Part Ⅰ 식이단백질과 식이섬유가 새끼기러기 장신축의 성장능력, 통풍발생, 장내미생물군집 및 면역조절에 미치는 영향
May 06, 2023
추상적인
현재 연구는 새끼 기러기의 장-신장 축에서 성장 성능, 통풍 발생, 장내 미생물 군집 및 면역 조절에 대한 식이 단백질 및 섬유질 수준의 영향을 평가했습니다. 2개의 CP 수준(180[18CP] 및 220[22CP] g/kg) 및 3개의 조섬유(CF) 수준(30[낮은 CF], 50[mid-CF], 및 70[높은 CF]g/kg). 높은 CP 또는 낮은 CF 식단은 새끼 기러기에게 통풍에 걸리기 쉽습니다. 고단백 식단은 신장 기능을 악화시켰습니다. 22% CP 사료를 먹인 9-일된 새끼 기러기에서 UA 및 Cr의 혈청 농도와 XOD 활동이 크게 증가했습니다. 3~7%의 CF 수치가 신장 건강에 직접적인 영향을 미치지는 않았지만 CF 수치를 높이면 새끼 기러기의 맹장에서 프로바이오틱스의 증가를 가속화하고 악성 박테리아를 억제하여 고단백 식단으로 인한 장내 세균 불균형을 완화할 수 있습니다. 16Sr RNA 시퀀싱을 통한 맹장 미생물총 분석 결과, 22CP 그룹의 엔테로코쿠스 풍부도는 18CP 그룹보다 높지만 d 9에서 CF 수준이 증가함에 따라 감소하는 것으로 나타났습니다. 락토바실러스의 풍부도는 CF 수준이 증가함에 따라 증가했습니다. 또한 맹장, 편도선 및 신장 조직에서 더 높은 혈청 LPS 및 전염증성 사이토카인 농도와 상향 조절된 mRNA 발현 수준은 고단백 식단이 어린 새끼 기러기에서 TLR4/MyD88/NFkB 경로를 활성화하고 장 및 신장 염증을 모두 유발할 수 있음을 나타냅니다. d 9의 혈청 LPS 농도는 CF가 증가함에 따라 감소하는 것으로 나타났지만 식이 CF 수준을 변경해도 새끼 기러기의 혈청 면역 지수에는 직접적인 영향을 미치지 않았습니다. 결론적으로 높은 CP 식단은 새끼 기러기의 장-신장 축에서 통풍 발생, 미생물 군집 및 면역 조절에 부정적인 영향을 미쳤으며, 적절하게 증가된 식이 섬유 수준은 장 균형 유지 및 혈청 LPS 농도 감소에 도움이 되었습니다. 새끼 기러기 사료를 위한 최적의 조합으로 18% CP와 5% CF의 식단을 제안합니다.
키워드
조섬유, 단백질, 거위 통풍, 장내 미생물 군집, 장-신장 축,Cistanche의 장점.
알고 싶다면 여기를 클릭하세요Cistanche가 신장에 미치는 영향은 무엇입니까
소개
초식성 거위는 정상적인 활동을 하기 위해 식이섬유에 의존한다. 식단에서 적당한 조섬유(CF) 수준은 장내 미생물 균형을 조절하고 면역 기능을 강화하여 질병 저항성을 강화하고 가금류의 성장을 촉진하는 것으로 알려져 있습니다(Jha and Mishra, 2021) Wils-Plotz et al. (2013). 식이 pectin을 포함하면 회장 점막에서 IL- 12 발현이 증가하고 맹장 편도선에서 인터페론-g 생성이 증가한다고 보고했습니다. 여러 연구에 따르면 낮은 CF 식단은 70일에 거위 맹장에서 유익한 미생물군이 상대적으로 풍부할 뿐만 아니라 미생물 다양성을 감소시켜 이들 거위의 성장 성능, 영양소 이용 및 장 점막 면역에 부정적인 영향을 미칩니다(Li et al., 2017; Li 등, 2018a). 식이 CF는 점막 구조와 기능을 강화하고 위장관에서 공생 박테리아의 개체수와 다양성을 증가시켜 장 장벽 기능을 유지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 더 중요한 것은 어린 새가 성인보다 식이 영양소 및 장내 미생물 군집의 변화에 더 민감한 것으로 보고되었습니다(Gao et al., 2017). 그러나 새끼 기러기의 장내 미생물과 질병 저항성에 대한 식이 CF 수준의 영향에 대한 연구는 거의 없습니다.
