PartⅡ: Cistanche Salsa에서 새로운 Phenylpropanoid로 치환된 Diglycosides의 복제 유도 분리 및 대식세포에서 NO 생산에 대한 억제 활성

연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com

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아글리콘 하위 구조인 3-메틸부테닐기는 H-2와 H{2}}a 및 H{3}}b의 COSY 상관 관계 및 H{{ 4}} 및 H-5 및 올레핀 탄소, kC 120.7(C{8}}) ​​및 136.4(C{11}}). 2개의 당 모이어티는 MS 단편 패턴과 함께 산 가수분해물의 NMR 스펙트럼 분석 및 HPLC 스펙트럼 분석에 의해 확립되었습니다. 이들의 절대 구성은 산 가수분해물의 HPLC 분석을 통해 D-glucose와 L-rhamnose로 결정되었다[17]. 이러한 당 모이어티는 아노머 양성자의 커플링 상수에 의해 α-글루코오스 및 α-람노오스로 정의되었습니다. 1H{18}}H COSY 스펙트럼은 H{19}}에서 H{20}}로, H{21}}에서 H{22}}로 순차적인 상관관계를 보여주었습니다(그림 4).

kH 4.70(H-43)에서 하향 이동된 글루코스 양성자는 글루코스 상의 아실-치환기를 시사하였다. HMBC 스펙트럼에서 H-43와 C-9333 사이의 상관관계는 caffeoyl 치환기의 위치를 ​​확인시켜줍니다. H-13와 C{7}}(kC 64.5) 사이의 HMBC 상관관계와 H-33(kH 3.68)와 C{13}}(kC 101.2) 사이의 HMBC 상관관계는 각 치환기의 위치를 ​​제안했습니다. . 따라서 6의 구조는 3-methylbutenyl-O- -L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D- 글루코스-피라노사이드 및 시스탄살사이드 B로 명명.

갈색 무정형 분말인 Cistansalside C(12)는 ( plus )-HR-ESI-QTOF-MS에 의해 분자식이 C26H38O13인 것으로 측정되었으며, 이는 m/z 581.2213 [M plus Na] plus (calcd . C26H38O13Na의 경우, 581.2205). m/z 163에서의 특징적인 이온은 구조에 caffeoyl 치환기가 존재함을 시사한다. m/z 325와 m/z 471에서 조각 이온은 람노오스 단위와 포도당 단위의 존재를 시사한다.

12의 NMR 스펙트럼과 6의 NMR 스펙트럼을 비교하면 아글리콘 구조를 제외하고는 유사함을 알 수 있었다. 12의 NMR 스펙트럼에서 kC 12에서 2개의 올레핀 탄소 대신 kC 38.{4}}(C-2) 및 24.4(C-3)에서 2개의 파라핀 탄소가 관찰되었습니다{{16 }}.7(C-2) 및 136.4(C-3)는 6의 아글리콘에서 나타났습니다. 12의 아글리콘에서 발아 메틸기(kH 0.88)는 상향장 6의 아글리콘에서 H-4 및 H{20}}(kH 1.71 및 1.63)에 대한 상대적입니다(표 2). 12의 aglycone은 3-methyl butyl 그룹으로 제안되었으며, 이는 1H 및 COSY NMR 스펙트럼에 의해 확인되었다. 3-메틸 부틸기의 피크는 3.81(1H, m, H{34}}a), 3.48(1H, m, H{38}}b), 1.71(1H, m)에서 관찰되었습니다. , H-3), 1.44(2H, m, H{46}}) 및 0.88(H-4, 5).

두 개의 당 부분은 산 가수분해물의 HPLC 분석과 NMR 스펙트럼 분석 및 MS 단편 패턴에 의해 재확인되었습니다. 산 가수분해물의 HPLC 분석을 이용하여 당의 절대 구성을 D-glucose와 L-rhamnose로 확인하였다[17]. A-glucose 부분과 a-rhamnose 부분은 anomeric proton의 짝지음 상수에 의해 확인되었다. 1H-1H COSY 스펙트럼은 H-13에서 H-53, H-133에서 H{10}}, H{{11} }에서 H{12}}(그림 4).

치환기의 위치는 HMBC 분석을 통해 확인하였다. HMBC 스펙트럼에서 H-13와 C{1}}(kC 67.2), H-33(kH 3.68)와 C-133(kC 101.2) 사이의 상관관계 H{10}}(kH 4.70) 및 C{13}}(kC 165.7)가 감지되었습니다. 결과적으로, 12의 구조는 3-methyl butyl-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D-glucose-pyranoside 및 시스탄살사이드 C.

