파트 II.: Lsolated Ex Vivo 쥐 및 돼지 신장 Normothermic 기계 관류 모델에서 Lschemia 재관류 손상을 줄이기 위한 메트포르민 사전 컨디셔닝 및 사후 컨디셔닝
Mar 26, 2022
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Tobias M.Huink, Leonie H.Venemal, Rene A.Posma, Nynke J.de Vries, Andrie C.Westerkampl, & et al.
소개
신장 이식은 말기 신장 질환 환자를위한 선택의 치료입니다. 불행히도, 수요는 장기의 가용성보다 높습니다.2 이러한 부족으로 인해 순환기 사망 (DCD) 기증자 후 기증으로 인한 최적이 아닌 품질의 장기의 사용이 증가했습니다.5 DCD 기증자의 신장은 허혈 재관류 손상 (IRl)에 더 취약하며, 이는 지연된 이식 기능의 발생률이 상당히 높아 단기 및 장기 결과에 영향을 미칩니다.45 IRI는 혈류 손상과 후속 재 산소화로 인해 발생합니다. 이는 반응성 산소 종(ROS)의 생성을 초래하여 해로운 세포 반응의 캐스케이드를 개시한다.67 허혈의 중증도는 신장 이식 후 초기 신장 이식 실패와 강하게 상관관계가 있으며 이환률 증가에 기여한다. 따라서, 장기 검색 및 이식 동안 따뜻한 허혈(W)과 보존 동안의 냉 허혈 시간은 각각 최소한으로 유지되어야 한다. 기계 관류 전략은 장기 기증에서 허혈성 단계 동안 산소를 공급함으로써 IRI를 감소시키는 데 중추적 인 역할을 할 수 있습니다. 또한, 재관류 전(preconditioning) 또는 재관류 중(사후 컨디셔닝) 동안 가능한 보호제를 첨가할 수 있는 플랫폼을 제공하며, 단기 신장 기능 및 손상을 평가하기에 적합한 방법이다.9-11
비구아나이드메트포르민제 2 형 당뇨병 환자를 치료하기 위해 가장 많이 사용되는 경구 항 고혈당 약물입니다. 작용의 메카니즘과 흉막성 효과의메트포르민주로 미토콘드리아 호흡 사슬 내의 복합체 1의 억제로 인한 것입니다.12-14 따라서,메트포르민IRI는 포도당 저하 작용을 넘어 감쇠시킬 수 있으며, 이식과 같이 IRI가 발생하는 상황에서 장기 보호제로 제안되었습니다.15,16
이 연구의 목적은 사전 컨디셔닝 및 사후 컨디셔닝의 잠재적 인 유익한 효과를 평가하는 것이 었습니다.메트포르민쥐와 돼지 신장을 사용하는 두 개의 다른 분리 된 생체외 정상 기계 관류 (NMP) 모델에서 IRI에.
신장 영양:드래곤 허브 시스탄체
방법
쥐 연구
마리.체중이 270-300 g인 수컷 루이스 래트를 사용하였다(Harlan Laboratories, Boxmeer, 네덜란드). 흐로 닝겐 대학 (University of Groningen)의 기관 동물 관리 및 사용위원회는 연구 프로토콜 (DEC6708C)을 승인했습니다. 동물들은 네덜란드 동물 실험법에 따라 국립 보건원 (National Institute of Health)의 실험실 동물 관리 원칙에 따라 보살핌을 받았습니다.
