Paraboea Martinii의 페닐에타노이드 배당체는 과산화수소로 인한 세포 손상으로부터 쥐 갈색세포종(PC12) 세포를 보호합니다

연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com

Xue Gong†a , Yan Xu†b , Kai Renc , Xiaorong Baid

산화 스트레스는 여러 질병의 발병에 필수적인 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 이는 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 간질 및 기타 질병의 병인과 관련이 있습니다[1-3]. 현재, 알츠하이머병, 파킨슨병 및 기타 질병의 발병기전에 대한 연구가 계속 진행되고 있습니다. 그러나 알츠하이머병, 파킨슨병 및 기타 질병의 기저 분자 메커니즘에 대한 제한된 지식으로 인해 이러한 질병에 대한 효과적인 예방 또는 치료 전략이 실현되지 않았습니다[4]. H2O2는 활성산소종(ROS)의 중요한 구성요소입니다. 따라서 H2O{6}}유도 PC12 세포 손상은 산화 스트레스의 가장 일반적으로 사용되는 모델이며 신경 보호 효과에 대한 실험 연구에서 널리 사용됩니다[5]. 헴 옥시게나제 1(HO{10}})과 글루타메이트-시스테인 리가제-촉매 소단위(GCLC)는 중요한 세포 항산화 효소이며 두 유전자 모두 유망한 치료제로 떠오르고 있는 핵 인자 적혈구계 2(Nrf2)의 다운스트림에서 조절됩니다. 신경 보호 대상 [6,7]. C{17}}C{18}} 단위에서 파생된 페닐에타노이드 배당체는 많은 페놀성 수산기를 함유하고 상당한 항산화 및 노화 방지 활성을 가지고 있습니다. 지난 몇 년 동안 연구에 따르면 많은 약용 식물이 상당한 항산화 활성을 나타내는 페닐에타노이드 배당체를 함유하고 있습니다. 예를 들어, 페닐에타노이드 배당체는허바 시스탄체알츠하이머병의 인지 결손에 대한 보호 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있습니다. 그 연구는 AD 노화 가속 경향이 있는 마우스 8(SAMP8) 모델을 사용하여 관련 보호 메커니즘을 조사했습니다. 결과는 SAMP8 마우스의 인지 결손을 개선하는 페닐에타노이드 배당체의 능력이 항산화 과정을 포함하는 시냅스 가소성의 촉진과 관련될 수 있음을 나타냅니다[8]. 이 연구에서 두 개의 페닐에타노이드 배당체는 Tectona grandis(티크) 나무 매듭에서 분리 및 정제되었습니다. 이러한 화합물은 전류 측정법을 사용하여 측정된 주목할만한 항산화 효과를 나타냈습니다[9]. 또한, Lindernia ruellioides의 caffeoyl phenylethanoid glycoside 화합물은 시험관 내에서 용량 의존적 항산화제 및 슈퍼옥사이드 음이온 자유 라디칼 소거 효과를 발휘합니다[10]. 페닐에타노이드 배당체의 작용 기전은 SOD, CAT, GSH-PX 및 기타 항산화 효소의 합성에 영향을 미치는 Nrf2/ARE 신호 전달 경로의 조절과 관련이 있습니다[11]. 게스네리아과(Gesneriaceae)는 150속 3700여 종이 포함되어 있으며 주로 동아시아와 남아시아, 오세아니아, 남아메리카, 아프리카, 남유럽, 멕시코의 열대 및 온대 지역에 분포한다[12].