무정형 갈색 분말인 Cistansalside D(17)는 포지티브 모드 고해상도 ESI-QTOF-MS에 의해 분자식이 C31H38O14인 것으로 확인되었으며, 이는 m/z 657.2147 [M plus Na] 플러스에서 부가 이온 피크를 나타냈습니다. (C31H38O14Na에 대한 계산, 657.2154). m/z 147에서 [M plus H x Aglycone x Rha x Acetyl Glc] 플러스 이온, m/z 351에서 [M plus H x Aglycone x Rha] 플러스 이온 및 [M plus H x Aglycone]을 포함한 단편 이온 m/z 497에서 플러스 이온도 검출되었습니다. m/z 147에서의 특징적인 이온은 그 구조에 쿠마로일 치환기가 존재함을 시사한다. m/z 351과 m/z 497에서 조각 이온은 람노오스 단위와 아세틸 치환된 포도당 단위의 존재를 시사한다.

시스탄살사이드에서시스탄체 허브

13C-NMR 스펙트럼은 31개의 탄소 원자의 존재를 나타내었다. 1H 및 HSQC 스펙트럼에서 kH 4.61(1H, m, H{6}}) 및 4.60(1H, s, H{{1{58}}}})에서 두 개의 아노머 양성자가 관찰되었습니다. . 1H-NMR 스펙트럼은 1.97(3H, s, acetyl-CH3)에서 메틸기의 존재를 나타내고 kH 7.55(1H, d, J{23}}.9 Hz, H{{ 25}}) 및 6.34(1H, d, J= 15.9 Hz, H{31}}) 및 kH 7.53에서 2개의 파라-치환된 벤젠 고리(2H, d, J= 6). 9Hz, H-3333, 5333) 및 6.79(2H, d, J= 6.9Hz, H-2333, 6333)/kH 6.98(2H, d, J {{5 0}}.0Hz, H-2, 6) 및 6.65(2H, d, J= 8.0Hz, H-3, 5)(표 2) . HMBC NMR 스펙트럼에서 kc 165.5(C{64}})의 카보닐 탄소와 H-8333 및 H-2333, 6333 및 C-7333(kc 145.4)는 (E)-쿠마로일기를 제안하였다. kc 169.0에서 메틸 양성자 피크와 카보닐 탄소 사이의 HMBC 상관 관계는 아세틸 그룹의 존재를 확인했습니다.

4-히드록시페닐기는 kC 155.6(C-4) 및 128.6(C-1)에서 H-3, 5 및 4차 방향족 탄소 간의 HMBC 상관 관계를 기반으로 제안되었습니다. . 히드록실화된 에틸기는 kH 2.66(2H, t, J{12}}.1 Hz, H{14}}), 3.90(1H, m, H{18}}a에서 COSY NMR 신호에 의해 확인되었습니다. ) 및 3.54(1H, m, H{22}}b). H-7 및 C{24}}(kC 128.6) 및 C-2, 6(kC 129.7) 간의 HMBC 상관 관계는 4-하이드록시페닐에틸 그룹을 아글리콘 하위 구조로 제안했습니다.

산가수분해물의 HPLC 분석과 NMR 스펙트럼을 통해 MS 단편 패턴에서 제안된 두 개의 당 모이어티를 재확인하였다. D-포도당과 L-람노오스는 산 가수분해물의 HPLC 분석을 사용하여 해명되었다[17]. α-글루코오스 부분과 α-람노오스 부분은 아노머 양성자의 커플링 상수에 의해 확립되었다. 1H-1H COSY 스펙트럼은 H-13에서 H-53로, H-133에서 H{10}}로 순차적인 상관관계를 보여주었습니다(그림 4).

1H-NMR 스펙트럼에서 H-23(kH 4.69) 및 H-43(kH 4.80)의 하향장 이동은 포도당에서 아실 치환된 위치를 시사합니다. 포도당과 2개의 아실기 사이의 연결은 H-43(kH 4.80)와 C{12}} 사이의 HMBC 상관관계와 아세틸기의 H-23와 카르보닐 탄소(kC 169.0 ). 아글리콘과 람노오스의 위치는 H-33(kH 3.95)와 C{19}} 사이 및 H-8와 C{21}} 사이의 HMBC 상관 관계에 의해 제공되었습니다. 따라서, 17의 구조는 4-히드록시페닐에틸-2-O-아세틸-O- -L-람노피라노실-(1→3)-4-O-(E)- 쿠마로일{35}}D-글루코피라노사이드 및 명명된 시스탄살사이드 D.

