다양한 Kadsura Coccinea 추출물의 광 보호 및 항 멜라닌 생성 특성

연락하다:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

UVA(320~400 nm), UVB(280~320 nm), UVC(100~280 nm)를 특징으로 하는 태양 자외선(UV)은 세포독성, 유전독성으로 인한 피부암 및 광노화를 유발하는 가장 중요한 환경적 요인입니다. , 광독성. 특히 UVA와 UVB는 일일 UV 조사량의 각각 95% 이상과 3% 이상을 차지합니다[8]. UVA 및 UVB 조사는 피부의 표피 및/또는 진피층을 관통하여 활성 산소종(ROS)을 간접적으로 또는 직접적으로 유도하여 산화적 손상 및 세포 사멸을 유발할 수 있습니다. 최근 수십 년 동안 UV 방사선은 심각한 피부 건강 문제가 되었으며 여전히 전 세계적으로 위험하게 확산되고 있습니다[9-11]. UV 조사는 피부 표피 세포 질량의 약 95%를 차지하는 각질 세포의 직접적이고 일관된 자극제입니다. 케라티노사이트는 미생물, 화학적 및 물리적 위험에 대한 첫 번째 장벽 역할을 하며 UVA 및 UVB 방사선을 방어하는 데 도움이 됩니다. 각질 세포가 UVA와 UVB에 노출되면 세포 내 ROS가 생성되어 세포 사멸을 유발합니다 [12-14].

멜라닌 세포는 피부 표피의 생물학적 방어에 중요한 역할을 하는 멜라닌 색소의 생산과 양을 담당합니다. 조절장애는 과다색소침착 또는 저색소침착 장애를 유발할 수 있습니다[15,16]. 멜라닌 세포는 피부 표피의 기저층에 분포하며 햇빛 노출, 활성 산소종(ROS) 및 멜라닌 세포 자극 호르몬(-MSH)의 영향도 받습니다[17,18]. 유형{7}} 구리 단백질 계열의 구성원인 티로시나제는 멜라닌 생성 및 모노페놀 모노옥시게나제, 카테콜라제 및 디페놀 활성에서 중요한 역할을 하는 진화적으로 보존된 금속단백질입니다. 티로시나제, 티로시나제 관련 단백질-1(TRP{10}}) 및 티로시나제 관련 단백질-2(TRP{13}})의 하향 조절은 뚜렷한 촉매 효과가 있습니다. TRP{14}}는 5,{16}}디히드록시인돌{17}}카르복실산 산화효소이고 TRP{18}}는 DOPA크롬 호변이성화효소입니다[19,20]. 또한 MITF(myophthalmosis-related transcription factor) 및 CREB(cAMP-responsive element-binding protein)는 주로 멜라닌 생성을 조절하고 자극의 모드 및 강도에 대한 정보를 암호화하는 전사 인자입니다[17,21]. 여러 연구에서 MITF와 CREB 경로가 멜라닌 생성을 조절한다고 밝혔습니다. MITF는 멜라닌 생성 관련 효소의 전사에서 핵심 인자이며 멜라닌 생성의 중앙 조절자입니다. -MSH는 cAMP-related binding protein(CREB)과 관련된 신호 전달 메커니즘을 통해 MITF의 발현을 유도합니다. 그런 다음, MITF는 특정 멜라닌 생성 유전자와 효소의 전사를 촉진하기 위해 M-box 서열(AGTCATGTGCT)과 함께 핵에 진입합니다. 인산화된 CREB는 Mitf 전사를 상향 조절하기 위해 Mitf 프로모터의 CRE 공통 요소에 결합하는 -MSH에 의해 자극되는 것으로 알려져 있습니다[21-24].

이 연구에서는 KC 뿌리(KCR), 줄기(KCS), 잎(KCL) 및 과일(KCF) 추출물을 종합적으로 비교하고 광보호 및 항멜라닌 생성 특성에 대한 다중 평가를 수행했습니다.

