혈소판 억제는 NLRP3 Inflammasome 활성화 및 패혈증 유발 신장 손상을 예방합니다
Mar 28, 2022
연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com
Marivee Borges-Rodriguez 외
추상적인:
혈전증의 세포 매개체인 혈소판은 패혈증 동안 활성화되며 점점 더 면역 반응의 매개체로 인식되고 있습니다. 혈소판 활성화는 ICU 대조군 환자에 비해 패혈증 환자에서 유의하게 증가합니다. 이러한 상관관계에도 불구하고 패혈증 병태생리에 기여하는 활성화된 혈소판의 역할은 여전히 불분명합니다. 우리는 이전에 맹장 결찰 천자(CLP) 쥐의 패혈증 유발 혈소판에서 NOD 유사 수용체 단백질 3 인플라마좀(NLRP3) 인플라마좀 활성화를 시연했습니다. 활성화된 혈소판은 CLP 대 SHAM 대조군에서 증가된 폐부종 및 사구체 손상과 관련이 있었습니다. 이 연구에서 우리는 혈소판 활성화의 억제가 CLP에 대한 반응으로 NLRP3 활성화와 신장 및 폐 손상을 약화시키는지 여부를 조사했습니다. CLP는 복부 패혈증을 유도하기 위해 수컷 및 암컷 Sprague Dawley(SD) 쥐(n=10/그룹)에서 수행되었고 SHAM 쥐는 대조군으로 사용되었습니다. CLPanimals의 하위 집합은 혈소판 활성화를 억제하기 위해 Clopidogrel(1{21}} mg/kg/day, CLP + CLOP)로 처리되었습니다. CLP 후 72시간에 혈소판 활성화 및 NLRP3 인플라마솜 조립을 평가하고 혈장에서 IL{11}} 및 IL{12}}을 측정하고 조직, 신장 및 폐 병리, 신장 기능을 평가했습니다. 활성화된 혈소판은 Sham에서 7.8 ± 3.6%, CLP에서 22 ± 6%였으며 CLP와 CLOP에서 14.5 ± 0.6%로 유의하게 감소했습니다(n=8-10/그룹, p < 0.05)="" .="" nlrp3="" 인플라마솜="" 조립은="" clp와="" clop="" 동물="" 대="" clp의="" 혈소판에서="" 억제되었습니다.="" clp에="" 대한="" 혈장="" 및="" 신장="" il{28}}="" 및="" il{29}}의="" 유의한="" 증가는="" clopidogrel="" 치료로="" 감소했습니다.="" clp="" +="" clop="" 대="" clp에서="" 신장="" 손상(폐="" 조직학="" 또는="" 신장="" 기능은="" 개선되지="" 않음)이="" 개선되었습니다.="" 이러한="" 데이터는="" 활성화된="" 혈소판이="" 혈소판에서="" nlrp3="" 활성화를="" 통해="" 패혈증="" 유발="" 신장="" 손상에="" 기여할="" 수="" 있다는="" 증거를="" 제공합니다.="" 혈소판은="" 패혈증="" 환자의="" 신장="" 손상을="" 줄이기="" 위한="" 치료="" 표적이="" 될="" 수="">
키워드:부패; NLRP3; 혈소판; 클로피도그렐; 다기관 손상; 내피 활성화;염증
1. 소개
패혈증은 감염원[1]에 대한 생명을 위협하는 조절 장애 숙주 염증 반응이며 세계에서 주요 사망 원인 중 하나입니다. 미국에서 적어도 170만 명의 성인이 패혈증에 걸리고 거의 270,{5}} 미국인이 매년 패혈증으로 사망합니다[2]. 패혈증은 급성 폐 손상(ALI)을 포함한 다기관 기능 장애로 이어집니다[3],심각한신장부상(AKI) [4,5], 혈액 및 중추 신경계 기능 장애. 패혈증과 관련된 장기의 수가 증가하면 사망률이 증가합니다[6]. 현재의 치료 방식은 지지적 치료에 중점을 두고 있습니다. 그러나 사망률은 여전히 높습니다. 병원 내 사망의 약 35~50%가 패혈증으로 인한 것으로 보고되었습니다[7]. 패혈증으로 인한 사망률을 개선할 수 있는 치료 목표를 식별하는 것이 중요합니다.
