PART Ⅰ: 염증 과정이 족세포에서 WT1의 발현과 국소화를 조절하여 신장 손상을 유발합니다
Mar 23, 2022
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MARIELA ARELLANO-RODRÍGUEZ, PABLO ZAPATA-BENAVIDES & ET AL.
소개
윌름의 종양{0}} 유전자(WTI)는 족세포의 생존과 비효율적인 신장 여과에 관여하는 주요 유전자 중 하나입니다. 염증 과정은신장실패이것은 WT1(윌름의 종양{0}} 유전자). WT1(윌름의 종양{0}} 유전자) 엑손 5(17AA±) 및 엑손 9(KTS±)(1)에서 대체 스플라이싱에 의해 4개의 주요 이소형을 갖는 징크 핑거 단백질인 전사 인자를 인코딩합니다. KTS-isoform은 DNA에 대해 더 높은 친화도를 가지며, KTS plus는 세포질에서 spliceosome 단백질과 공동 국소화됩니다(2, 3).WT1(윌름의 종양{0}} 유전자)는 주로 생식선과 배아 발생에 중요한 역할을 합니다.신장개발; 성인에서 발현은 특수화된 내장 세포로 제한됩니다.신장(podocytes) 및 podocalyxin, nephrin(NPHS1) 및 paired-box 전사 인자(4-6)와 같은 여러 유전자를 유지하고 조절하는 데 필수적입니다. WT1 발현의 돌연변이 또는 감소는 네프린 및 포도칼릭신의 발현 감소로 이어질 수 있으며 사구체 경화증(5, 7-10)과 같은 신병증과 관련이 있습니다.
신증후군은 소아에서 가장 흔한 신증후군으로, 조직학적 분류는 최소 신변화, 국소 분절 사구체 경화증, 미만성 간질 경화증으로 나뉘며, 스테로이드에 대한 반응 정도에 따라 감수성 및 저항성 신증후군으로 분류된다(11). .
WT1(윌름의 종양{0}} 유전자)는 신증후군 환자의 10-15%에 영향을 미치는 희귀 질환인 스테로이드 내성 신증후군이 있는 소아에서 흔히 보고됩니다(12,13). 산발성 신증후군이 있는 모든 소아의 약 80%가 스테로이드 치료에 반응하지만 WT1(윌름의 종양{0}} 유전자) 대규모 코호트 연구에서(14). 스테로이드에 민감한 신증후군 환자에서 스테로이드 내성 신 증후군의 발현 감소 및 그보다 적은 정도(15). 지질다당류(LPS)에 의해 유도된 전신 염증의 쥐 모델에서, LPS 투여 24시간 후, WT1(윌름의 종양{0}} 유전자)은 세포질로 전위되었고 족세포에서 슬릿 횡경막을 유지하고 정확한 사구체 여과에 필수적인 nephrin의 발현 감소와 연관되어 WT1(윌름의 종양{0}} 유전자) nephrin 유전자를 상향 조절하는 전사 인자로 작용합니다(16).
종양 괴사 인자-알파(TNFa)로 치료한 A459 폐암 세포에서 WT1(윌름의 종양{0}} 유전자) 단백질이 세포질로 바뀌는 것이 관찰되었으며, 이는 염증 자극이 세포 내 국소화 및 전사 기능을 변경할 수 있음을 시사합니다(17). 인산화는 WT1(윌름의 종양{0}} 유전자) WT1(윌름의 종양{0}} 유전자) 징크 핑거 도메인에서 Ser{4}} 및 Ser{5}}의 cAMP 의존성 단백질 키나아제 매개 인산화에 의한 DNA 결합(18)(19).
패혈증은 전신 염증 반응의 결과이며 감염에 의해 유도된 친염증성 및 항염증성 사이토카인의 방출을 특징으로 합니다. 급성 신장 손상은 급성 염증이 있는 중환자에서 흔하며 만성 신장 손상의 진행과 밀접한 관련이 있습니다(20,21). 염증이 다음을 포함한 다양한 기관의 손상에 중요한 역할을 한다는 증거가 있습니다.신장(22). 이 연구에서 우리는 WT1(윌름의 종양{0}} 유전자) 발현 및 세포질로의 전위.
