT). 모든 실험은 23˚C 및 55-65% 상대 습도에서 수행되었습니다.
식욕을 돋우는 즉시 및 나중에메모리실험은 본질적으로 설명된 대로 수행되었습니다(Krashes and Waddell, 2008; Perisse et al., 2013). 100~120마리의 파리 배치를 21~23시간 동안 굶주린 후 ~2ml 1% 한천(수원으로)과 2cm 4cm 여과지를 포함하는 35ml 기아 바이알에서 훈련했습니다. 훈련용 설탕 종이(5cm 7.5cm)는 4ml의 2M 자당에 담그고 밤새 건조하여 준비했습니다. 같은 크기의 물종이를 물에 담가 밤새 방치하였다. 식욕 훈련을 위해 기아 튜브에서 마른 '물'종이와 함께 파리를 훈련 튜브로 옮기고 즉시 T-미로의 훈련 팔에 부착하고 CS 냄새에 2 분 동안 노출시킨 다음 30 초 동안 깨끗한 공기. 그런 다음 파리를 건조 설탕 종이가 있는 다른 훈련 튜브로 옮기고 T-미로에 부착하고 CS 플러스 냄새에 2분 동안 노출시켰습니다. 즉각적인메모리파리를 T-선택 지점으로 이동시키고 2분 동안 두 냄새 스트림 중에서 선택하도록 하여 테스트되었습니다. 24시간 분석하기 위해메모리, 파리를 훈련 튜브에서 제거하고 1시간 동안 표준 옥수수 가루 식품 바이알로 옮긴 다음 테스트할 때까지 23시간 동안 기아 바이알로 다시 옮겼습니다. 성능 지수는 CS 더하기 부분의 파리 수에서 CS 부분의 수를 뺀 값을 총 파리 수로 나눈 값으로 계산되었습니다. MCH와 OCT는 CS plus 또는 CS로 교대로 사용되었으며 단일 샘플 또는 n은 상호 훈련된 두 그룹의 평균 성능 지수를 나타냅니다.
Mg2와 섭식 후 행동 테스트의 경우, 위에서 설명한 대로 1~{2}}일 된 초파리를 Mg2와 보충 식품이 든 바이알에 보관한 후 식욕을 돋우는 훈련과 테스트를 위해 굶어 죽게 했습니다. 8{15}}mM [Mg2 plus ] 식품을 만들기 위해 40ml의 1M MgCl2 용액을 460ml의 일반 유동식 플라이 푸드에 첨가했습니다. 1mM [Mg2 plus ] 식품은 0.5ml 1M MgCl2를 39.5ml MilliQ 물에 희석하고 460ml 액체 식품에 첨가하여 만들었습니다. 음식을 분취하고 냉각하여 응고시켰다. MgSO4 및 CaCl2 보충 식품도 같은 방법으로 준비했습니다.
즉시 및 24시간 혐오메모리실험은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다(Hirano et al., 2013; Perisse et al., 2016; Tully and Quinn, 1985). 100-120마리의 파리 그룹은 1주기의 혐오 훈련 또는 15분 간격 훈련(간격 훈련)으로 5주기로 훈련되었습니다. 즉시 혐오메모리, 파리는 1주기 훈련 후에 테스트되었습니다. 평균 24시간메모리두 가지 다른 프로토콜을 사용하여 테스트되었습니다. 단식 촉진 프로토콜에서 파리는 1주기 훈련 전에 16시간 동안 굶었습니다(Hirano et al., 2013). 간격 훈련을 위해 파리는 훈련 전에 굶어 죽지 않았습니다. 파리는 금식 촉진 및 간격 훈련 후 24시간 동안 정상적인 파리 음식을 먹였으며,메모리성능. 각 혐오 훈련 주기 동안, 파리는 5초 간격으로 12번의 90V 전기 충격과 짝을 이루는 첫 번째 냄새(CS plus)에 1분 동안 노출되었습니다. 깨끗한 공기를 45초 동안 유지한 후 충격 없이 1분 동안 두 번째 냄새(CS)가 나타났습니다. 성능 지수는 CS 부문의 파리 수에서 CS 플러스의 파리 수를 뺀 값으로 계산되었습니다.
팔을 파리의 총 수로 나눈 값입니다. MCH와 OCT는 CS plus 또는 CS로 교대로 사용되었으며 단일 샘플 또는 n은 상호 훈련된 두 그룹의 평균 성능 지수를 나타냅니다.