2. 재료 및 방법

2.1. KC 추출물의 제조

3년생 KC 15 식물을 부산대학교 밀양캠퍼스의 9L 플라스틱 화분에서 키웠습니다. KC는 이 연구의 저자인 최영환 교수에 의해 식별되었습니다. 이 샘플들은 부산대학교 자연자원생명과학대학 원예생명과학부 식물표본관에 바우처 표본(기탁번호 KC-PDRL-1)으로 기탁되었습니다. 식물은 전도도 수준이 1.{7}} mS·cm-1이고 다음 요소(단위: me·L-1)를 포함하는 완전한 양액을 사용하여 충분히 물을 주었습니다. NO{10}}N, 16; NH{12}}N, 1.34; 피, 4; K, 8; Ca, 8; and S, 4. KC 가운은 2020년 12월에 뿌리, 줄기, 잎, 열매로 분류하여 수확하였다(그림 1A). 채취한 시료는 즉시 동결건조기에서 동결건조하여 분석할 때까지 20℃의 비닐봉지에 보관하였다. KC의 건조된 뿌리, 줄기, 잎 및 열매(20g)를 고운 분말로 분쇄하고 상온에서 에틸알코올로 추출하였다. 간단히 말해서, KC의 EtOH 추출물의 여과 및 증발은 45℃에서 감압하에 수행된 후 동결건조되었다. 마지막으로, 추가 실험을 위해 고체 추출물(50 mg/mL)을 DMSO(디메틸 설폭사이드)에 용해시켰다.

시스탄체허바 epimedium sagittatum발췌

2.2. KC 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

앞서 설명한 바와 같이 [25] KC 뿌리, 줄기, 잎 및 과일 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 Folin-Ciocalteu(총 폴리페놀) 및 알루미늄 클로라이드(플라보노이드) 비색 방법을 사용하여 측정되었습니다. 흡광도는 Ultrospec 6300 Pro(GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK)를 사용하여 700 nm(총 폴리페놀)에서 측정하고 VICTOR Multilabel Plate Reader(Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 510 nm(플라보노이드)에서 측정했습니다. .

갈산(총 폴리페놀)과 케르세틴(플라보노이드)을 표준으로 하여 표준곡선을 작성하였고, 그 결과를 KC 뿌리, 줄기, 잎, 열매 추출물의 그램당 갈산 당량(GAE/g)과 케르세틴 당량으로 나타내었다. KC 뿌리, 줄기, 잎 및 과일 추출물의 그램당(QE/g)

2.3. DPPH 및 ABTS 분석

KC 뿌리, 줄기, 잎 및 과일 추출물({0}}.5 mg/mL)의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성은 이전에 기술된 방법[25]에 따라 약간 변형하여 측정되었습니다. KC 뿌리, 줄기, 잎 및 과일 추출물(0.5 mg/mL)을 마이크로플레이트에서 DPPH 용액(6{13}} µM)과 혼합했습니다. 샘플을 세게 흔든 후 25℃에서 0.5시간 동안 암실에 보관했습니다. 7 mM ABTS 및 2.6 과황산칼륨의 스톡 용액을 18시간 동안 암실에서 실온에서 증류수에서 제조하였다. KC 뿌리, 줄기, 잎 및 과일 추출물(0.5 mg/mL)을 작업 용액에 혼합한 후 암실 상온에서 0.5시간 동안 방치하였다. 샘플 혼합물의 흡광도는 510 nm(DPPH) 또는 734 nm(ABTS)에서 모니터링되었습니다.

2.4. 세포 배양

부착된 케라티노사이트(HaCaT) 및 부착된 멜라닌 세포(B16F10)를 10% FBS(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen)을 함유하는 DMEM(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) 배양액에 접종하였다. Corporation, Carlsbad, CA, USA) 및 5% CO2와 함께 37 ºC에서 배양되었습니다. 부착된 HaCaT 및 B16F10 세포 성장을 규칙적으로 관찰하였으며, 배지는 2-3일마다 교체하였다. 대수 성장기의 세포를 후속 실험에 사용했습니다.

2.5. UVA 및 UVB 조사

각질 세포는 365 nm( UVA) 또는 312nm(UVB). UVA 조사량은 20J/cm2이고 UVB 조사량은 50mJ/cm2이었다.