Cistansalside E(18)는 무정형 갈색 분말로 분리되었습니다. 분자식은 13C-NMR 데이터 및 m/z 657.2166 [M + Na] + (C31H38O14Na에 대한 계산, 657.2154)에서 포지티브 모드 고해상도 ESI-QTOF-MS 피크에 의해 C31H38O14인 것으로 결정되었습니다. 또한, m/z 163에서 caffeoyl 이온, m/z 367에서 [M plus H x Aglycone x Rha] plus 이온 및 m/z 513에서 [M plus H x Aglycone] 이온을 포함하는 단편 이온도 검출되었습니다. 단편 이온은 람노오스 단위와 아세틸 치환된 포도당 단위의 존재를 시사한다.

1H-NMR 스펙트럼은 kH 4.63(1H, d, J{5}}.2 Hz, H{7}}) 및 4.60(1H, s, H{11}}에서 두 개의 아노머 양성자가 존재함을 시사했습니다. ) 및 kH 4.71(1H, dd, J{16}}.9, 8.2 Hz, H{20}}) 및 4.81(1H, dd, J= 9.7에서 2개의 아실 치환된 글루코스 양성자) , 9.5Hz, H-43). 1H 및 HMBC 스펙트럼은 kH 1.94(3H, s, 아세틸-CH3)에서 아세틸기의 존재, kH 7.48(1H, d, J{39}}.9 Hz에서 (E)-카페오일 잔기, H{41}}), 7.02(1H, d, J{45}}.6Hz, H{47}}), 6.98(1H, dd, J{51}}.1, 1.6Hz, H{55}}), 6.76(1H,d, J{59}}.1Hz, H{61}}) 및 6.21(1H, d, J=15.9Hz, H{ {67}}) 및 kH 7.29(2H, m, H{72}}, 5), 7.21(2H, m, H-2, 6) 및 7.20(1H, m, H{82}}) (표 2). 아글리콘 하위 구조인 페닐메틸 그룹은 H-7(2H, kH 2.80, m)와 C-1(kC 138.8) 사이의 HMBC 상관 관계와 H-7와 C 사이의 상관 관계에 의해 제안되었습니다. -2, 6(kC 128.9) 및 H{96}}의 COSY NMR 신호와 H{97}}a(1H, kH 3.99, m) 및 H{101}}b(1H, kh 3.63, m).

산 가수분해물의 HPLC 분석과 NMR 스펙트럼 분석을 통해 두 개의 당 모이어티가 재확인되었습니다. D-glucose와 L-rhamnose로 확인된 산가수분해물의 HPLC 분석을 통해 당의 절대적 구조를 규명하였다[17]. α-글루코오스 부분 및 α-람노오스 부분은 아노머 양성자의 커플링 상수에 의해 확립되었다. 1H-1H COSY 스펙트럼은 H-13에서 H-53, H-133에서 H{10}}, H{{11} }에서 H{12}}(그림 4).

HMBC 스펙트럼에서 H{0}}와 C-8(kC 69.4) 사이의 상관관계, H-23와 아세틸기의 카르보닐 탄소(kC 169.1) 사이, H-33(kH 3.95) 및 C{10}}(kC 102.0) 및 H-43(kH 4.81)와 C{16}}(kC 165.6) 사이에서 치환기의 위치를 ​​확인했습니다. 구조. 따라서 18의 구조는 페닐에틸-2-O-아세틸-OaL-람노피라노실-(1→3)-4-O-(E)-카페오일- -D-글루코피라노사이드 및 시스탄살사이드 E.