허바 시스탄체

중국의 게스네리아과. 약 100여 종이 약효가 있는 것으로 보고되었으며 이들 중 대부분은 주로 광시(廣西)성과 귀주(貴州)성에 분포한다[13]. 최근 몇 년 동안 Gesneriaceae 식물에 대한 연구는 세계 여러 지역에서 점차 증가하고 있으며 생리 활성을 갖는 일부 새로운 성분이 발견되었습니다[14]. Paraboea martinii (Levl.) Burtt는 Parabola (Gesneriaceae)에 속하며 초본 식물입니다. "중국 전통 의학 자원 기록"에 따르면 식물 전체를 약재로 사용한다고 기록되어 있습니다. 또한 토혈, 부종, 이질, ​​외상성 손상, 골절과 같은 상태에 대해 많은 약리학적 활성을 나타낼 수 있다[15]. Bai는 페닐에타노이드 배당체가 게스네리아과 식물의 주요 화학 성분 중 하나임을 입증했습니다[16]. 일부 연구자들은 또한 페닐에타노이드 배당체가 상당한 항산화 활성을 갖는다는 것을 발견했습니다[17]. Li는 페닐에타노이드 배당체의시스탄체 데저티콜라 have significant antioxidant activity [18]. In addition, Ju systematically studied the neuroprotective activities of phenylethanoid glycosides using PC12 cell models. The results indicated that phenylethanoid glycosides significantly attenuate the damage induced by Aβ1-42 [19]. In our studies, we isolated eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) from P. martini [20]. All compounds were isolated from the genus Parabola for the first time, and the compounds paraboside A, paraboside B, p paraboside I, paraboside II, and paraboside III were new compounds [20]. In a continuing search for molecules with antioxidant properties, phenylpropanoid glycosides were examined. However, whether these phenylpropanoid glycosides from P. martini could protect against H2O2-induced PC12 cell injury was previously unclear. In this study, we examined the protective effects of phenylpropanoid glycosides on H2O2-induced damage to PC12 cells. We also examined the effects and preliminary mechanism underlying the activity of phenylpropanoid glycosides with respect to the activation of HO-1 and GCLC in vitro. Materials and methods Materials Paraboea martini (Level.) Burtt was collected from Daxin County, Guangxi Autonomous Region in August 2014 and verified by Dr. Minhui Li (Baotou Medical College). Voucher specimens were deposited at the Laboratory of Pharmacognosy and Phytochemistry. Eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) were extracted and separated from P. martinii (Levl.) Burtt by prof. Xiaoqin Wang [20]. The purity (>8개의 페닐프로파노이드 배당체 중 98%는 HPLC 피크 면적 정규화 방법으로 측정되었습니다. 예를 들어, paraboside B와 paraboside II의 크로마토그래피 차트는 그림 1에 나와 있으며, 이들의 상대적 함량은 각각 98.23%와 99.20%인 것으로 나타났습니다. 잘 분화되지 않은 쥐의 부신 갈색세포종 세포주(PC12)는 중국 과학원(중국 상하이)의 세포 은행에서 구입했습니다. Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM) 및 말 혈청은 Gibco(Gaithersburg, MD, USA)에서 구입했습니다. 소태아 혈청(FBS)은 Thermo Fisher Scientific(Hyclone, Waltham, MA, USA)에서 구입했습니다. H2O2는 Tianjin Fu Yu Reagent Co., Ltd.(Tianjin, China)에서 입수했습니다. Trizol은 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 구입했습니다. PrimeScriptTM RT 시약 키트(Perfect Real Time)는 TaKaRa Biotechnology Co.(Dalian, China)에서 구입했습니다. HO{10}}, GCLC 및 GAPDH용 프라이머는 Sangon Biotech(중국 상하이)에서 합성했습니다. CellTiter 96® Aqueous One Solution 세포 증식 분석 키트(MTS)는 Promega Corp.(Madison, USA)에서 구입했습니다. H2O{12}} 아연 프로토포르피린(ZnPP) 억제제는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. Thermo311 CO2 Incubator(Thermo, USA), StepOnePlusTM Real-Time PCR Instrument Thermal Cycling Block(Thermo), Thermo Scientific Multiskan FC(Thermo), xCELLigence RTCA DPlus Analyzer 및 E-Plate 16(ACEA Biosciences, USA)도 사용되었습니다. .

시스탄체 데저티콜라

세포 배양 및 치료

PC12 세포는 가습된 5% CO2 대기에서 37도에서 5% FBS 및 5% 말 혈청을 함유하는 DMEM에서 성장되었습니다. PC12 세포는 대조군, 모델군, 처리군으로 세 그룹으로 나누었다. 8개의 페닐프로파노이드 배당체가 DMSO에 용해되었습니다(< 0.01%)="" and="" then="" diluted="" with="" a="" complete="" culture="" medium.="" to="" study="" the="" effects="" of="" the="" eight="" phenylpropanoid="" glycosides="" on="" h2="" o2-induced="" cell="" injury,="" pc12="" cells="" were="" cultured="" with="" the="" eight="" compounds="" at="" concentrations="" of="" 3.125,="" 6.25,="" 12.5,="" 25,="" and="" 50="" μm="" for="" 12="">

H2O2의 측정

실시간 세포 분석(RTCA)을 사용하여 적절한 H2O2 농도를 결정했습니다. PC12 세포를 100µL의 CIM 플레이트{5}} 마이크로플레이트에 접종한 다음 5% CO2 분위기에서 37도에서 12시간 동안 배양했습니다. PC12 세포를 대조군과 모델군으로 나누었다. 다음으로, 10 μL H2O2(50, 100, 200 및 400 μM)를 모델 그룹에 추가하고 대조군은 3개의 복잡한 웰에 설정된 10 μL 완전한 DMEM으로 처리했습니다. E-Plate 16을 xCELLigence RTCA에 넣고 15분마다 모니터링하고 결과를 32시간 동안 기록했습니다. PC12 세포에 대한 H2O2의 영향은 xCELLigence RTCA 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다. 세포 지수(CI) 값은 최적의 H2O2 농도와 작용 지속 시간을 결정하는 데 사용되었습니다.