2.6. CCK-8 및 LDH 분석을 통한 세포 생존율 및 세포독성 측정

세포 생존력 분석을 위해 CCK{2}} Assay Kit(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)의 Cell Counting Kit-8(CCK{1}}) 용액을 HaCaT 각질세포에 추가했습니다. 제조업체의 지침에 따라 B16F10 흑색종 세포 현탁액을 37℃에서 4시간 동안 배양했습니다. 간단히 말해서, 2 104 세포를 24-웰 플레이트의 각 웰에 파종하고 37℃에서 24시간 동안 5% CO와 함께 배양했습니다. 간단히 말해서, 2 104 세포를 24-웰 플레이트의 각 웰에 파종하고 37℃에서 24시간 동안 5% CO와 함께 배양했습니다. 24시간 동안 배양한 후 CCK{19}} 시약을 각 웰에 첨가하고 세포를 4시간 동안 더 배양했습니다. 세포 독성 검출 키트(Roche Applied Science, Switzerland)를 사용하여 HaCaT 각질 세포 배양 배지에서 세포외 젖산 탈수소효소(LDH) 방출을 측정했습니다. VICTOR Multilabel Plate Reader를 사용하여 450nm(CCK{22}}) 및 490nm(LDH)에서 흡광도를 분석했습니다.

2.7. 각질세포의 세포내 ROS 생산 평가

세포 내 ROS 수준은 {{0}}(및{1}})-클로로메틸-2',7'-디클로라이드-하이드로플루오레세인 디아세테이트 아세틸 에스테르(CM-H2DCFDA, Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬). 모든 절차는 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다. 간단히 말해서, KC 기타 부분 추출물({15}}.5 mg/mL) 처리 후 각질 세포(HaCaT)를 인산 완충 식염수(PBS)로 세척하고 CM-H2DCFDA(5 μM)와 함께 0.5시간 동안 배양했습니다. 어두운. 그 후, Carl Zeiss 형광 현미경을 사용하여 세포 내 ROS의 생성을 시각화했습니다. 형광 강도는 유세포 분석기(Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, USA)를 사용하여 형광 염료(CM-H2DCFDA)를 기반으로 측정되었습니다.

2.8. 아포토시스 분석

노출 및 처리 후 HaCaT 각질세포를 트립신 처리하고 원심분리했습니다. 이어서, 제조사의 지시에 따라 fluorescein isothiocyanate (FITC) Annexin V/Dead CellApoptosis Kit (Invitrogen Life Technologies, Carls-bad, CA, USA)를 사용하여 얻어진 세포의 세포자멸사를 평가하였다. 간단히 말해서, 각질세포를 PBS로 2회 헹구고, 아넥신 결합 완충액 중의 각질세포를 얻어 FITC/아넥신 V(성분 A) 및 프로피디움 요오다이드(PI) 작업 용액과 혼합하였다. 실온에서 15분 동안 암실에서 배양한 후, 각질 세포 사멸을 측정하고 유세포 분석기(Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, USA)를 사용하여 세포 사멸 세포의 백분율을 계산했습니다. FL1(FITC/Nexin V) 및 FL3(PI) 채널에 대한 신호를 감지하고 사분면 마커 염색 및 염색된 세포의 도트 플롯을 설정했습니다.

2.9. 세포내 멜라닌 함량 및 Tyrosinase 활성 분석

세포내 멜라닌 함량과 티로시나아제 활성 분석은 약간 변형된 절차가 다른 부분을 설명하여 측정되었습니다[24]. 멜라닌 세포는 48시간 동안 0.5 µM -MSH의 최종 농도와 0.5 mg/mL KC 기타 부분 추출물로 처리되었습니다. 멜라닌 세포 펠릿을 80 oC에서 1시간 동안 1{22}}% DMSO에 녹인 1N NaOH로 용해했습니다. 상대적 멜라닌 함량은 VICTORMultilabel Plate Reader를 사용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하여 결정되었습니다. 세포내 티로시나제 활성은 L-DOPA를 사용하여 도파크롬 생성 속도를 측정하여 결정하였다. 멜라닌 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 세척하고 1%(w/v) Triton X{15}}가 포함된 PBS에서 용해했습니다. 티로시나제 기질 L-DOPA(2 mg/mL)는 동일한 인산염 용해 완충액에서 제조되었습니다. 각 추출물을 {{18}웰 플레이트에 넣고 L-DOPA 용액을 첨가하여 효소 분석을 시작했습니다. 1시간 동안 배양한 후 VICTOR Multilabel Plate Reader를 사용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하여 도파크롬 생성을 분석했습니다. 각 측정값은 대조군의 백분율로 표시되었습니다. 알부틴(A, 0.5 mg/mL)을 양성 대조군으로 사용하였다.

시스탄체에키나코사이드티로시나제 억제제이다.