cistanche tubulosa 혜택: 항종양 및 항염종양
재료 및 방법
동물 모델. 암컷 BALB/c 마우스(8-10주령)는 Harland Mexico(Mexico City, Mexico)에서 입수했습니다. 마우스를 통제된 실내 온도, 습도 및 빛(12/12h 명암 주기)하에 물과 음식을 임의로 가두었습니다. 대장균 O111:B4(Sigma Aldrich, Toluca, Mexico City, Mexico)의 LPS 및 단일 LPS 주사는 8 mg/kg의 용량으로 복강 내로 투여되었습니다(16). 식염수 용액은 처리되지 않은 대조군 마우스에 사용되었습니다. 12, 24, 36, 48 및 72시간에 200mg/kg의 펜토바르비탈 나트륨 용액을 복강 내 주사하여 마우스를 희생시켰고, 각 시점에 n{14}}을 표시한 다음신장조직과 혈액을 수집했습니다. 동물을 희생시키기 전에 소변을 수집했습니다.
두 마리의 마우스신장외식편에 2일마다 1mg/kg의 LPS를 주입하여 만성신장 부상양성 대조군으로 (21). 모든 실험은 생물 과학 학부 동물 관리 및 사용 위원회(CEIBA{1}})의 사전 승인에 따라 수행되었습니다.
신장이식. 로부터신장Krebs Henseleit bicarbonate(KB) 완충액의 일정한 흐름으로 4도에서 Krumdieck 조직 슬라이서(Alabama Research and Development, Munford, AL, USA)로 BALB/c 마우스의 조직 조각을 250-300 um 두께로 준비했습니다. 그것은 5% CO2로 폭기되었습니다. 슬라이스는 4도에서 KB 버퍼에서 수확되었습니다.신장외식편을 12-웰 플레이트에 10% 소 태아 혈청과 5% 항생제 항진균제가 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지/F12 배지로 플레이팅하고 37℃, 5% CO, 25℃에서 교반하면서 배양했습니다. rpm. 외식편을 10ng/ml의 TNFα(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), 20ng/ml의 인터루킨 1(IL1; R&D Systems) 및 100ng/ml의 LPS로 처리하고 6, 12에서 분석했습니다. 그리고 24시간 후.
소변 단백질. 소변 샘플은 위의 각 시점에서 수집되었습니다. 단백질 농도는 DC Protein Assay kit(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 측정하였고, 알부민뇨는 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 소 혈청 알부민의 밴드 크기를 기반으로 평가하였다(16).
전염증성 사이토카인. IL6, IL1 및 TNFa의 수준은 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석 키트(PeproTech, Mexico City, Mexico)를 사용하여 측정되었습니다.
정량적 중합효소연쇄반응(qPCR) 제조업체의 지침에 따라 Trizolw Reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 신장 조직에서 총 RNA를 분리했습니다. 단일 가닥 cDNA는 제조업체의 지침에 따라 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 역전사하여 합성했습니다. Real-Time PCR은 TaqMan 유전자 발현 분석과 함께 7500 Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 수행되었습니다. 비교 실시간 PCR 분석은 각 샘플에 대해 3회 수행되었습니다. WT1(윌름의 종양{0}} 유전자) 전달:5-TCTGCGG AGCCCAATACAG-3'; reverse:5-CACATCCTGAATGCCTCT GAAGA-3'; 및 probe FAM:5-CACCGTCGTGTGTATT-3'NFQ;프로토콜은 94도에서 10분 동안 95도, 40사이클 동안 수행되었습니다. 30초 동안 30초 동안 64℃. WT1(윌름의 종양{0}} 유전자) 유전자는 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH) 유전자(Applied Biosystems)가 정규화에 사용되는 등식 2-AACT(23)를 사용하여 계산되었습니다.
신장 질환 치료 cistanche 추출물
네프린 mRNA의 발현은 3ug의 cDNA 및 다음 프라이머로 결정되었습니다. 정방향: 5'-CCCCAACATCG ACTTCACTT-3' 및 역방향: 5'-GGCAGGACATCCATGTAGAG-3' 94도에서 30초,60 30초 동안 도도 및 30초 동안 72도 도수(372 bp)(16). GAPDH의 발현을 위해 사용된 프라이머는 다음과 같습니다. 정방향:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC{18}}', 역방향:5'- TCCACCACCC TGTTGCTGTA-3', 하기 반응 조건: 40초 동안 94도, 30초 동안 60도 및 40초 동안 72도, 35주기(452bp). WT1(윌름의 종양{0}} 유전자): 5'-CACATGAGAGAAACGCCCCTTCATGTG-3' 역방향 5'-TTTGAGCTGGTCTGAACGAGAAA-3' 40초 동안 94도, 30초 동안 64도, 30초 동안 72도에서 35주기(160bp). WT1(윌름의 종양{0}} 유전자) 동형 KTS± 및 17 AA±(17 AA 플러스 /- 및 F{5}}R3을 검출하기 위한 F2-R2 프라이머, KTS 플러스 /-스플라이싱 동형 검출용)는 Oji et al에 따라 기존의 PCR에 의해 수행되었습니다. .al.(24). -actin의 발현 측정은 Lauxet al. (25). 생성물은 KTS±이소형에 대해 10% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하고 17AA±이소형에 대해 2% 아가로스 겔을 사용하여 관찰되었다.