화합물 추출 및 분리

앞에서 설명한 방법을 사용하여 극성에 따라 분획을 분리했습니다. 공기 건조되고 분말화된 P. martini(4kg)를 75% 에탄올 수용액으로 연속적으로 3회 추출했습니다[2{11}}]. 얻어진 추출물을 회전 증발기로 농축하여 에탄올을 제거하여 조 추출물을 얻었다. 샘플을 탈이온수에 용해시킨 다음 석유 에테르, 에틸 아세테이트, n-부탄올 및 물로 연속적으로 추출하였다. n-부탄올 추출물(400 g)을 AB-8 거대다공성 수지 컬럼과 에탄올-H2O2 용액(0, 1{47} }, 3{61}}, 5{64}}, 70, 95%). 6개의 분획(분획 1-6)이 최종적으로 얻어졌습니다. 분획 3과 4는 MeOH-H2O2의 단계적 구배(10-100%)가 있는 MCI 컬럼을 사용하여 분리되었습니다. 다음으로, 50% MeOH를 용리제로 포함하는 Sephadex LH{27}}를 사용하여 생성물을 분리했습니다. 화합물 1(41.0 mg) 및 6(15.6 mg)을 분획 3에서 분리했습니다. 화합물 2(62.0 mg), 3(34.7 mg), 7(11.0 mg) 및 8(26.0 mg)을 Sephadex를 사용하여 분획 4에서 얻었다. 50% MeOH를 용리액으로 사용하는 LH{49}} 크로마토그래피. 최종 분리는 50% MeOH 및 280nm에서 UV 검출을 사용하여 화합물 4를 생성하는 semi-prep, 역상 HPLC(Merck LiChrosorb, RP{53}}, RP{54}}, 250 × 10mm)에 의해 수행되었습니다. (39.0 mg) 및 5 (9.0 mg) [20].

세포 생존력 분석

PC12 세포를 96-웰 ​​플레이트에 2 × 1{{1{12}}}4 세포/웰의 최종 부피로 100µL의 밀도로 시딩했습니다. . PC12 세포를 37도에서 5% CO2로 12시간 동안 인큐베이션했습니다. 다음으로, 세포를 다양한 농도의 조 추출물({18}}.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 mg/mL)과 화합물 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 5가지 농도(3.125, 6.25, 12.5, 25 및 50μM)에서 8. 24시간 동안 전처리한 후, 세포 생존력은 MTS 분석에 의해 결정되었습니다. PC12 세포를 ZnPP(15μM) 없이 H2O{38}} 억제제와 함께 또는 없이 30분 동안 사전 인큐베이션한 다음, 칼레올라리오사이드 B, 파라보사이드 B 및 파라보사이드 II(3.125μM)와 함께 또는 없이 12시간 동안 인큐베이션하고 최종적으로 인큐베이션했습니다. 추가 6시간 동안 400μM H2O2로. 처리 후, 생존 세포의 수는 MTS 분석에 의해 결정되었다[6].

H2O{1}}처리된 PC12 세포에 대한 조 추출물 및 단량체 화합물의 보호 효과

세포는 100 µL의 최종 부피로 {{0}}웰 플레이트에서 배양되었습니다. 조 추출물의 연속 희석액(0.{10}}25, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4mg/mL)을 처리군에 첨가했습니다. 12시간 동안 전처리한 후 400μM의 H2O2 용액(최적 농도)을 처리군과 각 웰의 H2O2군에 6시간 동안 첨가하였다. 그런 다음 MTS 용액을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션했습니다. 플레이트를 모든 결정이 완전히 용해될 때까지 실온에서 5분 동안 저속으로 진동시켰다. 세포 보호는 제조사의 2204 X. GONG ET AL에 따른 MTS 분석 결과를 기반으로 결정되었습니다. 2021년 8월 27일 지침에 게스트가 https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145에서 다운로드했습니다. 흡광도 파장 490 nm에서 광학 밀도를 측정하였다. 분획 3과 4에서 분리한 화합물 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8의 활성을 추가로 추적했습니다. 화합물 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8의 연속 희석 (3.125, 6.25, 12.5, 25, 50μM)을 처리군에 첨가하여 H2O로 유도된 PC12 세포에 대한 각각의 보호 효과를 확인했습니다.

Cistanche Deserticola의 페닐에타노이드 배당체: 뉴런 보호 및 노화 방지

정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)