혈소판은 지혈 및 혈전증에 대한 역할 외에도 면역에 중요한 역할을 하는 것으로 인식되었습니다[8,9]. 혈소판 감소증은 패혈증에서 자주 나타나며 혈소판 활성화 및 소비로 인해 발생하는 것으로 생각됩니다. 그러나 질병 과정에서 그 역할은 불분명합니다. 혈소판 감소증은 (다기관 부전) MOF의 발병 및 증가된 90-일 사망률[10-14]과 관련이 있습니다. 혈소판은 패혈증에 대한 염증 반응의 필수적인 부분일 수 있습니다. 혈소판이 다기관 손상에 기여할 수 있는 잠재적 메커니즘은 NOD 유사 수용체 단백질 3 인플라마솜(NLRP3)의 활성화를 통한 것입니다. NLRP3는 카스파제 매개된 절단 및 IL{12}}B 및 IL{13}} 활성화를 유도하는 세포질 면역 신호 수용체이며 천식과 같은 염증성 질환 과정의 발병기전에 연루되어 있습니다[15 ], 파킨슨병[16], 염증성 장질환[17], 패혈증[18]. NLRP3 inflammasome 어셈블리의 억제는 패혈증으로 인한 장기 손상을 방지하는 것으로 나타났습니다[19-23]. 우리는 이전에 NLRP3 inflammasome이 맹장 결찰 천자(CLP)에 대한 반응으로 혈소판에서 활성화되고 72시간 CLP 쥐 모델에서 다균성 패혈증에 대한 반응으로 다기관 손상과 관련이 있음을 입증했습니다. 현재 연구에서 우리는 Clopidogrel(CLOP)로 혈소판 활성화를 차단하면 다균성 패혈증에 대한 반응으로 NLRP3 inflammasome 활성화, 신장 및 폐 손상을 감소시킬 것이라고 가정했습니다.
시스탄체 플라보노이드: 항염
2. 결과
2.1. 플레이트 활성화 및 NLRP3 Inflammasome 어셈블리
유세포 분석을 사용하여 그룹 간의 혈소판 활성화 비율을 결정했습니다. 우리는 SHAM 7.8 ± 3.6%(p < 0.{{10}}5)와="" 비교할="" 때="" clp="" 쥐에서="" 혈소판="" 활성화가="" 22="" ±="" 6%="" 증가했으며="" clp에서="" 약화되었음을="" 발견했습니다.="" 플러스="" clop="" 쥐는="" 14.5="" ±="" 0.6%="" 증가했습니다(p="">< 0.05,="" 그림="" 1).="" 혈소판에서="" nlrp3="" 인플라마좀="" 어셈블리는="" 면역세포화학을="" 사용하여="" 세포자멸사="" 관련="" 반점="" 유사="" 단백질(asc)과="" nlrp3의="" 공동="" 국소화를="" 시각화하여="" 평가되었습니다(그림="" 2).="" clp="" 혈소판에서="" 인플라마좀="" 성분의="" 공동="" 국소화는="" 샴="" 혈소판에="" 비해="" 83배="" 더="" 컸습니다(그림="" 2c).="" 또한="" clp와="" 비교했을="" 때="" clp와="" clop의="" 혈소판에서="" inflammasome의="" 조립이="">
2.2. 인플라마좀 관련 사이토카인
NLRP3 활성화는 전염증성 사이토카인 IL-1 및 IL-18을 활성 형태로 방출합니다. 우리는 혈장에서 두 사이토카인을 모두 측정했습니다.폐, 그리고신장균질화ELISA를 통한 SHAM, CLP 및 CLP 플러스 CLOP. 혈장 IL{{0}}은 Sham에서 9 ± 21pg/mL에서 CLP에서 77 ± 31pg/mL로 크게 증가했습니다(p < {{1{17}}}}.{19}}="" 5,="" 그림="" 3a).="" clopidogrel의="" 투여는="" 혈장="" il-1="" 48="" ±="" 38="" pg/ml의="" 감소를="" 보여주었습니다.="" 그러나="" 감소는="" clp와="" 비교할="" 때="" 통계적으로="" 유의하지="" 않았습니다(p="">< 0.05="" vs.="" sham).