면역형광. 그만큼신장LPS로 처리된 마우스와 대조군에서 얻은 10% 포르말린에 고정하고 헤마톡실린 및 에오신 염색, 면역조직화학 및 면역형광을 위해 처리했습니다.
WT1(윌름의 종양{0}} 유전자) LPS로 처리한 마우스에서{{0}}마이크로미터 두께의 신장 조직 섹션을 현미경 슬라이드에 장착하여 사용했습니다. 표본을 탈랍하고 Triton X-100[인산염 완충 식염수(PBS)에 1% 시트르산 나트륨을 포함하는 0.1% Triton]으로 투과화하고 PBS로 3회 세척했습니다. 조직을 PBS 중 20% 소 태아 혈청으로 30분 동안 차단하고 WT1(윌름의 종양{0}} 유전자) sc{0}}(F{1}})(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) PBS의 10% 소 태아 혈청에 1:100으로 희석했습니다. PBS로 세척한 후 결합된 항체의 존재는 염소 항-마우스 IgG Texas Red sc-2979(Santa Cruz Biotechnology)로 염색하여 확인했습니다. 슬라이드는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌로 대조염색되었습니다. 마지막으로 슬라이드를 장착하고 40x water immersion 대물렌즈와 Fluoview 4.0a 소프트웨어(Olympus, Tokyo, Japan)가 있는 Olympus BX61W1 공초점 현미경을 사용하여 정성적으로 검사했습니다.
면역조직화학. 인산화된 (p)-WT1(윌름의 종양{0}} 유전자) LPS 처리된 마우스의 족세포에서 p-WT1에 대한 다클론 항체(윌름의 종양{0}} 유전자) serine 393,sc-12933 및 363,sc-12934-R(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)를 사용했습니다. 신장 조직의 4-μm 섹션을 포함하는 슬라이드를 탈랍하고 투과화했습니다. 면역조직화학은 제조사의 프로토콜에 따라 Universal Quick Kit(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 사용하여 수행하였으며 슬라이드는 100배 oil immersion 대물렌즈(Primo Star, Carl Zeiss, GmbH, Germany)가 장착된 광학현미경을 사용하여 검사하였다. .
웨스턴 블롯. 전체 단백질은 200ul의 lysis buffer(1% Triton, 150mM NaCl, 25mM Tris-HCl pH 7.6)로 분리하고 DC Protein Assay kit(Bio-Rad)를 이용하여 농도를 측정하였다. 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel 전기영동을 이용하여 단백질(50 ug)을 분리하고 WT1(윌름의 종양{0}} 유전자) [F6] 항체 sc-7585(Santa Cruz Biotechnology). 샘플은 항 GAPDH(AB2302; Sigma, San Louis, MO, USA)를 사용하여 정규화되었습니다. Lumi-Light Western Blotting 시스템 sc-2048(Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 단백질을 시각화했습니다.
cistanche의 이점: 신장 보호
결과
유도신장손상LPS에 의한 BALB/c 마우스에서. 족세포 손상이 증가된 단백뇨와 관련이 있다는 것은 잘 확립되어 있습니다. 소변의 알부민과 총단백은 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel 전기영동과 DC Protein Assay kit(Bio-Rad)로 측정하였다. LPS 처리 12시간 후 소변 알부민의 유의한 증가(p=0.{13}}01)가 관찰되었으며, 대조군(15.53)에 비해 24시간(215.87±1.41 ug/ml)에서 최대 증가 ±5.0 ug/ml)(그림 1A). 총 요단백 농도는 36시간에 최대로 관찰되었으며(26.02±2.43 mg/ml) 대조군에 비해 유의하게 높았습니다(p{20}}.01). LPS에 의한 신장 손상을 조직학적으로 분석한 결과, 치료 24시간 후 신장 조직에서 국소 사구체신염이 관찰되었으며, 36시간째에 가장 큰 손상이 관찰되어 사구체의 크기가 증가하였고, 48시간 후 사구체의 점진적인 회복이 도 1C에 나타난 바와 같이 72시간까지 관찰되었습니다.