PC12 세포는 3.125μM 칼레올라리오사이드 B, 파라보사이드 B 및 파라보사이드 II로 처리한 후 12시간에 수확되었습니다. 총 RNA는 TRIzol-시약을 사용하여 추출되었고 총 RNA의 분취량은 제조업체의 지침에 따라 Primescript RT Master Kit를 사용하여 역전사되었습니다. 이전 보고서[21]에 따라 실험에 다음 프라이머를 사용했습니다. HO-1: 앞으로 5′ -GC CTGCTAGCCTGGTTCAAG{10}}′, 뒤로 5′ -AGC GGTGTCTGGGATGAACTA-3′; GCLC: 정방향 5' - GTCCTCAGGTGACATTCCAAGC-3', 역방향 5' -TG TTCTTCAGGGGCTCCAGTC-3'; GAPDH: 앞으로 5′-AAGCTGGTCATCAACGGGAAAC-3′, 뒤로 5′- GAAGACGCCAGTAGACTCCACG-3′. 얻어진 cDNA의 분취량을 PCR로 증폭하였다. 반응 조건은 95도(30초)에서 초기 변성 후 95도(5초), 60도(34초), 72도(35초)의 40 사이클이었다. 모든 프라이머를 테스트하고 FL 형광 신호를 감지했습니다. 그런 다음 △Ct 값을 계산하고 상대 값을 다음 식을 사용하여 대조군과 비교했습니다. △Ct=Ct(샘플) − Ct(내인성 대조군), △△Ct {{36} } △Ct(샘플) −△Ct(미처리) 및 배수 변화=2−△△Ct. 글리세르알데히드{38}}인산 탈수소효소(GAPDH)를 내부 대조군으로 사용했습니다.

단백질 추출

PC12 세포를 100-mm 접시에 1 × 107 세포/접시로 시딩했습니다. 부착 후, 세포를 각각 칼레올라리오사이드 B, 파라보사이드 B 및 파라보사이드 II(3.125 μM)로 12시간 동안 처리하였다. 그 다음 배당체를 제거하고 세포를 H2O2와 함께 추가로 6시간 동안 인큐베이션했습니다. 인큐베이션 후, 세포를 차가운 PBS로 두 번 세척하고 1mL의 PBS로 접시에서 긁어냈습니다. 세포 균질액을 1500rpm에서 10분 동안 원심분리했습니다. 처리 후, 제조사의 지침에 따라 1mM PMSF를 포함하는 Beyotime RIPA 세포 용해 완충액을 사용하여 세포 단백질을 추출하였다. 또한 Beyotime 핵 및 세포질 추출 키트 프로토콜에 설명된 대로 세포질 및 핵 단백질을 분리했습니다. 시료의 단백질 농도는 Beyotime BCA protein assay kit를 이용하여 검출하였으며, 모든 시료는 western blotting 분석을 위해 -80도에서 보관하였다[6].

웨스턴 블롯 분석

SDS-PAGE 전기영동은 다른 그룹에서 추출한 총 단백질의 후속 변성 후에 수행되었습니다. 전기영동 후 단백질을 PVDF 막으로 옮기고 5% 탈지분유로 4시간 동안 차단하였다. 세척 후 1차 항체(토끼 다클론항체 GAPDH(1:10,{5}} 희석), 토끼 다클론항체 HO{6}}(1:1000 희석) 또는 토끼 다클론항체 GCLC(1:1000 희석) 4℃에서 밤새 배양한 멤브레인에 첨가하고, 다음날 PVDF 멤브레인을 TTBS로 3회 세척한 다음, 양고추냉이 과산화효소를 막에 첨가한 후 실온에서 2시간 동안 배양한 후 PVDF 막을 세척하고 X선 필름에 신호 노출을 위한 ECL 화학 발광 검출 시약을 적용한 후 고정 및 스캔하였다[22].

통계 분석

데이터는 SPSS 19.{1}}를 사용하여 분석되었으며, 결과는 3개의 독립적인 실험의 표준편차(SD)가 있는 평균으로 제시됩니다. p < 0.05의="" 값은="" 통계적으로="" 유의한="" 차이를="" 나타내는="" 것으로="">

결과 H2O2 모델 구축

그림 2에서 볼 수 있듯이 50, 100 및 200μM의 H2O2는 적절한 수준의 세포 사멸을 일으키지 않았습니다. 그러나 400μM H2O2는 2-6시간 내에 PC12 세포에 작용했으며 세포에 대한 산화적 손상은 안정적인 경향이 있었습니다. 따라서 우리는 6시간 동안 400μM 농도의 H2O2로 유도하는 것이 PC12 세포에 대한 산화 스트레스 유발 손상을 모방하는 데 적합하다고 생각했습니다.

H2O2 처리된 PC12 세포에 대한 조 추출물의 보호 효과

H2O2 모델 그룹(그림 3)과 비교하여 0.05, 0.1, {{10} 농도의 n-부탄올 추출물 }.2 및 0.4 mg/mL는 농도 의존적 ​​방식으로 H2O2에 의해 유도된 PC12 세포에 대한 산화적 손상을 유의하게 개선했습니다(p < 0.{23}}5).="" 이러한="" 데이터는="" n-부탄올="" 분획이="" 더="" 강력한="" 보호="" 활성을="" 함유함을="" 시사했습니다.="" 그러나="" 석유="" 에테르와="" 에틸="" 아세테이트="" 추출물은="" 고농도에서만="" 보호="" 활성을="" 보였습니다(석유="" 에테르:="" 0.1="" 및="" 0.2="" mg/ml,="" p="">< 0.{31}="" }5,="" 에틸="" 아세테이트:="" 0.2="" 및="" 0.4="" mg/ml,="" p="">< 0.05).="" 더욱이,="" 다른="" 농도의="" 수상="" 추출물은="" 보호="" 효과를="" 나타내지="" 않았습니다(p=""> 0.05). 또한 보충 파일에 SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포주(SH-SY5Y)를 사용한 검증 연구의 데이터를 추가했습니다. 250μM H2O2로 처리하면 세포 생존력이 감소했습니다. 그러나 칼레올라리오사이드 B, 파라보사이드 B 및 파라보사이드 II(3.125, 6.25, 12.5, 25 및 50μM) 처리는 SH-SY5Y 세포 사멸을 유의하게 약화시켰다. 실험 결과 칼레올라리오사이드 B, 파라보사이드 B, 파라보사이드 II가 SHSY5Y 세포를 H2O{52}}유도 세포 손상으로부터 보호함을 입증했습니다.