="" 유사하게,="" 신장="" il{12}}은="" sham="" 2.5="" ±="" 0.9pg/mg과="" 비교할="" 때="" clp="" 4="" ±="" 3pg/mg에서="" 상승했습니다(p="">< 0.05,="" 그림="" 3b).="" clopidogrel="" 치료는="" 신장="" il{22}}을="" 1.8="" ±="" 0.8="" pg/mg으로="" 유의하게="" 감소시켰습니다(p="">< 0.05).="" 폐에서="" il{29}}은="" sham에서="" 70="" ±="" 16="" pg/mg에서="" clp에서="" 106="" ±="" 36="" pg/mg으로="" 유의하게="" 증가했으며(p="">< 0.05)="" clopidogrel="" 처리="" 동물(80="" ±="" 23="" pg="" g,="" 그림="">
혈장 IL{{0}}은 SHAM 쥐에서 검출되지 않았습니다. 그러나 평균 혈장 IL-18은 CLP에서 26 ± 6 pg/mL였습니다. 중요하게도, 클로피도그렐 투여는 혈장 IL-18 수준을 낮추었습니다(12 ± 9 pg/mL; p < 0.{{20}}5,="" 그림="" 3d).="" 유사하게,="" 신장="" il{{10}}은="" sham(317="" ±="" 73="" pg/mg,="" p="">< 0.05)에="" 비해="" clp(396="" ±="" 65="" pg/mg)에서="" 증가했습니다.="" clopidogrel="" 치료는="" 신장="" il{17}}을="" 214="" ±="" 70pg/mg으로="" 감소시켰습니다(p="">< 0.05,="" 그림="" 3e).="" 폐에서="" il{23}}은="" sham에서="" 704="" ±="" 219="" pg/mg에서="" clp에서="" 999="" ±="" 158="" pg/mg(p="">< 0.05)으로="" 크게="" 증가했으며="" clopidogrel="" 처리="" 동물에서="" 1014="" ±="" 235="" pg/mg(="" p="">< 0.05="" 대="" 샴,="" 그림="">
2.3. 내피 활성화
우리는 ELISA를 통해 Sham, CLP 및 CLP와 CLOP 그룹에서 내피 활성화의 마커로서 angiopoietin{{0}} 및 엔도칸의 혈장 수준을 측정했습니다. 혈장 엔도칸은 Sham에서 1234 ± 327 pg/mL에서 CLP에서 1978 ± 306 pg/mL로 유의하게 증가했습니다(p < {{20}}.05="" vs.="" sham).="" endocan은="" clopidogrel="" 처리된="" clp="" 쥐에서="" 1521="" ±="" 283="" pg/ml로="" 유의하게="" 감소했습니다(p="">< 0.05="" vs.="" clp,="" 그림="" 4a).="" 유사한="" 결과가="" 지오포이에틴{12}}에서도="" 발견되었습니다.="" 안지오포이에틴{13}}은="" sham에서="" 5603="" ±="" 2142="" pg/ml에서="" clp에서="" 56,767="" ±="" 40,{19}}="" pg/ml로="" 유의하게="" 증가했으며(p="">< 0.05="" vs.="" sham)="" clopidogrel을="" 처리한="" 쥐에서="" 다음으로="" 유의하게="" 감소했습니다.="" 22,486="" ±="" 13,616pg/ml(p="">< 0.05="" 대="" clp,="" 그림="">
2.4. 폐 손상