실험 설계, 장기 검색 및 보존.총 31마리의 래트를 6개의 그룹으로 나누었다(그룹당 n=5-6; 그림 1). 모든 그룹에서, 15분의 W 및 24시간의 냉간 보존이 허혈성 손상을 유도하기 위해 사용되었다. 사전 컨디셔닝은 300 mg / kg을 투여하여 수행되었습니다.메트포르민(1,1-디메틸비구아나이드 하이드로클로라이드; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 신장절제술 12시간 및 2시간 전에 경구 위관을 통해 식염수(0.9% NaCl) 또는 식염수 단독에 용해시켰다. 식염수, 30 밀리그램/L메트포르민또는 300 밀리그램/L메트포르민후컨디셔닝제로서 향수를 첨가하였다. 300 mg / kg 체중의 농도가 선택되었습니다.이 용량으로 인해 혈청이 생깁니다.메트포르민유지 보수 중 인간에서 발견되는 농도에 해당하는 농도메트포르민치료.17
신장의 조달은 앞서 설명한 바와 같이 DCD 절차에 약간의 변화로 수행되었습니다.18 요컨대, 쥐는 2-5 % 이소플루란으로 마취되었고 개복술은 중간 선 절개를 통해 수행되었습니다. 항응고는, 500 IU 헤파린 (레오파마, 발레럽, 덴마크)을 사용하여, 등쪽 음경 정맥을 통해 투여되었다. WI의 15분 후, 좌측 신장의 신장절제술을 수행하였다. 신장 동맥과 요관은 캐뉼레이션되었다. 신장을 10 mL 식염수 (37°C) 및 5 mL 4°C 위스콘신 대학교 (UW) 콜드 스토리지 용액 (Bridge to Life, Columbia, SC)으로 계내에서 플러싱하였다. 일단 제거되면, 신장을 다시 한번 5mL UW로 플러싱하고 4°C에서 24시간 동안 UW에 저장하였다.
Normothermic 기계 관류.래트 NMP 방법은 앞서 광범위하게 기술되었다.18 간단히 말해서, NMP는 롤러 펌프(Ismatec ISM404, 취리히, 스위스)를 사용하여 90분 동안 수행되었다. 관류 압력은 102 mmHg로 설정되었고, 신장 동맥에서 조절되었다. 대조군에서, 관류 유체는 30 mmol/L HEPES, 50 g/L 알부민 및 7 mmol/L 크레아티닌(모든 시그마-알드리치)으로 보충된 100 mL 윌리엄의 배지 E로 구성되었다. 실험군에서는 30 또는 300 mg/L메트포르민향수를 첨가하였다. 관류 유체는 0.5 L/min의 흐름으로 95% 산소 및 5% 이산화탄소로 산소화되었다. 관류 유체의 온도는 수조 및 열교환기(Julabo, Seelbach, Germany)를 사용하여 37°C로 유지하였다. 유량은 보정된 유량 센서(ME1PXN Inline, Transonic Systems, Ithaca, NY)를 사용하여 10분마다 기록되었다. NMP 후, 신장의 생검은 즉시 4% 포름알데히드에 침지되거나 액체 질소에서 스냅-냉동되고 이어서 -80°C에서 저장되었다.
그림 1실험 그룹의 개략적인 표현. 그룹에는 5-7 개의 신장이 포함되어 있습니다. HMP, 저체온 기계 관류; NMP, 노멀 머신 관류; WIT, 따뜻한 허혈 시간.
돼지 연구
마리.암컷 네덜란드 Landrace 돼지의 신장은 abattoir에서 수집되었습니다. 동물들은 기절하고 현지 표준 절차에 따라 exsanguinated했다. 삼출 동안, 약 1L의 혈액을 25,000 IU 분별되지 않은 헤파린 (Leo Pharma)이 들어있는 용기에 수집하였다. 도축장 폐기물이 사용되었기 때문에 동물윤리위원회의 승인이 필요하지 않았다.
실험 설계, 장기 검색 및 보존.허혈성 손상을 유도하기 위해, 30분의 WI가 사용되었다. 이 기간 후, 신장을 4°C에서 180 mL 식염수로 플러싱하였다. 플러시 직후, 피질 생검 (Invivo, Best, 네덜란드)을 취하여 4 % 완충 포름 알데히드에 저장했습니다. abattoir에서 실험실로의 수송을 수용하고 보존 기술로서 신장 동맥을 캐뉼레이션하고 신장을 박동성 압력 조절 저체온 기계 관류 (HMP) 셋업 (Kidney Assist Transport; 오르간 어시스트, 흐로 닝겐, 네덜란드). 신장을 500mL UW 기계 관류 용액(Bridge to Life, 런던, 영국)을 사용하여 4°C에서 3시간 동안 관류시키고, 2mg을 첨가하거나 첨가하지 않고 관류시켰다.메트포르민, 25 mmHg의 평균 동맥압. 산소(100%)는 산소발생기(Hilite LT1000; Medos Medizintechnik AG, Stolberg, Germany)의 고정 유량은 0.1 L / min입니다.