가금류의 성장 성능은 원래의 자발적 성질을 만족시키기 위한 사료의 식이 에너지 변화보다 단백질 수준의 변화에 덜 민감합니다(Shi et al., 2006). 16~22% 범위의 식이 단백질 수준을 가진 거위에서 체중 증가의 유의미한 차이가 관찰되지 않은 것으로 보고되었으며, 이는 범위가 지나치게 일반적인 것으로 보입니다(Summers et al., 1986). 반대로, 식이 단백질의 농도는 가금류의 장내 세균총 균형과 질병 저항성에 강한 영향을 미칩니다(Lee et al., 2020). 주로 조류에서 발생하는 내장 통풍은 신장 기능이 저하되어 여러 장기에 요산염 결정이 축적되어 발생하는 대사성 질환이다(Zhang et al., 2018). 우리의 이전 연구는 고단백 식단이 새끼 기러기의 통풍과 관련된 신장 손상 및 장내 미생물 불균형과 관련이 있음을 보여주었습니다(Xi et al., 2020a). 이 연구의 결과에 따르면 16% 및 18% 조단백질(CP) 사료를 먹인 새끼 기러기와 비교하여 22% CP 사료를 먹인 새끼 기러기는 장 상피 세포 손상 및 맹장 미생물 불균형으로 인해 신장 손상 또는 심지어 통풍을 유발하는 것으로 나타났습니다. 위장관 미생물군과 그 대사산물은 가금류의 장-신장 축의 면역 강화에 중심적인 역할을 하는 것으로 보입니다(De Cesare et al., 2019; Xi et al., 2020b). 따라서 식이 CF 및 CP 수준의 영향에 초점을 맞춘 적절한 영양 프로그램을 확인하면 통풍 발생을 최소화하고 장내 미생물 균형을 유지하고 새끼 기러기의 상대적 면역 조절을 개선하여 면역력을 향상시키는 데 도움이 될 수 있습니다.
장내 마이크로바이옴은 전신 면역에 영향을 미치고 면역 균형에 기여하는 장 면역 조절에 중대한 영향을 미칩니다. CP 및 CF 수준을 포함한 식이 구성의 변화는 장 환경에 적응하는 미생물의 구성 및 대사 활동에 영향을 미칩니다(Liu et al., 2014). 가금류에서 미생물의 파괴는 전신 면역의 불균형을 유발하여 질병 저항력 감소에 기여할 수 있습니다. 우리의 이전 연구에서 우리는 장내 미생물 불균형이 염증을 증가시키고 장-신장 축에서 장 유래 지질다당류(LPS)의 전좌를 증가시켜 새끼 기러기의 내장 통풍 위험을 증가시킨다는 것을 발견했습니다. 이 복잡한 캐스케이드에서 LPS 결찰은 핵 인자, 활성화된 B 세포(NF-kB) 경로의 카파-경쇄 강화제 및 인터루킨 1b(IL1b) 및 종양 괴사 인자와 같은 전염증성 사이토카인의 생성을 활성화합니다. a(TNFa), 따라서 새끼 기러기의 장과 신장 모두에서 면역 내성 발달을 촉진합니다(Xi et al., 2019). 본 연구는 다양한 수준의 CP와 CF를 먹인 새끼 기러기의 맹장에 서식하는 미생물 군집을 조사하는 데 중점을 두었고 장-신장 축에서 유도되는 면역 조절 및 염증 반응을 분석하여 통풍 발생의 변화를 측정했습니다.
표준화된 시스탄체
재료 및 방법
1. 윤리적 승인
이 연구는 장쑤성 농업 과학원 연구 위원회의 승인을 받았으며 실험 동물에 관한 관리 규정(2014년 7월 8일자 장쑤성 농업 과학원 명령 번호 63)에 따라 수행되었습니다. 모든 실험은 ARRIVE(Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) 지침에 따라 수행되었습니다.