n-부탄올 분획으로부터 분리된 화합물의 구조

n-부탄올 추출물에 활성 성분이 포함되어 있는지 확인하기 위해 추출에서 8가지 화합물을 추가로 분별했습니다. 화합물 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 구조는 paraboside A에 대한 공개된 데이터와의 비교를 기반으로 하는 다른 스펙트럼 데이터(1 H-NMR, 13C-NMR 및 ESI-MS)에 의해 확인되었습니다. , paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B 및 isonuomioside A [2{18}}]. 예를 들어, 파라보사이드 B에 대한 데이터는 다음과 같습니다. 갈색 검; ½ 20 D -55.7(c 0.05, CH3OH)[20]; UVMeOH 최대 nm(logε): 220(3.61), 291(3.54), 330(3.66)[20]; IRKBr 최대 cm-1: 3392, 2943, 2885, 1699, 1683, 1606, 1521, 1361, 1282, 1163, 1114, 1039, 995, 817 cm-1 [20]; 참조 20에 표시된 1 H 및 13C NMR 분광 세부 데이터의 경우; HR-ESI-MS(음수) m/z 741.2231 [MH]-(C33H41O19에 대한 계산, 741.2242) [20]. 파라보사이드 II에 대한 데이터는 다음과 같았다: 백색 무정형 분말; ½ 20 D -80.5(c 0.05, CH3OH)[20]; UVMeOH 최대 nm(logε): 229(3.74), 322(3.73)[20]; IRKBr 최대 cm-1: 3419, 1699, 1625, 1596, 1515, 1456, 1419, 1263, 1159, 1139, 1068, 1022, 808 cm-1 [20]; 참조 20에 표시된 1 H 및 13C NMR 분광 세부 데이터의 경우; ESI-MS(네거티브) m/z 637

PC12 세포에서 H2O{1}유도 독성에 대한 분리된 화합물의 보호 효과

MTS 분석은 H2O{2}}유도 독성에 노출된 PC12 세포의 생존력에 대한 분리된 화합물의 영향을 조사하는 데 사용되었습니다. 그림 5에서 볼 수 있듯이 대조군과 비교하여 5가지 농도의 칼레올라리오사이드 B, 파라보사이드 B, 파라보사이드 II 또는 파라보사이드 A(3.125, 6.25, 12.5, 25, 5)로 전처리한 PC12 세포{14}} μM)은 24시간 동안 세포 생존율에서 유의한 차이를 나타내지 않았습니다(p > 0.05). 따라서, PC12 세포를 칼레올라리오사이드 B, 파라보사이드 B 및 파라보사이드 II로 전처리한 결과 세포독성이 발생하지 않았습니다. 그림 6에서 볼 수 있듯이 400 µM H2O2는 대조군에 비해 세포 생존력을 현저히 감소시켰습니다. 더욱이, H2O{22}} 처리된 PC12 세포의 세포 생존율은 PC12 세포를 다양한 농도의 칼레올라리오사이드 B, 파라보사이드 B 및 파라보사이드 II로 전처리한 후 현저하게 증가했습니다. 또한, 세포 생존율은 50μM caleolarioside B, 50μM paraboside B 및 12.5μM paraboside II로 처리한 후 가장 높았습니다. 다른 5가지 화합물은 H2O 처리된 PC12 세포에 대해 유의미한 보호 효과를 보이지 않았습니다. 이 발견을 설명하기 위해 이들 중 하나를 예로 설명하고 나머지는 원고에서 설명하지 않습니다.