Normothermic 기계 관류.신장을 이전에 기술되었던 4시간 동안 생체외 NMP 셋업을 사용하여 재관류시켰다. 우리의 연구에서, 복용량을 증가메트포르민또는 식염수를 주입 펌프를 사용하여 첨가하였다. 요컨대, HMP 후, 신장 동맥은 세척되고 플러시되었다. 요관은 소변 수집을 위해 캐뉼레이션되었다. 그 후, 신장을 칭량하고, 생검을 받아 추가 분석을 위해 4% 완충된 포름알데히드에 보관하였다. 이어서, 신장을 생체외 압력 조절된 NMP 회로에 위치시켰다. NMP는 500 mL 백혈구 고갈로 수행되었다(BioR02 플러스; Fresenius Kabi, Bad Homburg, 독일) 80mmHg의 평균 동맥압에서 4 시간 동안 산소화 된 (탄수화물, 흐름 0.5L / min) 혈액. 관류 유체에 첨가된 다른 화합물은 표 S1에 제공된다. 실험군에서는,메트포르민링거의 젖산 용액 (20 mg / mL; 박스터, 위트레흐트, 네덜란드)에 용해 된 주입 프로파일을 정의 할 수있는 맞춤형 소프트웨어에 의해 제어되는 주입 펌프를 사용하여 주입되었습니다 (Alaris; CareFusion, Rolle, 스위스). NMP 동안 매 30분마다, 주입 속도는 미리 지정된 스케줄에 따라 증가하였다(표 S2). 이러한 스케줄은 다음을 나타내는 인간 약동학 데이터에 기초하였다.메트포르민클리어런스는 크레아티닌 클리어런스보다 네 배 더 높다.19 대조군에서는 신장을 첨가하지 않고 관류시켰다.메트포르민. 각 실험에 대해, 클램폰 플로우 프로브(ME7PXL; Transonic Systems), 이는 신장 동맥에 가까운 튜빙에 부착되었다. 이 유량 프로브는 사용된 튜브에 대해 교정되었습니다. NMP 동안 매 15분마다, 소변을 수집하고, 상응하는 부피의 링거스 락테이트 용액으로 대체하였고, 이는 또한 기록되었다. 관류 유체의 온도는 수조(Julabo)에 연결된 통합 열교환기를 사용하여 37°C로 유지하였다. 혈액 및 소변 샘플을 생화학적 분석을 위해 15분 및 60분 후에 그리고 다음 시간마다 채취하였다. NMP가 종료되면 생검을 취하여 4% 완충 포름알데히드에 보관하거나 스냅 냉동하여 추가 분석을 위해 -80°C에 보관했습니다.
두 연구 모두
생화학 분석.퍼퓨세이트 및 소변 샘플을 원심분리(래트 모델에서 10분 동안 1,300 g, 돼지 모델에서 1,000 g, 둘 다 4°C에서 12분 동안)하고, 상층액을 -80°C에서 저장하였다. 젖산 탈수소효소(LDH), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(ASAT), 크레아티닌을 표준 생화학적 분석을 사용하여 흐로닝겐 대학 의료 센터의 실험실 센터에 의해 각각 소변에서 향수 및 크레아티닌으로 측정하였다. 쥐 소변에서 배설되는 단백질의 양은 피어스 BCA 단백질 분석 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 사용하여 측정되었지만 돼지 소변의 총 단백질 농도는 실험실 센터의 표준 생화학 분석을 사용하여 측정되었습니다.
실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응.실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 앞서 기술한 바와 같이 Tagman Applied Biosystems 7900HT RealTime PCR 시스템에서 표준 절차에 따라 수행되었다.20혈관 톤 조절에 관여하는 유전자 단편의 증폭(엔도텔린 1(EDN-1, ET-1에 대한 인코딩); 내피 산화질소 합성효소(eNOS); 및 크뤼펠 유사 인자 2(KLF-2), 내피 활성화(폰 빌레브란트 인자(wWF), 혈관 세포 부착 분자 1(VCAM-1) 및 IL-6), 및 열충격 단백질 70(HSP-70)은 표 S3.In 에 열거된 프라이머 세트로 짧게 수행되었고, 총 RNA는 TRlzol(Life Technologies, Gaithersburg, MD)을 사용하여 신장 절편으로부터 추출되었다. 래트로부터 수득된 cDNA를 프라이머 효율을 시험하기 위해 PCR 동안 내부 참조로서 사용하였다. 유전자 발현은 β-액틴 mRNA 함량의 평균으로 정규화되었다. 결과는 2-△ACT로 표현되었고, 여기서 CT 값은 사이클 역치의 차이를 나타낸다.