감각 시력 테스트(그림 2 - 소스 데이터 1)는 수정된 대로(Keene et al., 2004; Keene et al., 2006; Schwaerzel et al., 2003) 설명된 대로 수행되었습니다. 후각 능력을 테스트하기 위해 훈련되지 않은 파리에게 2분 동안 컨디셔닝에 사용된 희석된 냄새와 T 미로에서 미네랄 오일을 통해 기포가 생기는 것 중에서 선택했습니다. 회피 지수는 공기 부분의 파리 수에서 냄새 부분의 수를 뺀 값을 총 파리 수로 나눈 값으로 계산되었습니다. 감전회피도 유사하게 수행하여 계산하였다. 훈련되지 않은 파리는 전기 그리드가 포함된 두 개의 튜브 사이에서 1분 동안 선택했지만 전원에는 하나만 연결되었습니다. 회피 지수는 전기가 통하지 않은 팔의 파리 수에서 전기 팔의 파리 수를 뺀 값을 총 파리 수로 나누어 계산했습니다. 당도를 평가하기 위해 굶주린 파리에게 건조 설탕 종이가 들어 있는 T-미로의 팔과 건조된 '물' 여과지를 포함하는 다른 팔 중에서 선택하도록 2분의 시간이 주어졌습니다. 두 논문 모두 에피타이저에서와 같이 준비되었습니다.메모리분석. 선호 지수는 설탕 부문의 파리 수에서 다른 부문의 파리 수를 빼서 총 파리 수로 나눈 값으로 계산되었습니다. 우리는 행동실에 불을 켜고 시험관을 통과하는 공기 흐름이 야생형 파리의 선호도 지수를 크게 향상시켰고 따라서 모든 설탕 선호도 테스트에 이러한 조건을 적용한다는 것을 발견했습니다.
항-UEX 항체 및 웨스턴 블롯
다클론 UEX 항체는 Eurogentec에 의해 상업적으로 개발되었습니다. 2개의 펩타이드가 항원으로 합성되었습니다: 펩타이드 1 H-CLPKLDDKFESKQSKP-OH(16aa) 및 펩타이드 2 H-CVDNRTK TRRNRYKKA-NH2(16aa) 및 토끼에게 주입되었습니다. 펩티드 2만이 강력한 면역 반응을 유도하고 추가 처리되었습니다. 최종 혈청을 펩티드 2에 대해 정제하고 1:2000 희석액으로 웨스턴 블롯 분석에 사용했습니다.
웨스턴 블롯의 각 샘플에 대해 30ml 2-머캅토에탄올(Bio-Rad), 270ml 4 Laemmli 샘플 완충액(BioRad) 및 900ml Nuclease Free Water(Invitrogen). 그런 다음 샘플을 100˚C 열 블록에서 3분 동안 끓이고 로딩 전에 10분 동안 원심분리했습니다. 4개의 헤드에 해당하는 샘플 부피를 각 SDS-PAGE 겔 레인에 로드했습니다. 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮기고 35rpm으로 교반하면서 25˚C에서 1시간 동안 5% 탈지유에서 차단했습니다. 그런 다음 멤브레인을 35rpm으로 교반하면서 4°C에서 밤새 항-UEX 용액(5% 탈지유 중 1:2000 토끼 항-UEX)에서 인큐베이션했습니다. 막을 빠르게 3회 세척한 후 TBST 용액(TBS 10 용액 100ml, BioRad, MilliQ 물 900ml에 희석, 0.1% Tween 20 포함)에서 3 10분 세척한 다음 HRP-접합체와 함께 인큐베이션했습니다. 2차 항체 용액(5% 탈지유에 염소 항토끼 1:5000)을 35rpm으로 교반하면서 25˚C에서 1-2시간 동안 혼합합니다. 막을 다시 빠르게 3회 세척한 후 TBST에서 3 10분 세척했습니다. 단백질 밴드는 Pierce ECL 웨스턴 블로팅 기질(Life Technologies, 32134)을 사용하여 시각화되었습니다. 그런 다음 멤브레인을 Millipore ReBlot Plus Mild 용액(Merck, 2502)을 사용하여 벗겨내고, 5% 탈지유에서 다시 차단하고, 마우스 항-튜불린 1차 항체(1:2000, Sigma, T6199) 및 상응하는 HRP 접합 염소 항- 위에 설명된 프로토콜에 따라 마우스 이차 항체(1:5000).