그림 1. 신장에 대한 전신 염증의 영향.리포폴리사카라이드로 처리된 마우스에서 신장 손상의 표지자로서의 요 알부민(A) 및 요 단백질(B)의 농도. C: lipopolysaccharide 주입 후 다른 시간(12, 24, 36, 48, 72 h)에서 마우스(헤마톡실린 및 에오신 염색)의 신장 조직학의 대표적인 이미지로, 만성 염증 모델을 100배 확대하여 비교합니다. 다음에서 크게 다름: *n<><0,0]><0.00>
LPS 처리된 마우스의 혈청에서 전염증성 사이토카인 TNFa 및 IL1의 생산. 신장 손상이 LPS에 의해 유발되었는지 확인하기 위해 전염증성 사이토카인 수준을 효소 결합 면역흡착 분석법으로 측정했습니다. 12시간(3.6±{9}}.9ng/ml, 11.9±5ng/ml) 및 최대 36시간(4.44±{17}}.1ng/ml,18) 후에 TNFa 및 I1의 증가가 관찰되었습니다. ±{20}}.9ng/ml) LPS로 처리한 후 감소하기 시작했습니다(그림 2A 및 B). IL6 발현은 처리 후 12시간(49.5ng/ml) 및 36시간(23.5ng/ml)에서 증가하여 대조군보다 상당히 높았다(도 2C).
그림 2. 전염증성 사이토카인 종양 괴사 인자-알파(TNFa) 수준의 시간 경과.(A), 인터루킨 1(LL1)(B), 및 IL6(C) 리포다당류의 복강내 투여 후 마우스의 혈청 내. 다음에서 크게 다름: *p 0 이하.05,**p 0.01 이하 및 ***p 0.001 이하 .
LPS 처리 마우스의 신장 조직에서 WTI 유전자 발현. WT1(윌름의 종양{0}} 유전자)는 염증 과정에 의해 조절되었으며 이는 신장 효과, WT1(윌름의 종양{0}} 유전자) 유전자는 염증 과정에서 다른 시간에 전신 염증이 있는 마우스의 신장 샘플에서 결정되었습니다. WT1(윌름의 종양{0}} 유전자) mRNA는 도 3A에 도시된 바와 같이 전신 염증 유도 후 36시간에서 가장 낮은 상대 발현 및 12시간에서 가장 높은 상대적 발현으로 대조군에 대해 분석된 모든 시간에 더 낮았다. 또한, LP로 처리하는지 여부를 결정하였다. PCR에 의한 WTI의 isoform exon5(17 AA±) 및 KTS±의 발현 변형 유도. 데이터는 LPS에 의해 유도된 전신 염증 과정 전체에 걸쳐 치료가 없는 대조군과 동일한 행동이 관찰되었기 때문에 이러한 이소형의 발현의 조절 해제가 없음을 보여주었습니다(그림 3B). WT1 단백질은 염증 과정 전반에 걸쳐 감소하는 것으로 나타났으며 처리 후 36시간에 약간 회복되었지만 WT1의 양은 처리되지 않은 대조군보다 적었습니다(그림 3C 및 D).
그림 3. 전신 염증이 있는 마우스의 신장 조직에서 Wilms'tumor I(WT1) 유전자 발현에 대한 지질다당류(LPS)의 효과.A: WTI mRNA의 상대적 발현.B: WT1.C의 동형 KTS± 및 17IAA±의 상대적 발현: LPS 처리 후 면역블롯팅에 의한 WTI 단백질 수준 및 D: WT1에 대한 면역블롯팅 밀도. 다음에서 유의하게 다름:**p 덜 0 이상.01 및 ***p 0.001 이하,
LPS 처리 마우스의 신장 생검에서 WTI의 인산화 및 국소화. WTI 단백질의 번역 후 조절에서 중요한 사건은 아미노산 393의 인산화이며, 이는 단백질의 세포질로의 이동을 유도합니다. LPS로 처리된 마우스의 신장 샘플에서 WT1의 인산화 및 위치가 결정되었습니다. WT1의 인산화는 조직화학에 의해 분석되었으며, 이는 전신 염증 유도 후 12시간부터 시작하여 72시간까지 유지되는 신장 조직의 절편에서 세포의 세포질에 인산화된 WT1의 존재를 나타냅니다. WT1은 아미노산 393 및 363에서 인산화되었습니다. 그림 4A와 같이. WT1 단백질의 위치를 면역형광법으로 분석하였다. LPS 처리 마우스의 신장 샘플에서 족세포에서 WT1의 위치는 주로 세포질인 반면, 대조군 샘플의 족세포에서는 위치가 불분명했습니다(그림 4B).