HO-1 및 GCLC의 전사 수준

다음으로 칼레올라리오사이드 B, 파라보사이드 B 및 파라보사이드 II로 처리된 PC12 세포에서 HO{0}} 및 GCLC의 전사 수준을 테스트했습니다. 12시간 동안 처리 및 처리되지 않은 PC12 세포에서 총 mRNA를 수집한 다음 qRT-PCR에 의한 발현 분석을 수행했습니다. 그림 7(a,c,e)에서 볼 수 있듯이 PC12 세포에 표시된 농도의 칼레올라리오사이드 B, 파라보사이드 B 및 파라보사이드 II를 12시간 동안 전처리한 후 HO{6}}의 전사 수준이 유의하게 증가했습니다(p < 0.05).="" 그림="" 7(b)에서="" 볼="" 수="" 있듯이="" gclc의="" 전사="" 수준은="" 표시된="" 농도의="" 칼레올라리오사이드="" b로="" 12시간="" 동안="" 전처리한="" pc12="" 세포에서도="" 유의하게="" 증가했습니다.="" 그러나="" 12시간="" 동안="" 파라보사이드="" b로="" 전처리한="" pc12="" 세포의="" gclc="" 수준은="" 모델="" 그룹에="" 비해="" 유의하게="" 감소했습니다(p="">< 0.05,="" 그림="" 7(d)).="" 또한,="" paraboside="" ii="" 처리로="" pc12="" 세포의="" gclc="" 수준은="" 모델="" 그룹의="" 수준과="" 크게="" 다르지="" 않았습니다(p=""> 0.05, 그림 7(f)).

HO-1 및 GCLC의 표현

HO{{0}} 및 GCLC는 중요한 세포 항산화 효소이며 둘 다 Nrf{1}}조절되는 다운스트림 유전자입니다. HO-1 및 GCLC의 단백질 발현도 처리 후에 관찰되었다[6]. 그림 8은 400μM H2O2로 처리한 후 PC12 세포에서 HO-1 및 GCLC의 단백질 수준을 보여줍니다. 결과는 칼레올라리오사이드 B 및 파라보사이드 B 그룹에서 H2O{10}}의 FL 형광 강도가 H2O 처리 그룹보다{12}}더 큰 것으로 나타났습니다(그림 8(a,c)). 그러나 GCLC의 발현은 caleolarioside B를 제외하고는 화합물에 의해 유의하게 변화하지 않았다(Figure 8(b)). 다음으로, H2O{15}}의 화학적 억제제를 사용하여 H2O로 유도된 세포독성에 대해 칼레올라리오사이드 B, 파라보사이드 B 또는 파라보사이드 II가 가하는 보호 효과를 조절하는 항산화 효소의 역할을 추가로 평가했습니다. Caleolarioside B, paraboside B 및 paraboside II(3.125 µM)는 H2O{21}}유도 세포독성을 방지했지만 이러한 보호 효과는 15 µM에서 H2O{22}} 억제제 ZnPP(p < 0.01)에="" 의해="" 역전되었습니다(그림="" 8="">