각 그룹의 폐에 대한 조직학적 분석은 {{6} 점수와 비교하여 CLP 쥐에서 평균 점수 {{0}}.6 ± 0.2로 호중구 침윤의 유의한 증가를 보여주었습니다. }.10 ± {{10}}.1{17}} (p < 0.{21}}5).="" 우리는="" 또한="" clp="" 쥐에="" 대한="" 클로피도그렐="" 투여가="" 호중구="" 침윤을="" 변경하지="" 않았음을="" 관찰했습니다(점수="" 0.5="" ±="" 0.4,="" 그림="" 5a).="" 유사한="" 결과가="" sham="" 쥐의="" 0.8="" ±="" 0.3="" μm에="" 비해="" 평균="" 두께="" 1.2="" ±="" 0.1="" μm의="" clp가="" 크게="" 증가하여="" 폐포="" 벽="" 두께에서="" 발견되었습니다(p="">< 0.05).="" clp="" 쥐에="" 대한="" 클로피도그렐="" 투여는="" 폐포="" 벽="" 두께를="" 개선하지="" 않았습니다(그림="">
2.5. 신장 손상
이전에 게시한 바와 같이 GFR은 2.1 ± 0.8 mL/min/100 g에서 크게 감소했지만 가짜 쥐에서는 {{10} .7 ± 0.2 mL/min/100 g, 그러나 CLP 쥐에서(p < 0.05).="" clopidogrel의="" 투여는="" gfr이="" 1.3="" ±="" 0.5ml/min/100g으로="" 개선되었지만="" clp와="" 비교하여="" 통계적으로="" 유의하지="" 않은="" 것으로="" 나타났습니다(그림="" 6a).="" 조직학적="" 분석은="" sham에="" 비해="" clp="" 그룹에서="" 증가된="" 사구체="" 손상을="" 보여주었습니다.="" clopidogrel="" 치료는="" clp="" 동물에서="" 사구체="" 손상을="" 유의하게="" 개선했습니다(그림="">
cistanche 건강상의 이점: 더 나은 신장 기능
3. 토론
패혈증은 감염원에 대한 조절되지 않는 면역 반응으로, 종종 다기관 부전과 관련되고 높은 사망률을 보이는 것으로 알려져 있습니다. 염증 반응을 조절하고 사망률을 감소시킬 수 있는 새로운 치료법의 확인이 필요합니다. 혈소판은 면역 조절에 역할을 하는 것으로 가정되었습니다. 당연히 응고 캐스케이드 및 혈소판 활성화가 조사의 두드러진 초점이었습니다. 항응고제인 내인성 효소인 단백질 C의 투여는 중증 패혈증 환자의 생존율 향상과 관련이 있습니다[24]. 일본에서는 패혈증 가이드라인에 DIC가 있는 패혈증 환자에서 적시 항트롬빈 투여가 포함되어 있으며 개선된 결과를 보였다[25]. 이것은 혈소판 활성화를 억제하는 것이 패혈증의 결과를 개선할 수 있음을 시사합니다. 패혈증 동안의 염증 반응은 확실히 복잡하며 하나 이상의 경로를 포함할 수 있습니다. 우리는 이전에 CLP 다균성 패혈증 모델의 혈소판이 혈소판 NLRP3 조립/활성화를 증가시키고 폐 및 신장 손상과 관련이 있다고 발표했습니다[26]. 이 연구에서 우리는 P2Y12 억제제인 Clopidogrel을 사용하여 동일한 모델에서 염증 반응에서 혈소판 억제의 역할을 결정하기 시작했습니다.
이전에 발표된 바와 같이, 샴 쥐와 비교할 때 CLP 모델에서 다균성 패혈증에 대한 반응으로 혈소판 활성화가 증가했습니다. 우리는 Clopidogrel의 투여가 CLP 쥐에서 혈소판 활성화를 감소시켰고 흥미롭게도 혈소판에서 NLRP3 인플라마솜 조립의 감소가 관찰되었음을 발견했습니다. 또한 CLP 그룹과 비교할 때 Clopidogrel 처리 동물의 혈장에서 순환 IL-1B 및 IL{2}}이 감소하는 경향을 발견했습니다. 이전에 발표된 연구에서 우리는 MCC950으로 NLRP3 인플라마좀을 직접 억제하면 혈장에서 IL-1B와 IL-18이 감소한다고 보고했습니다[27]. 이것은 클로피도그렐을 사용한 혈소판 활성화의 억제와 이 패혈증 모델에서 염증성 사이토카인의 감소가 부분적으로 NLRP3 기전에 의해 매개됨을 시사합니다. 따라서 혈소판에서 NLRP3에 의해 매개되는 염증 경로를 보다 명확하게 정의하기 위해서는 추가 연구가 수행되어야 합니다.