그림 4. 지질다당류 처리 마우스의 신장 샘플에서 Wilms'tumor I(WTI)의 인산화 및 국소화.A: LPS 투여 후 12시간부터 세린 393 및 363에서 인산화 증가를 나타내는 인산화(p)-WTI에 대한 면역조직화학 염색(광현미경에서 배율 100배). B: 신장에서 면역형광에 의한 WTI의 국소화; 지질다당류 투여 36시간 후 WT1(사각형)의 작은 핵 위치를 보여주는 예(공초점 현미경에서 40배 확대).DAP1:4,{10}Diamidino{11}}페닐인돌.
LPS 처리 마우스의 신장에서 WTI 및 네프린 발현 조절. 세포의 WT1 위치는 생물학적 활성에 영향을 미칩니다. 세포질 WT1은 전사 활성을 나타내지 않는 것으로 보고되었습니다. 이러한 이유로 WT1 및 네프린 mRNA의 발현은 LPS로 처리된 마우스의 신장 샘플에서 PCR에 의해 분석되었습니다(그림 5A).PCR은 72시간에서 증가와 함께 24시간에서 48시간으로 네프린 mRNA의 감소를 나타내었습니다(그림 5B ), WTI mRNA의 발현은 12시간에 증가하고 그 후 염증 및 신장 손상의 중요한 시간(24시간 및 36시간) 동안 감소하고(그림 5B).
그림 5. 네프린(NPHS1) 및 Wilms'tumor 1(WT1)mRNA 발현 분석.A: mRNA 발현 분석에서 NPHSI와 WTI는 lipopolysaccharide를 이용한 전신 염증 유도 24시간, 36시간, 48시간에 감소하였다. B: 농도계에 의해 A에 나타난 밴드의 정량화 및 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소로의 발현에 의해 정규화됨.
TNFa와 IL1으로 처리된 신장 외식편은 WTI와 네프린의 발현을 조절합니다. 사이토카인이 WT1의 발현을 조절하는지 확인하기 위해, 신장 외식편을 배양하고 사이토카인 TNFa 및 IL1으로 6, 12 및 24시간 동안 처리하여 PCR에 의해 WT1 및 네프린의 발현을 분석하였다. TNFa 및 IL1b로 처리된 신장 외식편에서 24시간째에 네프린 mRNA 발현이 감소하고 WTI mRNA 발현이 증가하였다(도 6).
그림 6. 신장 외식편에서 nephrin(NPHS1) 및 Wilms'tumor 1(WT1)mRNA의 발현 분석.A: 10ng/ml의 종양 괴사 인자-알파(TNF) 및 20ng/ml의 인터루킨 16(IL16)에 노출된 신장 외식편에서 서로 다른 시간에 NPHSi 및 WTI의 mRNA 발현 수준 B: 농도계 분석을 사용하여 얻은 상대 발현 신호 제품. 밴드는 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소에 대한 정규화에 의해 정량화되었습니다.
면역형광법에 의한 신장 외식편에서 WTI의 국소화. TNFa와 IL이 WT1 단백질의 국소화 변화에 관여하는지 여부를 결정하기 위해 마우스 신장 이식편을 24시간 동안 TNFa 및 L1 및 LPS로 처리하였다. IL1b 및 LPS로 처리된 외식편에서 WT1 단백질의 핵/세포질 국소화가 명백하였고, TNFα로 처리된 외식편에서 WT1 단백질의 세포질 국소화가 관찰되었다; 한편, 처리되지 않은 대조군에서는 주로 WT1의 핵 국소화가 관찰되었습니다(그림 7).
그림 7. 처리된 신장 외식편의 족세포에서 Red TX(WT1) 및 4',{4}}디아미디노{5}}페닐인돌(DAPI)(핵)을 사용한 면역형광에 의한 Wilms'tumor 1(WTI) 단백질의 국소화 l{6}} ng/ml의 종양 괴사 인자-알파(TNFa), 20 ng/ml의 인터루킨 16(L1B) 및 지질다당류(LPS) 포함.IL1 및 LPS 처리 하에 WTI의 핵/세포질 국재화와 비교하여 TNFα로 처리된 외식편에서 나타난 WTas의 감소된 핵 국재화. 배율, 40×.