대부분의 trans-cinnamoyl 치환기는 시험관 내에서 cis-isoform으로 이성질체화되었습니다. 빛은 trans-cinnamic acid 유도체를 cis-isoforms로 전환시키는 것으로 보고되었습니다[18,19]. cinnamoyl 치환기의 trans-cis 전환의 평형은 trans-isoform에서 분리물의 약 70%를 유지하는 것으로 관찰되었습니다. 시스 형태의 올레핀 양성자의 경우 약 6.90ppm(d, J{11}}~13Hz, H{13}}) 및 5.80ppm(d, J{16}}~13Hz, H{18}})는 1H-NMR 스펙트럼에서 할당할 수 있는 반면, 약 7.55ppm(d, J{23}}.8 Hz, H{25}}) 및 6.40ppm(d, J{ 변환에 대해 {28}}.8Hz, H{30}})가 관찰되었습니다[20]. trans-cis 혼합물의 1H-NMR 스펙트럼에서 2개의 olefinic proton(H-7333 및 H{36}})의 피크가 7:3(trans:cis)의 비율로 관찰되었습니다. cis 형태의 13C-NMR 피크는 변환의 피크와 유사하였다.

cistanche의 유효 성분: acteosides

모든 분리주는 RAW에서 LPS로 유도된 NO 생성에 대한 억제 효과에 대해 테스트되었습니다.

모든 분리주는 RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도된 NO 생성에 대한 억제 효과에 대해 테스트되었습니다. Dexamethasone은 양성 대조군으로 사용되었으며 IC50는 7.{18}} uM입니다. 테스트된 화합물 중 화합물 5(IC50 42.7 ~ 6.6 uM), 11(IC{12}}.3 ~ 2.2 uM), 13(IC{17}}.{{2{{ 24}}}} o 4.{37}} uM) 및 18(IC{22}}.9 o 0.8 uM)은 유도성 NO 합성효소에 대해 중간 정도의 억제 활성을 보인 반면, 다른 화합물은 이 분석에서 비활성이었다(IC50 값 > 100uM). 이들 화합물이 세포독성을 갖는지 확인하기 위해 MTT 분석을 사용하여 세포 생존력을 측정하였다. 그 결과 어느 것도 유의미한 세포독성을 나타내지 않았습니다(보충 그림 S6-1). 이 4가지 화합물을 선택하여 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 NF-λB ​​경로에 대한 억제 활성을 평가했습니다. LPS로 RAW 264.7 세포를 자극하면 0.5시간 배양 후 I入B 및 NF-B(p65)의 인산화가 유도되었습니다. NF-β(p65)의 인산화는 western blot analysis(그림 5)에서 볼 수 있는 바와 같이 화합물 11, 13 및 18로 전처리함으로써 유의하게 감소되었습니다. 따라서 화합물 11, 13 및 18은 대식세포에서 NF-入B의 억제를 통해 항염 효과를 나타낼 수 있습니다.

그림 5.LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 I入B 및 NF-B(p65)의 인산화에 대한 4가지 화합물의 효과. (A) 웨스턴 블롯은 LPS 및 샘플 처리된 RAW 264.7 세포에서 수행되었습니다. (B, C) 면역블롯 신호는 Molecular Analyst/PC 농도계 소프트웨어(Bio-Rad, Richmond, CA, USA)를 사용하여 정량화되었습니다. 인산화된 동형의 밀도계 분석이 보고됩니다. RAW 264.7 세포에서 NF-β는 α-액틴의 함량으로 정규화되었다.

3. 재료 및 행동 양식

3.1. 일반 실험 절차

광학 회전은 Jasco P{0}} 디지털 편광계(Jasco, Tokyo, Japan)로 측정되었습니다. UV 스펙트럼은 Chirascan plus Circular Dichroism spectrometer(Chirascan, APL, UK)에서 기록되었습니다. IR 스펙트럼은 Jasco FT/IR{1}} 분광광도계를 사용하여 기록되었습니다. 고해상도 전자분무 이온화 사중극자 비행 시간 질량 분석기(HR-ESI-qTOF-MS)는 Agilent 1260 Infinity 시리즈(Agilent Technologies, Inc. , Palo Alto, CA, USA)이며 사용된 컬럼은 Jasco SFCpak Crest C18T{14}} 컬럼(id 150 4.6 mm, 5 um)이었습니다. MassHunter Workstation Software는 데이터 수집에 사용되었습니다.