2.10. 정량적 Real-Time PCR

RNeasy Mini Kit(QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여 각 멜라닌 세포 그룹에서 총 RNA를 분리했습니다. 역전사는 제조업체의 지침에 따라 고용량 cDNA 역전사 키트(Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, USA)를 사용하여 수행하여 cDNA의 첫 번째 가닥을 얻었다. 그런 다음 가닥을 Bio-Rad Chromo4TM 기기 및 SYBR Green qPCR 마스터 믹스(Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, USA)를 사용하여 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)을 위한 템플릿으로 사용했습니다. PCR은 95℃에서 5분간 pre-denaturation, 95℃에서 15초, annealing에서 30초 동안 수행하였다. GAPDH mRNA는 티로시나아제, TRP{13}} 및 TRP{14}} mRNA에 대한 내부 참조로 사용되었습니다. 표적 유전자 발현의 상대값=2−∆∆CT. 프라이머 서열은 다음과 같습니다: Tyrosinase-sense(5'-ggccagctttcaggcagaggt-3'), Tyrosinase-anti-sense(5'-tggtgcttcatgggc aaaatc-3'), TRP-1-sense(5 ′-agccccaactctgtcttttc-3′), TRP-1-안티센스(5′-ggtctccctacatttccagc-3′), TRP{34}}센스(5′- tccagaagtttgacagccc-3 '), TRP-2-안티센스(5'-ggaaggagtgagccaagttatg-3'), GAPDH-센스(5'-aggtggtctcctctgacttc-3') 및 GAPDH-안티센스(5'-taccaggaaatgagcttgac -3′).

2.11. 웨스턴 블로팅

포유류 단백질 추출 시약(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 멜라닌 세포를 수확하고 용해했습니다. 모든 절차는 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다. 모든 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 분석 키트(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 결정되었습니다. 그 다음, 단백질 상층액에 loading buffer를 첨가하여 혼합하였다. 혼합물을 10분 동안 끓이고 Mini-PROTEAN Precast Gels(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 단백질을 분리하고 Hybond 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)으로 옮겼습니다. 면역검출은 티로시나제(1:1000), TRP-1(1:1000), TRP{10}}(1:1000), MITF(1:1000), 인산화된 CREB(p-CREB 1: SignalBoost Immunoreaction Enhancer Kit(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 1000), CREB(1:1000) 및 -tubulin(1:1000)(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). 막을 4℃에서 1차 항체와 함께 밤새 배양하였다. 염소 항토끼(IgG) 2차 항체(1:5000, Cell Signaling Technology)를 막에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 강화된 Pierce ECL 웨스턴 블롯팅 기질(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 단백질 밴드를 관찰하고 튜불린 밴드의 강도에 대한 표적 단백질 밴드의 강도의 비율로 정량화했습니다.

2.12. 통계 분석

모든 분석은 독립적으로 최소 3회 반복되었습니다. 모든 통계 매개변수는 평균의 평균 표준 오차(SEM)로 표시됩니다. 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Dunn의 사후 검정을 사용하여 통계적 분석을 수행했습니다. p < 0.01="" 또는="" p="">< 0.05="" 값은="" 유의미한="" 것으로="">

플라보노이드 검사

3. 결과

3.1. KC의 여러 부분 추출물의 항산화 특성 비교

The total polyphenol and flavonoid contents and ABTS and DPPH scavenging activities were compared to determine the potential effects of KCR, KCS, KCL, and KCF extracts on antioxidant capacity. As shown in Figure 1B, the KCR extract(197.6 27.2 mg GAE/g) exhibited the highest phenol content, followed by KCL (153.7 6.7 mg GAE/g) and KCS (88.1 7.8 mg GAE/g); the KCF (21.8 4.8 mg GAE/g) extract had the lowest phenol content. Moreover, the results of flavonoid content analyses showed that KCL (94.5 6.3 mg QE/g) had the highest flavonoid content followed by KCR (79.6 4.2 mg QE/g); the KCS (14.9 1.3 mg QE/g) and KCF (6.4 2.0 mg QE/g) extracts had the lowest flavonoid content (Figure 1C). To further investigate the antioxidant properties of KCR, KCS, KCL, and KCF, ABTS and DPPHradical scavenging assays were performed. As shown in Figure 1D, KCL (94.7 ± 2.9%) and KCR (82.8 ± 5.9%) exhibited the highest ABTS radical scavenging activity, followed by the KCS (29.7 ± 2.0%) and KCF extract (15.9 ± 2.0%). DPPH radical scavenging activity was also shown in the order of KCL (99.9 ± 0.1%) > KCR (95.5 ± 3.6%) >KCS(25.7 ± 2.1%) > KCF(8.7 ± 1.1%)(그림 1E).