2. 실험 설계
본 연구는 2020 11월 2일부터 17일까지 Jiangsu 농업과학원 실험동물센터(중국 난징)에서 진행되었다. Tianzhijiao Breeding Geese Limited Company(Chuzhou, China)에서 공급한 총 1,620마리의 1일된 Taizhou 거위(Anser domestica, 100% ,)를 6개의 실험군. 각 처리에는 6개의 복제가 있었고 각 복제에는 45마리의 새가 포함되었습니다. 완전히 무작위화된 2Ⅹ3 요인 설계가 실험에 사용되었습니다. CP 수준이 2개이고 CF 수준이 3개인 6가지 식단을 준비했습니다(표 1). 2개의 CP 수준은 180(18CP) 및 220(22CP) g/kg이었고 3개의 CF 수준은 30(낮은 CF), 50(중간 CF) 및 70(높은 CF)이었습니다. CF) g/kg. 모든 새끼 기러기는 동일한 크기(1.20 £ 1.00 £ 0.50 m3, 우리당 새끼 기러기 9마리, 수용 밀도: 7.5마리/m2)의 스테인리스 스틸 케이지가 있는 자동 온도 조절식 축사에서 사육되었으며 지상 0.50m 높이에 배치되었습니다. 새끼 기러기들은 표준 관리 조건 하에서 펠렛 사료와 물을 자유롭게 먹였습니다. 각 케이지에 매달린 먹이통과 젖꼭지 급식기의 수는 연구 기간 내내 충분했습니다. 주변 온도는 실험이 끝날 때까지 d 0에서 3까지 30도, d 4에서 6까지 29도, d 7에서 9까지 28도, d 10부터 26도를 유지하였다. 21-d 실험 기간 동안의 상대 습도는 약 60%였습니다. 광원(백색광, 400-760nm)은 d0에서 3까지 22시간, d에서 18시간의 빛 일정으로 새 머리 수준에서 15 § 0.3lux의 조도로 균등화되었습니다. 4에서 14, 24-h 주기에서 d 15에서 21까지 16시간의 빛.
The basal diet was formulated to meet or exceed National Research Council (NRC, 1994) nutrient requirements for growing geese. The composition of experimental diets is presented (Table 1). Dietary samples (>5개소에서 무작위로 채취한 사료 1%)를 혼합하여 분석하였다. CP 및 CF는 GB/T6432(중국 국가 표준: 사료 내 조단백질 측정) 및 GB/T6434(중국 국가 표준: 사료 내 조섬유 측정)에 따라 측정되었습니다.
새끼 기러기의 ADFI와 BW(생체중)는 실험 중 먹이를 주기 전에 전자 저울(YP60001, Hengji, Shanghai, China)을 사용하여 기록했으며 실험 종료 시 ADG와 사료 전환율(FCR)을 계산했습니다. 또한, 다른 처리 중에서 모든 복제물(각 복제물에는 45마리의 새가 포함됨)의 통풍의 누적 이환율이 실험 기간 후에 합산되었습니다. 통풍에 대한 선택 기준은 육안적 신장 병변 및 요산염 과포화의 한계값(수컷, 416mmol/L 및 암컷, 357mmol/L) 이상의 혈청 요산(UA) 농도를 나타내는 새끼 거위로 정의되었습니다. 신장의 전형적인 우세 육안 병변은 창백하고 얼룩덜룩하며 부풀어 오르고 세뇨관과 요관은 과도한 요산염으로 팽창됩니다(Xi et al., 2020a).