면역염색
면역염색은 설명된 대로 수행되었습니다(Wu 및 Luo, 2006). 1-에서 5-일령 성충 파리까지의 뇌를 PBS에서 해부하고 실온에서 4% 파라포름알데히드가 포함된 PBS에서 2{54}}분 동안 고정했습니다. 그런 다음 00.5% PBT(497.5ml PBS 중 2.5ml Triton-X1{56}}0)에서 두 번 짧게 세척하고 20분 동안 세 번 세척했습니다. 그런 다음 뇌는 5% 정상 염소 혈청을 포함하는 PBT에서 실온에서 30분 동안 차단된 다음 1 또는 2일 동안 4°C에서 약한 회전(35rpm)으로 1차 및 2차 항체와 함께 배양되었습니다. 1차 항체는 토끼 항-GFP(1:250; Invitrogen A11122) 및 토끼 항-HA(1:250, NEB 3724T)였습니다. Alexa 488 결합 염소 항토끼(1:250; Invitrogen, A11034)는 이차 항체였습니다. 2차 항체 인큐베이션 전후에 뇌를 0.5% PBT로 20분 세척한 후 2번의 빠른 세척을 실시했습니다. 염색된 뇌를 Vectashield(Vector Labs H1000)의 유리 슬라이드에 장착하고 40배율에서 Leica TCS SP5 공초점 현미경을 사용하여 이미지화했습니다(HCX PL APO 40, 1.3 CS 오일 침지 대물렌즈, Leica). 이미지 스택은 1mm 단계의 1024 1024 해상도로 수집되었으며 피지를 사용하여 처리되었습니다(Schindelin et al., 2012). 그림 3G 및 H의 정량화를 위해 지구본의 경우 약 40 25mm의 직사각형 ROI 또는 ab, a'b' 및 EB의 경우 직경이 15mm인 원형 ROI를 단일 섹션에 수동으로 그렸습니다. 파리 뇌의 z 스택 스캔. 해당 ROI는 배경 제어 영역으로 SMP(superior medial protocerebrum)에 그려졌고 평균 형광은 ImageJ를 사용하여 계산되었습니다. MB 로브 및 EB의 ROI 강도는 각 SMP 강도의 ROI 강도로 정규화되었습니다. 단일 데이터 포인트에 대해 좌뇌와 우뇌 사이의 평균이 사용되었습니다. 그림 7C 및 D의 정량화를 위해 ROI가 그림에 표시되고 ROI 강도가 그림 3H의 결과와 유사하게 계산되었습니다. 그림 7C에서 로브 끝의 가장 넓은 부분을 통해 선이 그려졌습니다. 이 라인의 강도 프로파일은 ImageJ를 통해 얻었습니다. 각 라인 프로파일에 대해 약 15mm 선에 걸쳐 있는 이러한 프로파일의 중간에 있는 30개의 데이터 포인트가 추출되었습니다. 프로파일을 처음 5개 데이터 포인트(F0)의 평균값으로 추가 정규화하고 (F F0)/F0로 계산했습니다. 다른 뇌에서 이러한 정규화된 프로필의 평균 값이 플롯되었습니다(그림 7C, 중간 패널). 뇌의 좌우 프로파일을 계산하여 별도로 표시합니다. 그림 7D에서 서로 다른 영역을 나타내는 서로 다른 ROI의 상대 강도가 함께 추가되어 MB에 대한 총 강도 측정값을 생성합니다.
세포 배양에서 Mg2와 유출을 조사하는 데 사용되는 인간 CNNM4 cDNA 발현 구성은 이전에 설명한 것과 같습니다(Yamazaki et al., 2013). 초파리 uex를 발현하는 구조는 uex CDS의 STOP 코돈 앞에 FLAG 태그를 삽입하여 생성되었습니다. HEK293 세포에서의 발현을 위해 FLAG 태그가 지정된 CNNM4 및 uex cDNA를 이후에 pCMV 태그{5}}A(Agilent)에 삽입했습니다. HEK293 세포는 10% FBS(Fetal Bovine Serum) 및 항생제가 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(Nissui)에서 배양되었습니다. 발현 플라스미드를 Lipofectamine 2000(Invitrogen)으로 형질감염시켰다.