Cistanche의 장점: 수컷 번식 증가

논의

인구 고령화는 심각한 글로벌 문제입니다. 많은 질병이 공공 건강에 심각한 위협인 알츠하이머병 및 파킨슨병과 같은 노쇠와 관련이 있습니다. 알츠하이머병과 파킨슨병은 심혈관 질환과 암에 이어 전 세계적으로 세 번째로 치명적인 질병으로 부상했습니다. 따라서 신경퇴행성은 전 세계적으로 시급한 연구 주제가 되었습니다. 그러나 중추신경계의 퇴행성 질환인 알츠하이머병과 파킨슨병의 발병기전은 아직까지 명확하지 않다. 더욱이 알츠하이머병이나 파킨슨병을 효과적으로 치료할 수 있는 약물은 복잡한 병원성 메커니즘으로 인해 소수에 불과합니다[23]. 이전 연구에서는 과산화물 음이온(O2-) 및 H2O2와 같은 ROS가 신경 퇴행성 질환에 기여하는 주요 요인임을 보여주었습니다. PD 동안의 병리학적 변화에는 흑색질 및 선조체 도파민의 신경 ​​변성 및 사망이 포함됩니다[24,25]. 따라서 파킨슨병을 치료하기 위해서는 효과적인 항산화제를 개발하는 것이 중요하며, 이러한 약물의 발견이 중요한 연구 방향이 되고 있다[26]. 현재 Nrf2/ARE 신호전달 경로는 가장 중요한 내인성 항산화 스트레스 경로인 것으로 보인다[27]. Ares는 HO{11}} 및 GCLC[28,29]와 같은 유전자의 5' 이행 순위 영역에 있습니다. HO{14}} 및 GCLC는 이 단백질의 다운스트림에서 조절되는 Nrf{15}}관련 유전자입니다[6]. ARE는 이후 항산화제 수준에 영향을 미치고 H2O{17}} 및 기타 보호 유전자의 다운스트림 발현을 활성화하여 세포 보호 활동을 향상시킬 수 있습니다[3{48}},31]. 또한 PC12 세포에서 A {{2{{5{54}}}}}} 유도 독성에 대한 레스베라트롤의 보호 효과는 Nrf2 세포 내 활성화를 통한 HO-1 발현의 상향 조절을 통해 발생함을 시사했습니다. 신호 전달 경로[32].PC12 세포는 신경 세포의 허용된 모델이며 신경 보호 효과 연구[33]에 광범위하게 사용됩니다. H2O2는 세포막을 쉽게 통과하고 철과 결합하여 활성이 높은 자유 라디칼을 형성하여 산화 스트레스와 세포 손상을 유발할 수 있습니다[34]. H2O2는 중요한 활성산소로서 자유라디칼이 쉽게 생성되고 상대적으로 안정하기 때문에 PC12 세포를 이용한 산화적 스트레스 모델을 구축하는데 주로 사용된다[5]. 이 연구에서 식물 추출물의 무독성 농도로 PC12 세포를 전처리하면 H2O로부터 세포를 보호하여 ROS 생성을 감소시켜 세포 독성을 유도했습니다. 페닐에타노이드 배당체에는 항산화 및 노화 방지 활성을 갖는 많은 페놀성 수산기가 포함되어 있습니다. 이 연구에서 우리는 n-부탄올 추출이 다른 극성 분획보다 더 나은 보호를 생성한다는 것을 발견했습니다(그림 3). 따라서, 우리는 n-부탄올 분획에서 분리된 8개 화합물의 보호 활성을 추가로 스크리닝했습니다. 결과는 그림 8. PC12 세포의 H2O{42}} 및 GCLC 단백질 수준 분석에서 처음으로 나타났습니다. (a) HO-1 및 GCLC 및 GAPDH의 발현에 대한 웨스턴 블로팅 분석을 로딩 대조군으로 사용하였다. (b) 웨스턴 블롯 분석 GCLC 단백질 발현. (c) 웨스턴 블롯 분석 HO{45}} 단백질 발현. (d) HO{46}} 억제제 ZnPP는 신경보호 효과를 감소시켰다. 데이터는 평균 ± SD, n=3으로 표시됩니다. ***p < 0.001="" 대="" 대조군;="" #p="">< 0.05="" 대="" h2o2="" 그룹(znpp="" 처리되지="" 않음),="" ##p="">< 0.01="" 대="" h2o2="" 그룹(znpp="" 처리되지="" 않음),="" ###p="">< 0.001="" 대="" h2o2="" 그룹(znpp="" 처리되지="" 않음);="" 및="" p="">< 0.01,="" 대="" h2o2="" 그룹(znpp="" 처리됨)="" 및="" &p="">< 0.001,="" h2o2="" 그룹(znpp="" 처리됨).="" (대조군;="" 모델군:="" h2o2;="" znpp="" 음성군:="" 칼레올라리오사이드="" b="" +="" h2o2,="" 파라보사이드="" b="" +="" h2o2,="" 파라보사이드="" ii="" +="" h2o2;="" znpp="" 양성="" 그룹:="" znpp="" +="" 칼레올라리오사이드="" b="" +="" h2o2,="" znpp="" +="" 파라보사이드="" b="" +="" h2o2,="" znpp="" +="" 파라보사이드="" ii="" 플러스="" h2o2).="" 2210="" x.="" gong="" et="" al.="" 2021년="" 8월="" 27일="" 게스트가="" https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145에서="" 다운로드="" caleolarioside="" b,="" paraboside="" b="" 및="" paraboside="" ii는="" h2o="" 유도="" 산화에="" 대해="" 상당한="" 보호="" 효과가="" 있습니다{92}}="" pc12="" 세포의="" 손상.="" 결과는="" 또한="" h2o2="" 처리가="" 상당한="" pc12="" 세포="" 손상을="" 유도하고="" 세포="" 생존력을="" 감소시킨="" 반면,="" 칼레올라리오사이드="" b,="" 파라보사이드="" b="" 및="" 파라보사이드="" ii="" 처리는="" 이러한="" 효과를="" 유의하게="" 완화시켰다는="" 것을="" 나타내었습니다(그림="" 6).="" 이전="" 연구에서는="" nrf2/are="" 경로가="" 가장="" 중요한="" 내인성="" 항산화="" 경로="" 중="" 하나이며="" 세포를="" 보호하기="" 위해="" ho{99}}와="" 같은="" 다운스트림="" 마커의="" 발현을="" 상향="" 조절할="" 수="" 있다고="" 보고했습니다[7].="" qrt-pcr="" 및="" 웨스턴="" 블로팅="" 분석="" 결과="" 칼레올라리오사이드="" b,="" 파라보사이드="" b,="" 파라보사이드="" ii가="" h2o="" 수준을="" 유의하게="" 상향조절한="" 것으로="" 나타났습니다{102}}.="" 그러나,="" gclc의="" 전사="" 수준은="" 모델="" 그룹에="" 비해="" 칼레올라리오사이드="" b로="" 전처리된="" pc12="" 세포에서="" 유의하게="" 증가했지만="" 파라보사이드="" b로="" 전처리된="" 세포에서는="" 감소하였다.="" 또한="" paraboside="" ii는="" 모델="" 그룹과="" 비교하여="" 이="" 마커의="" 발현을="" 변경하지="" 않았습니다(그림="" 7="" 및="" 8(a-c)).="" 또한="" h2o로="" 유도된="" pc12="" 세포="" 손상에="" 대한="" 칼레올라리오사이드="" b,="" 파라보사이드="" b,="" 파라보사이드="" ii의="" 보호="" 효과는="" h2o="" 억제제="" znpp에="" 의해="" 역전되었습니다(그림="" 8(d)).="" 결론적으로="" 페닐에타노이드="" 배당체="" 칼레올라리오사이드="" b,="" 파라보사이드="" b,="" 파라보사이드="" ii는="" h2o로="" 인한="" 산화="" 손상으로부터="" pc12="" 세포를="" 효과적으로="" 보호했습니다.="" 따라서,="" p.="" martini에서="" 분리된="" 이들="" 화합물은="" 신경퇴행성="" 질환의="" 치료를="" 위한="" 잠재적인="" 약물="" 후보를="" 나타낼="" 수="">