1D(1H 및 13C) 및 2D(1H{5}}H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) NMR 스펙트럼은 Jeol LA 300(Jeol, Tokyo, Japan), Bruker AVANCE-400, Bruker AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 및 Bruker AVANCE 800 HD 분광계와 극저온 프로브(Bruker, Ettlingen, Germany). DMSO-d6(Cambridge Isotope Laboratories, In Cistanche Andover, MA, USA)을 NMR 용매 및 참조 피크(kH 2.50 및 kC 39.5)로 사용했습니다. 컬럼 크로마토그래피(CC)는 Sephadex LH{17}}(25–100 um; Pharmacia, Uppsala, Sweden) 또는 Kieselgel 60 실리카겔(40–63 um, 230–400 메쉬, Art. 9385; Merck, Darmstadt)을 사용하여 수행했습니다. , 독일). 박막 크로마토그래피(TLC)는 미리 코팅된 Kieselgel 60 실리카겔 F254 플레이트(Art. 5715; Merck)에서 수행되었습니다. TLC의 반점은 254nm 및 365nm에서 UV 램프를 사용하여 감지되었습니다(VL-4.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torcy, France). 중압 액체 크로마토그래피(MPLC)는 RediSep 120g 실리카 플래시 컬럼(Isco, Lincoln, NE, USA)과 Kiesegel 60 실리카겔(40–63 um, 230–400 메쉬, Art. 9385; Merck)에서 수행되었습니다. Combiflash 동반자(Isco). 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템은 Gilson 321 펌프와 UV.VIS 151 검출기가 장착된 Gilson HPLC(Gilson, Middleton, WI, USA)였으며, semi-preparative ODS 컬럼(Luna 5 um C18(2) 100 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, CA, USA; Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorf, Germany; Inno C18 컬럼 120 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., 성남, 한국). 분석용 RP-HPLC 시스템은 a996 Photodiode Array(PDA) 검출기가 있는 Waters 2695 연합 시스템(Waters Corp, Milford, MA, USA)이었고 사용된 컬럼은 Hypersil™ BDS C18 컬럼(130 Å, id 150: 4.6 mm, 5 um, Thermo Scientific™). 개미산은 Daejung Chemical & Metal Co., Ltd. (Seoul, Korea)에서 구입했습니다. HPLC 등급 용매는 Fisher Scientific Korea Ltd.(서울, 한국)에서 구입했습니다. H2SO4, Na2CO3 및 추출, 분별 및 분리를 위한 1등급 용매는 Daejung Chemical & Metals Co. Ltd.(Seoul, Korea)에서 구입했습니다. L- 및 D-시스테인 메틸 에스테르 염산염 및 o-톨릴이소티오시아네이트는 Tokyo Chemical Industry(Tokyo, Japan)에서 구입했습니다.

3.2. 식물 재료

전체 식물의시탕슈 살사신장위구르에서 채집한 , 는 대림제약도매회사(청주, 한국)를 통해 수입하였다. 그들은 이제현 교수(동국대학교, 서울, 한국)에 의해 식별되었습니다. 바우처 표본(SNUPH2016-03)은 서울대학교 약학대학 식물원 식물원 식물 표본관에 기탁되었습니다.

3.3. 추출 및 격리

말린 전체 식물의시탕슈 살사(5.7 kg)을 잘게 자르고 99분 동안 초음파 처리하면서 실온에서 MeOH(2{16}} L)로 3회 추출했습니다. 진공에서 용매를 제거한 후, 조 추출물(1.35kg)을 H2O(5L)에 현탁시킨 다음, EtOAc(5L)로 분배하였다. EtOAc 잔류물(55.3g)을 CHCl3/MeOH(50:1–0:1, 단계 구배 시스템)로 용리하는 실리카겔 크로마토그래피에서 16개의 분획(E{12}})으로 분리했습니다.

E08(611.7mg)을 실리카겔 중압 액체 크로마토그래피(25g)로 처리하고 CHCl3/MeOH(18:1-{16}}:1, 단계 구배 시스템)로 용리하고 11개의 분수를 제공했습니다(E08a-k). E08g에서 화합물 13(0.7mg) 및 18(0.6mg)을 Luna 5um HPLC 컬럼 및 28% aq.로 등용매 용리를 사용하여 정제했습니다. MeCN. E08h(138.5mg)의 HPLC 정제(Hypersil GOLD, 25% aq. MeCN)는 화합물 7(10.6mg), 8(17.2mg), 14(13.4mg) 및 17(4.9mg)을 제공했습니다.

E09(1.15g)를 CHCl3/MeOH(1{29}}:1–0:1, 단계- 기울기 시스템)을 사용하여 11개의 하위 분수(E09a-k)를 제공합니다. E09e(398.7mg)에 Sephadex LH{17}}(MeOH)를 적용하여 8개의 하위 분획(E09e{19}})을 생성했습니다. E09e6을 후속적으로 Hypersil GOLD HPLC 컬럼(22% 수성 MeCN)을 사용하여 정제하여 화합물 11(0.4mg)을 얻었다. E09e7에서 화합물 5(0.6mg)를 40% aq. 메오.