Multi-organ failure (MOF) occurs frequently in sepsis. Previously published studies reported that in mice, the CLP model caused significant pulmonary damage; and depletion of platelets reduced CLP-induced edema and neutrophil recruitment in the bronchoalveolar space by >60퍼센트[28]. 우리는 이전에 CLP 쥐 모델에서 증가된 혈소판 활성화가 다발성 기관 기능 장애 및 손상과 관련이 있음을 발표했습니다[26]. 우리의 데이터는 IL-1과 IL-18의 상당한 감소를 보여줍니다.신장클로피도그렐을 투여한 동물의 급성 신부전과 패혈증의 조합은 70%의 사망률과 관련이 있으며, 급성 신부전만 있는 환자의 사망률은 45%입니다[29]. 사구체 여과율(GFR)은 다음의 지표입니다.신장기능신장 손상이 증가함에 따라 감소합니다. Clopidogrel 치료는 CLP 쥐의 신장 손상을 개선했으며, 이는 혈소판 활성화가 패혈증 유발 AKI의 발병에 역할을 할 수 있음을 시사합니다.
cistanche 추출물의 이점: 신장 기능 향상
MOF를 유발하는 역할과 일치하게 ALI 및 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)의 발병은 패혈증 환자에서 흔한 일이며 종종 이 환자 집단에서 기계적 환기가 필요합니다. 증거에 따르면 혈소판 활성화는 패혈증 환자에서 MOF 발생에 중요한 역할을 합니다[8,30]. 이전 연구에서는 혈소판 고갈 후 CLP로 유도된 패혈증 마우스의 폐에서 호중구 침윤이 감소하여 이를 뒷받침했습니다[28]. 또한, Liverani et al. Clopidogrel로 전처리된 쥐는 패혈증 유발 ALI에 내성이 있다고 보고했습니다[31]. 그러나 현재 연구에서는 폐의 IL- 1, 호중구 침윤 또는 폐포 벽 두께 감소에 대한 유의한 증거를 보여주지 못했습니다. 이것은 다른 동물 종의 사용, Clopidogrel의 용량 및 기타 실험 설계의 차이 때문일 수 있습니다.
모세혈관 누출은 패혈증의 두드러진 특징입니다. 혈관 성장 인자 안지오포이에틴{0}}과 같은 단백질은 염증, 내피 기능 장애를 촉진하는 것으로 알려져 있으며 패혈증 환자의 병원 사망률 증가와 관련이 있습니다[32]. Endocan은 내피세포 기능장애의 또 다른 표지자로 질병의 중증도 및 패혈증 환자의 결과와 관련이 있습니다[33]. 우리는 또한 내피 활성화 및 기능 장애의 이러한 마커가 CLP 모델에서 증가하고 Clopidogrel 치료 그룹에서 감소한다는 것을 발견했습니다. 유사하게, 우리는 클로피도그렐 치료군에서 GFR의 약간이지만 유의미하지 않은 증가를 관찰했습니다. 이것은 혈소판 활성화가 패혈증에 대한 염증 반응에 약간의 조절 효과가 있음을 시사합니다.
이 연구에서 혈소판 활성화의 억제는 장기 기능의 상당한 개선으로 이어지지 않았습니다. 10 mg/kg/day의 선택된 용량이 혈소판 활성화, NLRP3 활성화, 사이토카인 및 내피 활성화 마커를 약화시키기에 충분했지만 폐 손상의 약화 또는 신장 기능의 개선으로 해석되지 않았을 수 있습니다. Liverani, et al. 이전에 야생형 및 P2Y12 녹아웃 마우스에서 초기 용량 30/mg/kg/day를 사용했는데, 이는 패혈증 유발 폐 손상의 억제로 해석되었습니다[31]. 같은 연구에서 클로피도그렐은 패혈증 유도 전에 투여되었습니다. 이 주요 차이점은 우리 연구에서 관찰된 폐 또는 신장 기능의 유의미한 개선 부족을 설명할 수 있습니다.