3.2. UVA, UVB 또는 비조사가 있는 상태에서 KC의 여러 부분 추출물로 처리된 생존 및 손상된 각질세포의 비교

KCR, KCS, KCL 및 KCF onkeratinocytes의 효과를 알아보기 위해 다음 실험을 수행했습니다. 먼저 모든 추출물을 UVA, UVB 또는 비조사 상태에서 HaCaT 각질형성세포에 적용하였다. CCK{1}} 분석은 추출물이 0.5 mg/mL 농도에서 각질세포 생존율을 유의하게 변화시키지 않는 것으로 나타났습니다. 나중에, 각질세포는 UVA 또는 UVB 조사가 있는 상태에서 KCR, KCS, KCL 및 KCF로 처리되었습니다. 그림 2A의 CCK{4}} 분석에서 볼 수 있듯이 UVA 및 UVB 조사는 각질세포 생존을 유의하게 억제했습니다. 그러나, 우리는 UVA 및 UVB 조사된 각질세포의 생존력이 KCL, KCR, KCS 및 KCF의 순서로 증가한다는 것을 발견했습니다(그림 2A). 우리는 또한 세포 외 LDH 방출을 측정하여 손상된 각질 세포를 모니터링했습니다. 결과는 UVA 또는 UVB 조사가 LDH 방출을 상당히 촉진한다는 것을 보여주었습니다. 그러나 KCL, KCR, KCS 및 KCF는 순서대로 UVA 또는 UVB 노출로 LDH 방출을 크게 약화시켰습니다(그림 2B). 위의 실험결과에서 KCL, KCR, KCS, KCF 순으로 각질형성세포에 대한 UVA 또는 UVB 조사의 항증식 및 세포독성 효과가 완화됨을 확인하였다. 특히, KCL은 세포 생존 능력을 제어 수준으로 복원할 수 있습니다.

그림 2. KCR, KCS, KCL 및 KCF 추출물의 UVA, UVB 또는 비조사 상태에서 각질세포 생존율 및 세포독성 효과.

3.3. UVA 및 UVB 조사의 존재 또는 부재하에 KC의 여러 부분 추출물로 처리된 각질세포의 세포내 ROS 생성 비교

ROS의 세포 내 생산은 심각한 각질 세포 손상을 유발하기 때문에 UVA 또는 UVB 방사선 유발 손상의 잠재적 매개체로 간주됩니다. 여러 연구에서 UVA 또는 UVB 조사가 내인성 ROS 생성을 유도한다고 제안했습니다[12,14]. 우리는 UVA 또는 UVB 조사된 각질세포에서 내인성 ROS 수준의 증가가 있는지 확인하는 것을 목표로 했습니다. 따라서 우리는 형광 현미경과 유세포 분석을 사용하여 프로브 CM-H2DCFDA의 세포 내 형광 강도를 분석했습니다. 형광 현미경의 결과로 CM-H2DCFDA 염색 이미지는 대조군, KCR, KCS, KCL 및 KCF 처리 각질세포에서 약간의 염색을 보여주었으며 UVA 또는 UVB 조사 각질세포에서 상당한 염색을 보였습니다(그림 3A). 유세포분석의 정량화된 결과에 따르면, UVA 및 UVB 조사는 대조군(5.7%)에 비해 각질세포의 세포내 ROS 수준을 각각 27.2 ± 4.5% 및 34.1 ± 4.2% 증가시켰다. ±0.2%). 또한, 형광현미경 결과와 유사하게 UVA 또는 UVB가 조사된 상태에서 KCL > KCR > KCS > KCF의 순서로 KC 추출물에 의해 세포내 ROS 수준이 억제됨을 확인하였다(도 3B). 이러한 결과는 KC의 여러 부분 추출물이 내인성 ROS 수준을 감소시켜 각질 세포 손상을 유의하게 억제했음을 나타냅니다.