E10(1.2{17}} g)은 MeOH로 용리되는 Sephadex LH{5}} 컬럼에서 9개의 분획(E1{21}}ai)으로 분리되었습니다. E1{31}}g(147.5mg)로부터 화합물 4(13.4mg), 9(8.0mg) 및 15(5.0mg)를 HPLC 분리(Inno, 23% 수성 MeCN)로 분리했습니다. 분획 E10h(470.0mg)를 등용매 용리(40% 수성 MeOH)에 의해 Hypersil GOLD 컬럼에서 정제하여 화합물 1(3.8mg), 10(42.1mg) 및 16(3.0mg)을 생성했습니다.

E11(2.96g)을 MeOH로 용리하는 Sephadex LH-20에 적용하여 9개의 분획(E11a-i)을 얻었다. E11e는 10%, 20%, 30%, 50% 및 100% aq로 단계적으로 용리되는 Sep-Pak C18 카트리지에 의해 분리되었습니다. MeOH로 7개의 분획(E11e{15}})을 생성한 다음 Luna 5um HPLC(28% 수성 MeCN)로 화합물 3(3.4mg), 6(1.4mg) 및 12(1.2mg)를 생성합니다.

E12(19.0 g)를 CHCl3/MeOH 단계 구배 시스템을 사용하여 실리카 MPLC(120 g)에 적용하여 6개의 분획(18:1-0:1 , E12a-f). E12f는 Sephadex LH{13}} 컬럼(MeOH)에서 크로마토그래피하여 7개의 분획(E12f{15}})을 생성했습니다. E12f7의 HPLC 정제(Hypersil GOLD, 25% aq. MeCN)는 화합물 2(3.3mg)를 제공했습니다. HPLC에 사용된 모든 용매는 0.05% 포름산 완충액이었습니다. HPLC 및 MPLC 크로마토그래피의 일반적인 유속은 각각 3 및 40mL/분이었습니다.

3.4.특성화

Cistansalside A(5): 갈색 무정형 분말; [ |20 x33.7(c 0.1, MeOH); UV(MeOH) 최대 nm(log e) 332(3.18); IR(순수) vmax 3359, 1748, 1705, 1602, 1516cmx1; 1H-NMR(800MHz) 및 13C-NMR(200MHz) 데이터, 표 2 참조; HRMS(ESI-TOF) m/z [M + Na] + 645.2146(C30H38O14Na에 대한 계산, 645.2154).

Cistansalside B(6): 갈색 무정형 분말; [ |20 x72.9(c 0.1, MeOH); UV(MeOH) 최대 nm(log e) 333(3.32); IR(순수) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 cmx1; 1H-NMR(500MHz) 및 13C-NMR(125MHz) 데이터, 표 2 참조; HRMS(ESI-TOF) m/z [M + Na] + 579.2054(C26H36O13Na에 대한 계산, 579.2048).

Cistansalside C(12): 갈색 무정형 분말; [ |20 x61.6(c 0.1, MeOH); UV(MeOH) 최대 nm(log e) 337(3.25); IR(순수) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 cmx1; 1H-NMR(800MHz) 및 13C-NMR(200MHz) 데이터, 표 2 참조; HRMS(ESI-TOF) m/z [M + Na] + 581.2213(C26H38O13Na에 대한 계산, 581.2205).

Cistansalside D(17): 갈색 무정형 분말; [ |20 x51.1(c 0.1, MeOH); UV(MeOH) 최대 nm(log e) 221(3.53), 315(3.52); IR(순수) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039cmx1; 1H-NMR(400MHz) 및 13C-NMR(75MHz) 데이터, 표 2 참조; HRMS(ESI-TOF) m/z [M + Na] + 657.2147(C31H38O14Na에 대한 계산, 657.2154).