허바 씨스탄체
3. 혈청 대사체 측정
36마리의 새끼 기러기(n=6마리 새끼/치료)는 각각 d 9 및 18에 항응고제 없이 혈액 수집 튜브를 통해 참수 후 즉각적인 혈액 수집(5 mL/gosling)을 위해 무작위로 선택되었습니다. 모든 혈액 샘플은 수집 후 37도에서 2시간 동안 배양하고 1,5{{10}}0 £ g에서 15분 동안 원심분리했습니다. 얻은 혈청은 추가 분석까지 80도에서 0.6 mL Eppendorf 튜브에 보관했습니다. 혈청 UA 수준은 인텅스텐산 비색법을 사용하여 결정되었습니다. 크레아티닌(Cr) 및 요소 질소(UN)의 농도 및 크산틴 산화효소(XOD) 활성은 마이크로플레이트 분광광도계(Promega Corporation, Madison, WI)를 사용하여 효소 비색계를 통해 결정되었습니다. 이 키트는 Jiancheng Bioengineering Institute (중국 난징)에서 공급했습니다. 코드는 C012(UA), C011-2(Cr), C013-2(UN) 및 A002(XOD)였습니다. 실험 거위의 혈청 IgM, IgA 및 IgG 농도는 Shanghai J&I Biotechnology Co., Ltd(Shanghai, China)에서 구입한 거위 면역글로불린 ELISA 키트를 사용하여 측정했습니다. 혈청 순환 면역 복합체(CIC), IL-1b 및 TNF-a 농도는 상업용 거위 ELISA 키트(Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China)를 사용하여 결정되었습니다. DAO(diamine oxidase)의 활성은 자동 생화학 분석기(Hitachi, Tokyo, Japan)를 사용하여 효소 비색법을 통해 측정되었습니다. 혈청 LPS는 전통적인 Limulus 분석(Limulus Assay Biotechnology Company Ltd., Xiamen, China)을 사용하여 측정되었습니다. Limulus 분석에서 LPS의 검출 범위는 0.015~0.6 EU/mL 범위였습니다. 혈액 채취 및 내독소 측정에 사용된 모든 물질은 발열원이 없었습니다. 모든 분석은 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다. 혈청 샘플을 3회 시험하였다. 분석에 대한 분석 내 및 분석 간 변동 계수는<10% and <15%, respectively.
4. 조직형태학적 관찰
조직학적 분석을 위해 d 9 및 18에 혈액 샘플 수집 후 36마리의 새끼 기러기(n=6마리 새끼/치료)의 맹장(길이 {{0}} cm)을 수집했습니다. 새끼 기러기로부터 채취한 샘플을 4% 파라포름알데히드에 고정하고 파라핀에 포매한 다음 절편화했습니다(슬라이스 두께: 3mm, 새끼 기러기당 4슬라이스). 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색 후 맹장의 병리학적 변화(유문 괄약근 원위 약 7cm)를 광학 현미경(OLYMPUS, Tokyo, Japan)으로 검사했습니다. 맹장의 Villus 높이와 선와 깊이는 ImageJ 소프트웨어(버전 1.8.0; National Institutes of Health, Bethesda, MD)를 사용하여 측정되었습니다. 슬라이스당 서로 다른 온전한 융모의 8가지 측정값이 기록되었습니다(3개의 연속적인 시야에서 8가지 측정값). 새끼 기러기당 평균 32회 측정(거위당 4회 측정 및 슬라이스당 8회 측정)을 기준으로 조직학적 측정의 통계 분석을 수행했습니다. 술잔 세포 밀도는 술잔 세포 수를 해당 융모 길이로 나눈 값으로 계산한 다음 평균을 내어 융모 길이 100mm당 술잔 세포 수로 표시했습니다.
시스탄체 튜불로사
5. 맹장 내용물의 16S rRNA 시퀀싱
새끼 기러기의 맹장 내용물(6마리 새끼/치료 £ 6 그룹 £ 2회=72 새끼 기러기 샘플링)은 9일과 18일에 2mL 멸균 내부 나사산 극저온 바이알에 수집하고 16S rDNA 분석을 위해 즉시 액체 질소에 보관했습니다. . 제조사의 지침에 따라 MicroElute Genomic DNA 키트(D3096-01, Omega Biotek Inc., Norcross, GA)를 사용하여 맹장 내용물 샘플의 DNA를 추출했습니다. 사용하지 않은 면봉으로 구성된 샘플 블랭크는 DNA 추출을 통해 처리되었으며, 16S 앰플리콘이 생성되지 않는 것을 확인했습니다. 전체 DNA는 제조업체(QIAGEN, Dusseldorf, Germany)에서 설명한 수정된 절차를 사용하여 용출 버퍼 50mL에서 용출하고 80도에서 보관했습니다.