현재 연구는 패혈증에 대한 반응으로 염증 및 내피 활성화에 기여하는 혈소판 활성화의 역할을 제안하지만 주목해야 할 제한 사항이 있습니다. 첫째, 내피 활성화의 마커를 측정하는 동안 내피 기능을 평가하기 위한 추가 실험이 필요합니다. 또한, 다른 혈소판 유래 인자의 기여도는 이 연구에서 통제되지 않았습니다. 따라서 혈소판이 패혈증 유발 병리 및 장기 부전에 어떻게 기여하는지에 대한 답이 없는 질문이 여전히 있습니다.
패혈증에서 사망률을 줄이는 데 클로피도그렐의 역할은 ARDS 및 기계적 환기의 발병률을 감소시키는 보고와 함께 논란의 여지가 있지만 사망률을 감소시키지는 않습니다[34]. 혈소판이 패혈증에서 장기 손상 및 기능 장애에 기여하는 정확한 기전을 결정하기 위해서는 추가 연구가 수행되어야 합니다. 이 연구는 패혈증 환자의 치료 표적으로서 혈소판의 추가 탐색을 지원합니다.
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4. 재료 및 방법
4.1. 동물
Envigo(Indianapolis, IN, USA)에서 구입한 암컷 및 수컷 Sprague Dawley 쥐를 사용하였다. 이 연구에서 수행된 모든 실험 절차는 동물의 사용 및 관리에 대한 국립 보건원 지침에 따랐습니다. 모든 프로토콜은 University of Mississippi Medical Center의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 동물의 관리 및 취급은 윤리적 동물 치료에 대한 국립 보건원 지침에 따랐습니다.
4.2. 맹장 결찰 및 천자
모든 생체 내 실험은 체중이 약 225–325g인 12-~{1}}주 된 수컷 및 암컷 쥐에서 수행되었습니다. 동물을 무작위로 두 그룹으로 나누었습니다: 가짜 수술 그룹(SHAM, n=10)과 맹장 결찰 천자 그룹(CLP, n=10). isoflurane 마취 하에서 CLP 수술은 우리가 이전에 설명한 것처럼 복부 다균성 패혈증을 유도하기 위해 쥐의 하위 집합에서 수행되었습니다 [26,27]. 소생술을 위해 수술 직후 예열된 식염수(20mL/kg, 37℃)를 피하주사하였다. 가짜 수술 동물은 맹장 결찰이나 천자 없이 동일한 수술 절차를 거쳤습니다. 수술 후 쥐를 우리에 다시 넣었고 음식과 물은 임의로 제공되었습니다. CLP 후 24시간에, 이전 절개를 재개하고 괴사성 맹장을 조심스럽게 절제하였다. 복강을 따뜻한 멸균 식염수 10mL로 세척했습니다. 복부 절개는 다시 층으로 닫혔다. 동물에게 매일 광범위 항생제(Naxcel 5mg/kg)를 투여하고 72시간 실험 기간 동안 부프레노르핀 SR(1.2mg/kg)로 진통을 달성했습니다. 혈소판 응집은 3일 동안 식도 위관 영양법을 통해 CLP 쥐의 하위 집합(CLP + CLOP; n=12)에서 3일 동안 매일 Clopidogrel(10mg/kg/day) 투여에 의해 차단되었습니다. 프로토콜이 끝나면 동물을 깊은 마취하에 희생시켰다. 추가 분석을 위해 혈액과 조직을 수집했습니다.