Cistansalside E(18): 갈색 무정형 분말; [ |20 x59.2(c 0.1, MeOH); UV(MeOH) 최대 nm(log e) 336(3.22); IR(순수) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 cmx1; 1H-NMR(800MHz) 및 13C-NMR(200MHz) 데이터, 표 2 참조; HRMS(ESI-TOF) m/z [M + Na] + 657.2166(C31H38O14Na에 대한 계산, 657.2154)

3.5.HPLC-QTOF-MS 분석

크로마토그래피 질량 분석은 Agilent 126{8}} Infinity 시리즈 LC 시스템(Agilent Technologies, Inc., USA)에서 수행되었습니다. 분석 컬럼은 SFCpak Crest C18T-5 컬럼(id 15{{1{23}}}}: 4.6 mm, 5 um, Jasco, Japan)이었습니다. 이동상은 0~35분(23% A), 35~45분( 23~28% A), 45~75분(28% A) 및 75~80분(90% A). 유속은 0.3mL/min으로 유지되었습니다. 흡광도는 320 nm에서 측정되었습니다. ESI 소스의 조건은 다음과 같다: 건조 가스(N2) 유량, 10 L/min; 건조 가스 온도, 350도 ; 분무기, 30psig; 외피 가스 유량, 12.0 L/min; 외피 가스 온도, 350도 ; 모세관, 4000V; 스키머, 60V; 8극 RF, 750V; 단편화기 전압, 180V; 포지티브 모드. 시스템은 Masshunter 워크스테이션 소프트웨어로 운영되었습니다. 질량 범위는 m/z 50–1000으로 설정되었습니다.

3.6.산 가수 분해

9{32}}도에서 2시간 동안 수조로 가열된 1 N H2SO4(100 uL)를 사용하여 화합물을 가수분해한 다음, 포화 Na2CO3 수용액으로 중화시켰다. 용액을 N2 기류하에 건조시킨 후, 생성물 및 표준 당(D-Glc, L-Glc, L-Rha)을 L-시스테인 메틸 에스테르 염산염(0.5 mg)을 함유하는 피리딘(100 uL)에 용해시켰다. L-람노스 샘플을 D-시스테인 메틸 에스테르 염산염(0.5 mg)을 함유하는 피리딘(100 uL)에 용해시켰다. 그 후, 60도에서 1시간 동안 가열하였다. 용액을 1 uL(1.11 mg)의 o-tolylisothiocyanate로 처리하고, 이를 다시 60도에서 1시간 동안 가열하였다. 각 최종 혼합물은 분석 RP-HPLC(Hypersil™ BDS C18 컬럼, 17% 수성 MeCN, 0.8mL/min, 40분, 35도)로 직접 분석했습니다. 21.9분과 40.4분에서 피크의 tR은 각각 D-glucose와 L-rhamnose의 thiocarbamoyl thiazolidine 유도체와 일치하였다.

3.7. 셀 문화

쥐 대식세포 RAW 264.7은 한국생명공학연구원(대전, 한국)에서 입수하였으며, 10% 소태아혈청과 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신 황산염을 함유하는 RPMI 배지에서 성장시켰다. 세포는 37도의 가습된 5% CO2 대기에서 배양되었습니다.

3.8.약물 및 화학 물질

RPMI, 페니실린 및 스트렙토마이신은 HyClone(Logan, UT, USA)에서 구입했습니다. 소 혈청 알부민과 LPS는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다.

3.9.NO 생산량 측정

배양 배지의 아질산염 농도는 Griess 반응에 따른 NO 생성의 지표로 측정되었습니다. 세포를 96-웰 배양 플레이트에 웰당 2:1{13}}5개의 세포로 시딩했습니다. RAW 264.7 세포를 18시간 동안 사전 배양한 후, 세포를 화합물(5{20}} uM, 10 uM, 5 uM 또는 1 uM)로 전처리하고 24시간 동안 LPS(500ng/mL)로 자극했습니다. 시간. DMSO에 용해된 시험 화합물. 세포는 또한 비히클 대조군으로서 0.05% DMSO로 처리되었다. RAW 264.7 세포(2: 105 cells/well)를 페놀 레드가 없는 RPMI를 사용하여 96-웰 플레이트에서 배양하고 샘플로 0.5시간 동안 전처리했습니다. 세포의 NO 생성은 500ng/mL의 최종 농도 LPS를 첨가하고 24시간 배양함으로써 유도되었습니다. 인큐베이션 후, 100 uL의 조정된 배지를 동일한 부피의 Griess 시약과 혼합하고 15분 동안 인큐베이션했습니다. 540 nm에서 혼합물의 흡광도를 ELISA 마이크로플레이트 판독기(Benchmark, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA)로 측정했습니다. 얻어진 값을 RPMI에 용해된 아질산나트륨의 표준 농도와 비교하고, 시료 처리 세포의 조건 배지에서 아질산염의 농도를 계산하였다.