그림 3. KCR, KCS, KCL 및 KCF 추출물이 UVA, UVB 또는 조사되지 않은 각질세포에서 세포 내 ROS 생성에 미치는 영향

3.4. UVA 및 UVB 조사의 존재 또는 부재에서 KC의 여러 부분 추출물로 처리된 각질 세포의 세포 사멸의 비교

각질 세포 손상의 신뢰할 수 있는 지표인 세포 사멸을 감지하기 위해 각질 세포를 요오드화 프로피디움과 함께 Annexin V로 염색했습니다. fluorescein isothiocyanate(FITC) Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit를 사용하여 각질 세포의 세포 사멸 속도를 테스트했습니다. UVA 및 UVB 조사는 Annexin V 염색 활성을 촉진시킨 반면, KCR, KCS, KCL 및 KCF는 UVA 및 UVB 조사 존재하에서 Annexin V 염색 활성 속도를 감소시켰다. KCR, KCS, KCL 및 KCF 단독(0.5 mg/mL)은 Annexin V 염색 활성을 유도하지 않았습니다. 유세포 분석의 정량화된 데이터는 UVA 및 UVB 조사가 각질세포의 세포자멸사 수준을 46.3 증가시키는 것으로 나타났습니다.± 1.5% 및 48.7 ± 각각 1.0퍼센트, 대조군(5.0퍼센트 ± 0.7% ). 중요하게는 UVA 또는 UVB 조사가 있는 상태에서 KCL > KCR > KCS > KCF의 순서로 KC 추출물에 의해 세포 사멸 수준이 억제되었음을 확인했습니다(그림 4A,B). 전반적으로 UVA와 UVB 조사는 각질세포 손상을 일으키고 KC의 여러 부분 추출물은 UV 조사에 의해 유발된 각질세포 손상을 약화시켰다.

그림 4. KCR, KCS, KCL 및 KCF 추출물이 UVA, UVB 또는 조사되지 않은 각질 세포의 세포 사멸에 미치는 영향.

3.5. -MSH 처리 유무에 따른 KC의 여러 부분 추출물로 처리한 멜라닌 세포의 세포내 멜라닌 함량 및 티로시나아제 활성 비교

KCR, KCS, KCL 및 KCF의 - MSH-유도 멜라닌 생성에 대한 생물학적 잠재력을 조사하기 전에, KCR, KCS, KCL 및 KCF(0.5 mg/mL) 처리 후 세포 생존력을 다음을 사용하여 평가했습니다. -MSH가 있거나 없는 멜라닌 세포 B16F10의 CCK-8 분석. KCR, KCS, KCL 및 KCF(0.5 mg/mL)는 -MSH의 존재 여부에 관계없이 세포 생존율을 변경하지 않았습니다(그림 5A). -MSH는 멜라노코르틴 1 수용체에 결합하여 아데닐산 사이클라아제를 활성화시켜 세포내 멜라닌 함량을 증가시킬 수 있는 중요한 멜라닌 생성제입니다. KCR, KCS, KCL 및 KCF가 멜라닌 세포의 멜라닌 생성에 미치는 영향을 조사하기 위해 세포 내 멜라닌 함량을 육안 관찰 및 생화학적 측정으로 결정했습니다. 도 5B에 도시된 바와 같이, 세포내 멜라닌 함량은 -MSH에 의해 유의하게 증가하였다. 그러나 KCR, KCS, KCL, KCF의 동시 처리는 -MSH 처리에 비해 세포내 멜라닌 함량이 현저하게 감소하는 것으로 나타났다. 세포내 멜라닌 함량의 억제를 나타내는 생화학적 측정의 순서는 다음과 같았다: KCL > KCR > KCS > KCF(그림 5B). 세포내 멜라닌 함량 분석법에 따라 세포내 티로시나제 활성 분석을 수행하였다. KCR, KCS, KCL 및 KCF를 처리한 -MSH 자극 멜라닌 세포의 세포내 tyrosinase 활성은 감소한 반면, -MSH 자극 멜라닌 세포의 활성은 감소하였다. 세포내 티로시나아제 활성의 억제를 나타내는 생화학적 측정의 순서는 다음과 같았다: KCL > KCR > KCS > KCF(그림 5C). 이러한 결과는 KC의 여러 부분 추출물이 세포 생존력의 변화 없이 세포 내 멜라닌 함량을 유의하게 감소시키고 티로시나아제 활성을 억제함을 나타냅니다.