그림 2관류 및 신장 기능 매개 변수는 쥐와 돼지 신장의 정상 발열 기계 관류 중 및 이후에 평가됩니다. 쥐 (a)와 돼지 (b) 신장의 총 크레아티닌 제거. 총 소변 생산 (c, d) 및 쥐와 돼지 신장의 소변 (e, f)에서 배설되는 총 단백질. 데이터는 평균의 평균 ± 표준 오차로 표시됩니다. 그룹에는 5-7 개의 신장이 포함되어 있습니다. *P< 0.05="" and="" **p=""><>
형태학적 점수.4% 포름알데히드에 저장된 생검을 파라핀에 포매하고 4 μm 조각으로 절단하였다. 쿠페는 이후 주기적인 산 쉬프로 염색하고 근위 관상 세포 괴사 (경증에서 중증까지 : 1-5), 부종 (경증에서 중증까지 : 1-4), 근위 관형 세포 진공 (경증에서 중증까지 : 1-4에 이르기까지)에 대해 점수가 매겨졌습니다.21 조직 병리학 적 평가는 두 명의 연구자에 의해 맹목적으로 수행되었습니다. 쥐와 돼지 장기의 기계 관류 후 부상의 조직 병리학 적 징후를 평가하는 데 광범위한 경험을 가진 독립적 인 임상 병리학자가 점수를 검증했습니다.
계산.신장내 혈관 저항성(IVR)은 평균 동맥압을 흐름(mmHg/mL 분으로 표시)으로 나눔으로써 계산하였다. 크레아티닌 클리어런스는 다음 방정식을 사용하여 사구체 여과율을 추정하기 위해 계산되었다:[소변에서의 크레아티닌]* 소변 흐름/[향수에서의 크레아티닌].
통계 분석.모든 데이터는 평균의 평균± 표준 오차로 표현됩니다. 단일 시점에서 두 그룹을 비교할 때, 차이는 짝을 이루지 않은 스튜던트 t-테스트를 사용하여 평가되었습니다. 총 소변 생산, 형태학적 점수 및 유전자 발현에 대한 차이는 분산 분석을 사용하여 시험하였다. 모든 통계적 검정은 양꼬리이고 P≤ 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. SPSS 통계 버전 23 (IBM, Armonk, NY)은 모든 분석에 사용되었습니다. 곡선 아래의 면적 (AUC)은 사다리꼴 규칙에 따라 계산되었고, 총 크레아티닌 클리어런스, 소변에서 배설되는 단백질의 총량, 및 향수 내의 ASAT 및 LDH의 총 수준을 근사화하기 위해 사용되었다.
참고 : 전통적인 중국 약초 cistanche ( "용 허브"및 "사막 인삼"이라고도 함)는 건조하고 따뜻한 사막에서만 자랍니다. 아홉 가지 불멸의 허브 중 하나인 시스탄체(시스탄체 튜불로사/시스탄체 데저디콜라/데저리빙 시스탄체/시스탄체 살사)는 에키나코사이드, 액테오사이드, 토탈 페닐에타노이드 배당체, 플라보노이드, 다당류 등과 같은 풍부한 유효 성분을 함유한 함량으로 시스탄체를 사람의 면역력, 내부 장기, 뇌세포와 뉴런 등을 위한 귀중한 영양 허브이자 식품 소재로 만들었습니다. 현대 약리학 적 연구는 cistanche의 다음과 같은 효과 (cistanche의 이점)를 확인했습니다 : 면역 개선; 성적 기능과 신장 기능을 향상; 안티 피로; 노화 방지; 기억력 향상; 항 파킨슨 병; 항알츠하이머병; 항산화; 편의-변비; 항염증제; 뼈 성장을 촉진, 미백 피부; 간을 보호; 등.