Cistanche의 장점:신경퇴행성 질환 치료

참고문헌

[1] 버터필드 DA. 알츠하이머병의 산화스트레스에 대한 관점과 향후 연구에 대한 예측을 강조한다. J 알츠하이머 Dis. 2018;64:1–11.

[2] Chignon C, Tomas M, Bonnefontrousselot D, et al. 알츠하이머병에서 산화 스트레스와 아밀로이드-베타 펩타이드. 레독스 바이오. 2018;14:450–464.

[3] Guo JD, Zhao X, Li Y, et al. 파킨슨병에서 산화 스트레스에 의한 도파민성 뉴런의 손상(검토). Int J Mol Med. 2018;41:1817–1825.

[4] Bai Y, Dong LH, Huang XH, et al. 파킨슨병 위험이 감소된 rs823128, rs1572931 및 rs823156 다형성의 연관성. 신경 보고. 2017;27:936–941.

[5] Han XH, Zhu SL, Wang BX, et al. 7,{2}}디하이드록시플플라본의 항산화 작용은 6-하이드록시도파민 유도 세포독성으로부터 PC12 세포를 보호합니다. Neurochem Int. 2014;64:18–23.

[6] Li MQ, Xu T, Zhou F, et al. Nrf2/ARE 경로를 통해 PC12 세포에서 H2O에 대한 4개의 페닐에타노이드 배당체의 신경보호 효과{2}}유도된 세포자멸사. Int J Mol Sci. 2018;19:1135.

[7] Buendia I, Michalska P, Navarro E, et al. Nrf{1}}ARE 경로: 신경퇴행성 질환의 산화 스트레스 및 신경 염증에 대한 새로운 표적입니다. Pharmacol 치료. 2016;157:84–104.

[8] Jia XJ, Yan XS, Cai ZP, et al. 페닐에타노이드 배당체의 효과,허바 시스탄체, 수컷 SAMP8 마우스의 인지 결핍 및 항산화 활성에 관한 것입니다. J Toxicol Env Heal A. 2017;80:1180–1186.

[9] Tsvetkov DE, Dmitrenok AS, Tsvetkov YE, et al. 티크 나무 매듭의 페닐에타노이드 배당체와 항산화 활성. J Biol Active Prod Nat. 2016;6:272–281.

[10] Zhang YQ, Gao EY, Liang CQ, et al. Lindernia ruellioides의 caffeoyl phenylethanoid glycoside 화합물의 in vitro 항산화 활성. 센트 사우스 제약. 2017;15:1687–1690.

[11] Wu ZH, Ma YF, Zhao L, et al. 산화 스트레스 손상에서 Nrf{1}}ARE 경로의 역할 및 다른 신호 전달 경로와의 관계 Anim Husbandry Feed Sci. 2016;37:42–48.

[12] Zheng XK, Li J, Feng WS, et al. Gesneriaceae 연구의 발전. 친제이 신약. 2003;12:261–263.

[13] 웬 F, 리 ZD. Gesneriaceae 식물에 대한 연구 진행. 친 야생 식물 자원. 2006;25:1–6.

[14] Yan WY, Chen L, Wang JM, et al. 게스네리아과 식물의 트리테르페노이드 연구 진행. Nat Prod Res Dev. 2012;24:698–701.

[15] 한약재 회사. 중국 전통 의학 자원 기록. 중국: Science Press; 1994.

[16] Bai ZF, Wang XQ, Xiao PG 등. Gesneriaceae의 약용 식물에서 페닐에타노이드 배당체 분포. Chin J Chin Mater Med. 2013;38:4267–4270.

[17] He ZD, Lau KM, Xu HX, et al. Brandisia hancei의 페닐에타노이드 배당체의 항산화 활성. J Ethnopharmacol. 2000;71:483–486.

[18] Li L, Shi DF, Gui YG, et al. 의 항산화 활성에 관한 연구Cistanche Deserticola의 페닐에타노이드 배당체. J 안휘 농업 과학. 2009;32:15835–15836.

[19] Ju BW, Yang JH, Yan Y, et al. 의 보호 효과시스탄체의 배당체PC12 세포 손상에 대한 PARABOLA MARTINI PROTECT PC12 CELLS FROM H2O2-유도 상해 2211