면역염색을 위해 세포를 PBS 중 3.7% 포름알데히드로 20분 동안 고정한 다음 PBS 중 0.2% Triton X-100로 5분 동안 실온에서 세포를 투과화했습니다. 다음으로 3% FBS 및 10% 소 혈청 알부민(차단 완충액)을 함유하는 PBS로 실온에서 1시간 동안 차단했습니다. 그런 다음 세포를 차단 완충액에 희석된 토끼 항-FLAG 항체(F7425, Sigma-Aldrich)와 함께 4°C에서 밤새 배양하고 PBS로 3회 세척하고 Alexa 488-접합된 항- 차단 완충액에 희석된 토끼 IgG(Invitrogen) 및 로다민-팔로이딘(F-액틴 시각화용, Invitrogen). PBS로 3회 세척한 후 커버슬립을 슬라이드에 장착하고 공초점 현미경(FluoView FV1000; Olympus)으로 이미지화했습니다.
마그네슘 그린을 사용한 Mg2+-이미징은 설명된 대로(Yamazaki et al., 2{32}}13) 약간 수정하여 수행되었습니다. 발현된 단백질로 잠재적으로 감소하는 [Mg2 plus ]i를 피하기 위해, 형질감염된 HEK293 세포를 영상화될 때까지 40mM MgCl2가 보충된 성장 배지에서 배양하였다. 그런 다음 세포를 2mM Magnesium Green-AM을 포함한 Mg2+로딩 완충액(78.1mM NaCl, 5.4mM KCl, 1.8mM CaCl2, 40mM MgCl2, 5.5mM 포도당 및 5.5mM HEPES-KOH[pH 7.4])과 함께 인큐베이션했습니다. (Invitrogen), 37˚C에서 30분 동안. 그런 다음 세포를 로딩 버퍼로 한 번 헹구고 ORCA-Flash 4.0 CMOS 카메라(Hamamatsu) 및 SHI{33}}L 수은 램프(Olympus)가 장착된 Olympus IX81 현미경으로 관찰했습니다. 형광은 Metamorph 소프트웨어(Molecular Devices)의 제어 하에 20초마다(470–490 nm에서 여기 및 505–545 nm에서 방출) 측정되었습니다. 그런 다음 버퍼를 Mg2 + 유리 버퍼로 변경했습니다(로딩 버퍼의 MgCl2는 60mM NaCl로 대체됨). 데이터는 선 플롯(10개 셀의 평균)으로 표시됩니다. 영상화 후, 세포를 3.7% 포름알데히드를 함유하는 PBS로 고정하고 면역형광 현미경을 통해 단백질 발현을 확인하였다.
고정 파리 뇌에서 FRET 기반 Mg2 + 농도 측정
유전자형 c739를 가진 1-2일 된 파리; UAS-MagFRET-1는 수집되기 전에 4일 동안 1mM 또는 8{12}}mM [Mg2 plus ] 식품과 함께 바이알에 보관되었습니다. 파리 뇌를 PBS에서 해부하고 실온에서 4% 파라포름알데히드가 포함된 PBS에서 2{24}}분 동안 고정했습니다. 그런 다음 0.5% PBT(497.5ml PBS 중 2.5ml Triton-X100)에서 두 번 짧게 세척하고 10분 동안 세 번 세척했습니다. 그런 다음 뇌를 Vectashield(Vector Labs H1000)의 유리 슬라이드에 장착하고 40, 0.8 NA 수침 대물렌즈가 있는 광시야 Scientifica Slicescope와 Andor Solis 소프트웨어(v4.27)가 설치된 Andor Zyla sCMOS 카메라를 사용하여 이미지화했습니다. Mg2 플러스 ab 뉴런의 농도를 나타내는 FRET 비율을 얻기 위해 3Hz에서 512 512 픽셀 및 16비트를 사용하여 세룰리안 채널과 황수정 채널 사이에서 시계열을 교대로 획득했습니다. 두 채널의 여기 파장은 436nm이고, 청록색의 방출 필터는 460-500nm이고 황수정의 방출 필터는 520-550nm입니다. 시리즈 획득은 청록색 채널에서 시작하여 5초 동안 지속된 다음 황수정 채널로 전환되고 또 다른 5초 동안 지속되며 이 주기가 두 번 더 반복됩니다. 따라서 각 뇌에 대해 총 30초(90프레임)의 이미지 스택이 획득되었습니다. 이미지 스택은 이후 ImageJ 및 맞춤형 Matlab 스크립트를 사용하여 분석되었습니다. 간단히 말해서, 사각형 ROI(그림 1E, 왼쪽 패널)는 ab 로브(각 반구에 대해 로브에 하나, b 로브에 하나)에 수동으로 그리고 배경 제어로 ab 로브 외부(각 반구에 대해 하나씩)를 그렸습니다. 세룰리안 채널의 형광 강도는 각 수직 또는 수평 로브 ROI를 배경 ROI로 나누어 계산하고 각 로브에 대한 두 반구 사이의 평균을 내고 각 주기에 대해 15프레임에 대해 평균을 냈습니다. 황수정 채널에서 유사하게 얻은 것입니다. FRET 비율은 그림 1E(오른쪽 패널)에서 하나의 데이터 포인트로 묘사된 3개의 획득 주기 사이에서 추가로 평균화된 위의 강도에서 얻었습니다.