3.6. KC의 존재 또는 부재하에 여러 부분적 KC 추출물로 처리한 멜라닌 세포에서 Tyrosinase, TRP{2}} 및 TRP{3}}의 전사 및 번역 수준 비교-MSH 처리

KCR, KCS, KCL 및 KCF가 멜라닌 생성 마커(tyrosinase, TRP{0}} 및 TRP{1}})의 단백질 및 mRNA 발현 수준의 하향 조절에 미치는 영향을 조사하기 위해 멜라닌 세포를 KCR로 처리했습니다. , KCS, KCL 및 KCF -MSH의 존재 또는 부재. 그림 6A–C에서 볼 수 있듯이 -MSH 처리에 의해 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 mRNA 수준이 유의하게 증가했습니다. 대조적으로, -MSH 처리에 비해 KCR, KCS, KCL 및 KCF는 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 mRNA 발현을 하향조절하였다. 또한 KCR, KCS, KCL 및 KCF 단독으로는 티로시나제, TRP{10}} 및 TRP{11}} mRNA 수준에 큰 영향을 미치지 않았습니다. 웨스턴 블롯 분석은 실시간 PCR과 협력하여 수행되었습니다. 결과는 -MSH 처리가 tyrosinase, TRP{14}} 및 TRP{15}}의 단백질 발현 수준을 증가시켰고 이러한 수준은 KCR, KCS, KCL 및 KCF와의 동시 처리에 의해 감소한 것으로 나타났습니다(그림 6D ). tyrosinase, TRP{19}}, TRP{20}} mRNA 및 단백질 발현의 정량적 실시간 PCR 및 western blotindicating 억제 순서는 다음과 같습니다. KCL > KCR=KCS > KCF (그림 6). 이러한 결과는 KC의 여러 부분 추출물이 멜라닌 생성 마커의 하향 조절에 의해 나타난 항 멜라닌 생성을 촉진할 가능성이 있음을 시사합니다.

3.7. -MSH 처리 유무에서 KC의 여러 부분 추출물로 처리된 멜라닌 세포의 MITF 발현 및 CREB 인산화 비교

Tyrosinase, TRP{0}} 및 TRP{1}}는 멜라닌 생성에 필수적입니다. 이들의 발현은 MITF 발현 및 CREB 인산화에 의해 조절된다[17,21]. Western blot 분석 결과 KCR, KCS, KCL, KCF가 -MSH 처리로 인한 MITF의 단백질 수준 증가를 효과적으로 억제함을 알 수 있었다. 또한, KCR, KCS, KCL 및 KCF 단독으로는 MITF 단백질 발현이 거의 검출되지 않았다. MITF 단백질 발현 수준의 억제를 나타내는 정량화된 웨스턴 블롯 결과의 순서는 다음과 같았다: KCL > KCR > KCS > KCF(도 7A). 더욱이, KCR, KCS, KCL 및 KCF는 CREB 인산화에 대한 -MSH 처리의 효과를 역전시켰다. KCR, KCS, KCL 및 KCF 단독으로는 CREB 인산화에 거의 영향을 미치지 않았습니다. CREB 인산화 수준의 억제를 나타내는 정량화된 웨스턴 블롯 결과의 순서는 다음과 같습니다: KCL > KCR > KCS > KCF(그림 7B). 이러한 결과는 KC의 여러 부분 추출물이 MITF 발현과 CREB 인산화를 통해 적어도 부분적으로 멜라닌 생성 멜라닌 세포를 억제한다는 것을 나타냅니다.