샘플의 전체 DNA를 주형으로 하고 16S rDNA 프라이머(343F - 50 - TACGGRAGGCAGCAG -30; 798R - 50 - AGGGTATCTAATCCT-30 )를 사용하여 박테리아의 V3-V4 영역을 증폭했습니다. 16S rRNA. 모든 반응은 25 ng의 genomic DNA extract, 12.5 mL의 PCR Premix, 2.5 mL의 각 프라이머, 그리고 부피를 조절하기 위한 PCR 등급의 물을 포함하는 25 mL(총 부피) 혼합물에서 수행되었습니다. PCR 산물은 AxyPrep Mag PCR Normalizer(Axygen Biosciences, Union City, CA)를 사용하여 표준화되었으며, 이를 통해 시퀀싱을 위해 제출된 PCR 볼륨에 관계없이 정량화 단계를 건너뛸 수 있었습니다. Amplicon 풀은 AMPure XT 비드(Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA, OebioTech Co., Ltd, Shanghai, China)를 사용하여 시퀀싱을 위해 준비되었습니다. 앰플리콘 라이브러리의 크기와 양은 각각 LabChip GX(Perkin Elmer, Waltham, MA) 및 Kapa Library Quantification Kit for Illumina(Kapa Biosciences, Woburn, MA)를 사용하여 평가되었습니다. PhiX Control 라이브러리(v3)(Illumina)는 amplicon 라이브러리와 결합되었습니다(30% 예상). 라이브러리는 약 570K/mm2의 밀도로 클러스터링되었습니다. 라이브러리는 300PE MiSeq 실행에서 시퀀싱되었으며, 여기서 하나의 라이브러리는 표준 Illumina 시퀀싱 프라이머를 사용하여 두 프로토콜로 시퀀싱되었으므로 세 번째(또는 네 번째) 인덱스 판독이 필요하지 않습니다. 읽기는 미생물 생태학(QIIME;) 품질 필터에 대한 정량적 통찰력을 사용하여 필터링되었습니다. CDHIT 파이프라인은 OTU 테이블을 준비하여 운영 분류 단위(OTU)를 선택하는 데 사용되었습니다. 유사성이 97%인 서열이 OTU에 할당되었습니다. 각 OTU에 대해 대표 서열을 선택한 다음 RDP(Ribosomal Database Project) 분류기를 사용하여 각 대표 서열에 분류학적 데이터를 할당했습니다. 이러한 OTU 뉴클레오티드 서열의 GenBank 접근 번호는 SAMN21014082입니다. 알파 다양성을 추정하기 위해 OTU 테이블을 희소화하고 다음 4가지 메트릭을 계산했습니다. 풍부함을 추정하기 위한 Chao1 메트릭; 샘플에서 발견된 고유한 OTU의 수로서 측정된 관찰된 종; 섀넌 지수; 그리고 심슨 지수.
6. 실시간 PCR
실시간 PCR(RT-PCR) 분석을 위해 9일과 18일에 n {0}} 새끼 기러기/처리)를 수집했습니다. TRIzol 시약(Life Technologies, Grand Island, NY)을 사용하여 조직에서 총 RNA를 추출하고 제조업체의 프로토콜에 따라 Reverse Transcription Levels 키트(TaKaRa, Dalian, China)를 사용하여 역전사했습니다. b-actin은 불변 대조군으로 사용되었습니다. 프라이머는 Primer Premier 5.0 소프트웨어를 사용하여 설계되었으며 해당 시퀀스가 나열되어 있습니다(표 2). RT-PCR은 SYBR Premix Ex Taq(Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 수행되었습니다. 모든 RT-PCR은 3회 수행되었습니다. 표적 유전자의 상대적 발현 수준은 2 DDCt 방법을 사용하여 결정하였다.
7. 데이터 분석
IBM SPSS Statistics 16 프로그램(IBM Corporation, Somers, NY)을 사용하여 처리당 6개의 복제에서 파생된 실험 데이터를 분석했습니다. 각 복제는 실험 단위로 간주되었으며 사용된 통계 절차는 일반 선형 모델 절차(GLM)를 사용하는 분산의 다변량 분석이었습니다. 유의한 차이가 확인되면 Duncan's multiple-range test를 이용하여 치료수단을 구분하여 비교하였다. 양측 테스트는 5% 미만의 확률 수준에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다(P < 0.05).
Yumeng Xi *, Yuanpi Huang,y Yue Li *, Yunmao Huang #, Junshu Yan * 및 Zhendan Shi *.
* 중국 난징 210014, Jiangsu Agricultural Sciences, Animal Husbandry Institute, Agriculture and Rural Affairs의 농작물 통합 영농을 위한 핵심 연구소;
# Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510000, China 동물 과학 대학.