외식편 파리 뇌에서 공초점 Mg2 플러스 이미징
c{0}}GAL4 구동 UAS-MagIC를 발현하는 이식 뇌를 35mm 유리 바닥 마이크로웰 접시(부품 번호 P35G{6}}.5–14 C, MatTek Corporation)의 세포외 아래에 배치했습니다. 식염수 완충 용액(103mM NaCl, 3mM KCl, 5mM N-Tris, 10mM 트레할로스, 10mM 포도당, 7mM 자당, 26mM NaHCO3, 1mM NaH2PO4, 1.5mM CaCl2, 4mM MgCl2, 삼투압 농도 275mO pH 7.3]) 무칼슘 완충액에서 해부한 후(Barnstedt et al., 2016). Mg2 플러스 UAS-MagIC의 감도 및 EDTA, EGTA 및 CaCl2와 같은 다른 화학물질에 대한 UAS-MagIC의 반응을 결정하기 위해(그림 8B), 뇌를 20 mg/ml 디지토닌과 함께 식염수 완충 용액에서 배양했습니다. 이미징 6분 전(Koldenkova et al., 2015). Forskolin(FSK) 적용에 대한 반응에서 Mg2 플러스 변동을 조사하기 위해(그림 8C–I), 뇌를 디지토닌 또는 인큐베이션 없이 식염수 완충액에 넣었습니다. 두 상황에서 식염수는 뇌가 잠기는 완충액(디지토닌 유무에 관계없이)을 나타냅니다.
ZEN 2011 소프트웨어를 사용하여 공기 대물렌즈가 20개인 LSM78{9}} 공초점 현미경(Zeiss)에서 이미징을 수행했습니다. MagIC의 금성 부분은 488nm 레이저로 여기되었고 그 방출은 520-560nm 범위에서 수집되었습니다. mCherry는 561nm 레이저로 여기되었고 그 방출은 600-640nm 범위에서 수집되었습니다. 시계열은 0.5Hz에서 512 512 픽셀 및 16비트로 수집되었습니다. 기준선 Venus/mCherry 측정의 60초 후, 2-20ml의 식염수 또는 기타 관련 화학 용액을 마이크로피펫을 통해 일정한 이미지 캡처와 함께 접시에 추가했습니다. Venus/mCherry 방출에 적용된 약제의 효과는 15-20분 동안 기록되었습니다.
이미지 스택은 이후 ImageJ 및 사용자 정의 작성된 Python 스크립트를 사용하여 분석되었습니다. 간단히 말해서, 직사각형 ROI는 ab 뉴런(각 반구에 대해 하나씩, 그림 8A)에 수동으로 그리고 동일한 크기의 다른 ROI는 배경 제어로 MB 외부에 있지만 중간에 그려졌습니다. Venus(또는 mCherry) 채널의 형광 강도는 각각 꽃받침 ROI에서 배경 ROI를 빼서 계산하고 두 반구 사이의 평균을 구했습니다. 이것을 'Rel. 도 8D 및 E의 강도(au)'. 금성과 mCherry 강도 사이의 비율은 도 8B 및 C 및 도 8F 및 G에서 'MagIC 비율'로 계산되었습니다. 도 8H의 경우 두 채널에 대한 강도가 별도로 계산되었습니다. 이 경우 'Rel. 강도(DF/F0)'는 기준 기간 F0의 평균 강도로 정규화된 상대 형광 강도를 나타내며, (FF0)/F{{9}로 계산됩니다. }. Welch의 평균 주기도 방법(Bendat et al., 2000)을 채택한 파이썬 함수 psd(matplotlib.pyplot에서)를 통해 Venus의 상대 강도 DF/F{10}}를 사용하여 PSD(그림 8I)를 계산했습니다.