4. 토론

UV 조사의 증가로 인해 전 세계적으로 피부 미백의 인기가 증가하고 있으며 미용 목적으로 향후 수십 년 동안 높은 비율에 도달할 것으로 보입니다[8]. 코직산(kojic acid) 및 알부틴(arbutin)과 같은 수많은 유형의 표백제가 화장품 및 제약 시장에서 사용되었습니다. 또한 천연 추출물은 잠재적인 항산화, 항염, 항종양, 항균 및 기타 활성으로 인해 점점 더 주목받고 있습니다[26,27]. 항산화 및 광보호 및 항멜라닌 생성의 특성을 기반으로 여러 화장품 및 의약품 후보물질이 개발되었습니다. 미백 후보 물질의 이러한 특성은 화장품 및 의약품 연구 및 개발에 없어서는 안될 기여자임이 잘 알려져 있습니다[28]. TDM은 다중 성분 및 다중 표적 특성을 가지며 인간의 생물학적 효과와 삶의 질을 크게 향상시킵니다[29]. 현대의 식물화학 연구에 따르면 KC에는 리그난과 테르페노이드가 주성분인 다양한 성분이 포함되어 있습니다[30]. dibenzocyclooctadiene lignans, Spirobenzofuranoid dibenzocyclooctadiene lignans, Arylnaphthalene lignans, Kadlongilactone triterpenoids, sesquiterpenoids를 포함하여 202개 이상의 화합물이 확인되었습니다[31,32]. KC의 말린 뿌리, 줄기 및 잎은 류마티스 관절염, 십이지장 궤양, 위장 장애 및 부인과 문제를 치료하기 위해 TDM에서 널리 사용되는 전통을 가지고 있습니다. KC의 말린 뿌리는 열을 내리고 독소를 제거하고 이뇨 작용을 일으켜 부종을 제거합니다. KC의 과일은 주로 생과일, 주스, 과즙 등의 형태로 섭취되어 인체 건강에 이롭다는 것을 알 수 있다[7,33,34]. 이전 연구에서도 리그난, 트리테르페노이드, 플라보노이드, 페놀산, 스테로이드, 아미노산과 같은 생리 활성 성분이 풍부하여 영양 및 의약 가치가 높은 것으로 나타났습니다[3,35]. 이 연구에서는 KC의 다른 부분을 추출했습니다. 특히 KC 잎과 뿌리의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 줄기와 열매보다 훨씬 높았다. 잎과 뿌리에는 줄기와 과일보다 2배 이상 많은 폴리페놀과 플라보노이드가 함유되어 있습니다. 그 결과, 우리는 총 폴리페놀과 플라보노이드가 KC의 광보호 및 항멜라닌 생성 효과에 상당한 기여를 한다고 생각합니다.

UV 방사선에 의해 유발되는 피부 광독성은 주로 세포 세포독성, 세포내 ROS 축적 및 케라티노사이트의 세포자멸사에 기인합니다. 따라서 UVA와 UVB를 조사한 각질세포에서 세포독성, 세포내 ROS 축적, 세포사멸 억제에 초점을 맞추는 것이 더 합리적이다[36,37]. 본 연구[10,38]에서 설명한 바와 같이 광세포독성(UVA: 20 J/cm2, UVB: 50 mJ/cm2) 결과에 대한 KC 추출물의 개입은 KC 추출물이 세포 세포독성, 세포내 ROS 축적 및 아폽토시스. 이전 결과와 일관되게, KC 잎과 뿌리의 광보호 효과는 줄기와 열매보다 훨씬 높았다. 또한, 우리의 결과는 KC 추출물이 항산화 활성을 촉진하여 위에서 언급한 효과를 나타내는 것으로 나타났습니다. 멜라닌 생성은 종종 UV 조사 후에 관찰되며 주로 색소침착 또는 과색소침착과 관련이 있습니다[39]. 이전 연구에 따르면 -MSH를 이용한 멜라닌 생성 유도 방법이 널리 알려져 적용되고 있다. 따라서 이 연구는 -MSH로 자극된 멜라닌 세포 모델의 구축을 기반으로 하였다[24,39]. 우리는 KC 추출물이 -MSH로 자극된 세포 내 멜라닌 함량과 티로시나아제 활성을 억제한다는 것을 발견했습니다. 또한, KC 추출물은 -MSH로 자극된 멜라닌 세포에서 tyrosinase, TRP{21}}, TRP{22}}와 같은 멜라닌 생성 마커의 전사 및 번역을 하향 조절했습니다. 또한, -MSH로 자극된 멜라닌 세포에서 MITF 단백질 발현과 CREB 인산화를 조사했습니다. 유사하게, 이 연구에서 우리는 KC 추출물이 멜라닌 세포에서 -MSH 매개 MITF 단백질 발현과 CREB 인산화를 억제한다는 것을 발견했습니다. 광보호 결과와 일치하게 KC 잎과 뿌리의 멜라닌 생성 억제 효과는 줄기와 열매보다 훨씬 높았다.

시스탄치 슬라이스

자세한 내용은 여기를 클릭하십시오.

5. 결론

전반적으로, KC 추출물의 잠재적인 광보호 및 항멜라닌 생성 효과가 이 연구에서 발견되었습니다. 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 높은 KC 추출물은 각질 세포와 멜라닌 세포에 광 보호 및 항 멜라닌 생성 효과를 나타낼 수 있습니다.