3.10.3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-세포 생존에 대한 디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석

세포를 5:104 세포/웰의 밀도로 {{0}웰 플레이트에 접종하고 샘플이 있는 상태에서 무혈청 배지와 함께 인큐베이션했습니다. DMSO에 용해된 시험 화합물. 세포는 또한 비히클 대조군으로서 0.05% DMSO로 처리되었다. 24시간 동안 인큐베이션한 후, 10uL MTT(식염수 중 5mg/mL)를 첨가하고 추가 4시간 동안 인큐베이션을 계속했습니다. 살아있는 세포의 미토콘드리아 숙시네이트 탈수소효소는 배양 동안 MTT를 가시적인 포르마잔 결정으로 전환합니다. 그 다음, 포르마잔 결정을 디메틸 설폭사이드에 용해시키고 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 마이크로플레이트 판독기(Benchmark, Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정했습니다. 처리되지 않은 대조군의 흡광도와 비교하여 상대적 세포 생존율을 계산하였다. 모든 실험은 삼중으로 수행되었습니다.

3.11.면역블롯 분석

단백질 발현은 표준 절차에 따라 웨스턴 블롯팅으로 평가하였다. 간단히 말해서, RAW264.7 세포를 6{{2{41}}}} mm 배양 접시(2:106/mL)에서 배양한 다음 50 uM의 화합물을 전처리했습니다. . 세포를 빙냉 PBS(pH 7.4)에서 2회 세척하고, 세포 펠렛을 얼음 상의 용해 완충액에 15분 동안 재현탁시킨 다음, 세포 파편을 원심분리에 의해 제거하였다. 단백질 농도는 제조업체의 지침에 따라 Bio-Rad 단백질 분석 시약을 사용하여 결정되었습니다. 단백질(20~30ug)을 2: 샘플 완충액(20% 글리세롤, 4% SDS, 10% 2- ME, 0.05% 브로모페놀 블루 및 1.25M Tris[pH 6.8]), 8% 또는 15% SDS-PAGE 젤에 로드하고 150V에서 90분 동안 실행합니다. 세포 단백질은 제조업체의 지침에 따라 Bio-Rad 반건식 전달 시스템을 사용하여 Immunoblot 폴리비닐리덴 이불화막(Bio-Rad)으로 전달되었습니다. 그런 다음 막을 5% 탈지유 및 0.1% Tween을 함유하는 Tris 완충 식염수에서 각각의 p-NF-B, NF-B, pIIB 및 -액틴 1차 항체(Abcam, Cambridge, UK)와 함께 밤새 배양했습니다. 20. 다음 날, 블롯을 Tris 완충 식염수(0.1% Tween 20)로 3회 세척하고 HRP가 결합된 이차 항-IgG 항체(1:2로 희석000-1으로 희석)와 함께 1시간 동안 배양했습니다. :20,000). 블롯을 Tris 완충 식염수(0.1% Tween 20)로 다시 3회 세척하고 화학 발광 기질 ECL Plus(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)를 사용하여 면역 반응성 밴드를 개발했습니다.

3.12.통계분석

실험 데이터는 평균 o SEM으로 표시됩니다. 통계적 유의 수준은 분산 분석(ANOVA)에 이어 다중 비교에 대한 Dunnett의 t-검정에 의해 결정되었습니다.p 0.05 미만의 값은 유의한 것으로 간주되었습니다.

시스탄체 살사 추출물

4. 결론

이 연구에서 우리는 복제 제거 전략을 사용하여 13개의 알려진 화합물을 분리하고 식별하는 것 외에도 cistansalside AE(5, 6, 12, 17 및 18)로 명명된 5개의 새로운 페닐프로파노이드 치환 배당체의 구조를 분리하고 설명했습니다. 알려진 화합물은 리페도사이드 AI(1)[21], 23-아세틸락테오사이드(2)[22], 이소시스타노사이드 C(3)[15], 오스만투사이드 B(4)[21], 에피메리디노사이드 A( 7) [15], 시스타노사이드 D(8) [23], 살사사이드 B(9) [6], 튜불로사이드 E(10) [16], 시스타노사이드 M(11) [15], 이소마르티노사이드(13) [24], 살사사이드 C(14)[6], 지오노사이드 C(15)[25] 및 살사사이드 F(16)[6]. 그들의 구조는 광범위한 분광 데이터의 분석과 문헌에 보고된 데이터와의 비교를 통해 확립되었습니다. 페닐프로파노이드 치환 배당체의 잠정적으로 예측된 ​​구조가 실제 구조와 정확히 일치함을 확인하였다.

Cistanche 살사 추출물의 이점

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