역전사 및 정량 실시간 PCR
각 샘플에 대해 120마리의 파리를 액체 질소에서 동결하고 머리를 TRIzol 시약(Invitrogen)에서 완전히 균질화했습니다. 총 RNA는 제조업체의 지침에 따라 Direct-zol RNA MiniPrep(R2050) 키트를 사용하여 추출되었습니다. cDNA는 SuperScript III First-Strand 합성 시스템(Invitrogen)을 사용하여 합성되었습니다. 각각 다른 처리 또는 유전자형에 대해 5개의 독립적인 샘플을 준비했습니다. SYBR Green I Master Mix(Roche)를 사용하여 LightCycler 480 Instrument(Roche)에서 각 cDNA 샘플에 대해 정량적 PCR을 3회 수행했습니다. 증폭 후 용융 곡선을 분석하고 앰플리콘을 아가로스 겔 전기영동으로 시각화하여 프라이머 특이성을 확인했습니다. 상대 전사 수준은 2-DDCt 방법(Livak and Schmittgen, 2001)에 의해 계산되었으며, 3개의 참조 유전자(Gapdh, Tbp 및 Ef1a 100E)의 Ct 값의 기하 평균이 정규화에 사용되었습니다. 입문서는 리소스 표에 자세히 설명되어 있습니다.
역 PCR
역 PCR을 사용하여 uexMI01943 파리에서 MiMIC 삽입 위치를 매핑했습니다. 게놈 DNA는 15마리의 성체 파리에서 준비되었습니다. 그런 다음 두 마리의 파리에 해당하는 DNA를 Mbo I을 사용한 25ml 제한 반응으로 분해하고 10ml의 생성물을 밤새 4°C에서 결찰하여 단편을 원형화했습니다. 5 ml의 결찰 생성물을 역 PCR에 사용하였다. PCR 산물은 시퀀싱 전에 Exo/SAP 반응(Thermo Fisher, 78201)을 사용하여 정제되었습니다. 서열은 BLAST에 의해 D. melanogaster 게놈(FlyBase, 릴리스 6)과 비교되었고 FlyBase에서 보고된 uexMI01943 삽입과 일치하는 2R의 영역 3,882,886.3,882,641에 균일하게 일치되었습니다. 입문서는 리소스 표에 자세히 설명되어 있습니다.
단백질 도메인 예측 및 정렬
Geneious R10.2.2를 사용하여 단백질 서열 정렬을 수행했습니다. 단백질 도메인 예측은 InterPro(Finn et al., 2017; Jones et al., 2014) 및 Phyre2(Kelley et al., 2015)로 수행되었습니다. 단백질 도메인 및 구조 정렬은 TM-align을 사용하여 수행되었습니다(Zhang and Skolnick, 2005). 단백질 구조 시각화는 키메라 1.11.2에서 렌더링되었습니다(Pettersen et al., 2004).
정량화 및 통계 분석
행동 데이터는 Excel 및 Prism 6을 사용하여 분석되었습니다. 이미징 데이터는 ImageJ 및 맞춤형 MATLAB 또는 Python 스크립트를 사용하여 분석되었습니다. 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정은 두 그룹을 비교하는 데 사용되었으며 일원 ANOVA와 뒤이은 Tukey의 사후 검정은 여러 그룹을 비교하는 데 사용되었습니다. 통계적 유의성의 임계값은 p로 설정되었습니다.<>
감사의 말
뮤린 CNNM2 클론과 원고에 대한 의견에 대해 FJ Arjona와 JGJ Hoenderop에게 감사드립니다. MagIC 및 MARIO의 클론에 대해 T Nagai에게 감사하고 파리에 대한 Bloomington Stock Center 및 VDRC에 감사합니다. 기술 지원에 대해 P Cognigni, Y Huang, R Brain, R Szoke-Kovacs 및 M Goodwin에게 감사를 표하고 Waddell 그룹의 다른 구성원에게 토론을 제공합니다. 이 작업에 대한 지원과 지원에 대해 N Halidi, C Monico 및 Micron Advanced Bioimaging Unit(Wellcome Strategic Awards 091911/B/10/Z 및 107457/Z/15/Z에서 지원)을 인정합니다. EM은 EMBO 장기 펠로우십(ALTF 184-2109)에서 자금을 지원했습니다. KDJ는 Rhodes Trust의 지원을 인정합니다. SW는 Wellcom Principal Research Fellowship(200846/Z/16/Z)과 ERC Advanced Grant(789274)의 지원을 받았습니다.