4.3. 혈소판 분리
동맥혈을 acid-citrate-dextrose vacutainer tube에 넣고 20분 동안 2{26}}0 x g에서 원심분리하여 혈소판이 풍부한 혈장을 얻었다. 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 1μM PGE1을 함유하는 동일한 부피의 HEP 완충액(140mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KCl, 3.8mmol/L HEPES, 5mmol/L EGTA, pH 7.4)과 혼합했습니다. 그런 다음 이 혼합물을 100 x g에서 20분 동안 원심분리하여 나머지 RBC 및 WBC를 펠렛화하고 40 μL의 상청액을 사용하여 혈소판을 계산했습니다. 그런 다음 PRP를 800 x g에서 20분 동안 원심분리하고 상층액을 버리고 펠렛을 Tyrode 완충액(134mmol/L NaCl, 12mmol/L NaHCO3, 2.9mmol/L KCl, 0.34mmol/L Na2HPO4,1)에 재현탁했습니다. mmol/L MgCl2, 10 mmol/L HEPES) 5 mmol/L 포도당 및 3 mg/mL BSA 함유.
4.4. 유세포분석
새로 분리된 혈소판(106)을 50 μL의 Tyrode 완충액에 재현탁했습니다. 혈소판을 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-접합된 항-마우스 CD41(Clone MWReg30, BioLegend, San Diego, CA, USA) 및 Allophycocyanin(APC) 접합된 항-마우스/쥐 CD62P(클론 RMP{ {9}}, Biolegend). MACsQuant Analyzer 10(Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA)을 사용하여 게이트당 최소 10개의 이벤트를 수집하고 FlowLogic 소프트웨어(Innovation, Sydney, Australia)를 사용하여 분석했습니다. 혈소판은 항-CD41의 특이적 결합과 특징적인 전방 및 측면 산란으로 구별되었습니다. CD41 및 CD62P에 대해 양성으로 염색된 혈소판은 활성화된 혈소판으로 지정되었습니다.
4.5. 공초점 및 광학현미경
Sham 또는 CLP 쥐의 혈소판(1{31}}7) 또는 LPS가 있거나 없는 자극을 퍼마녹스 슬라이드(Lab-Tek, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 부착했습니다. 부착된 세포를 30분 동안 10% 포르말린에 고정하고 실온에서 10분 동안 PBS로 3회 세척하고 10분 동안 얼음처럼 차가운 100% 메탄올로 투과화시켰다. 슬라이드를 10% 염소 및 토끼 혈청이 포함된 PBS에서 1시간 동안 차단하고 세척하고 토끼 항-NLRP3항체(NBP{13}}, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA)와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션했습니다. 그런 다음 슬라이드를 세척하고 항토끼 Alexa Fluor 488(A11070, Thermo FisherScientifific)과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했습니다. 슬라이드를 다시 세척하고 Alexa Fluor{19}}접합 토끼 항-ASC 항체(NBP{21}AF647, Novus Biologicals)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했습니다. 대조군은 1차 항체의 생략을 제외하고는 동일하게 처리되었습니다. 제제를 Cytoseal 60(Thermo Fisher Scientific)에 장착하고 Nikon C1(Nikon Inc., Melville, NY, USA) 공초점 주사 현미경에서 분석했습니다. 이미지는 Nikon-Fi1 컬러 카메라(Nikon)가 장착된 Nikon Eclipse 55i 현미경을 사용하여 캡처되었고 NIS-Elements D 3.0 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다.
4.6. 내피 활성화 및 사이토카인의 바이오마커 정량화
Angiopoietin{0}}(MANG20, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 및 Endocan{2}}(MBS039900, MyBioSource, San Diego, CA, USA)의 혈장 수준은 ELISA에 따라 내피 기능 장애의 마커로 측정되었습니다. 제조업체의 프로토콜에 따릅니다. 혈장,신장, 및 폐 IL-1(RLB00, R&D Systems) 및 IL-18(ab213909, Abcam, Boston, MA, USA)을 제조업체의 프로토콜에 따라 ELISA로 정량화했습니다.신장제조업체의 프로토콜에 따라 BioPlex 세포 용해 키트(171304011, BioRad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 폐 용해물을 제조했습니다.
4.7. 폐 손상 평가
Histological evaluation was performed on the lungs via hematoxylin and eosin (H&E)staining. A lung lobe was formalin-fixed. The tissue was subsequently paraffin-embedded and 5-µm sections were stained with (H&E). Sections were evaluated for neutrophil infiltration into the alveolar space. Five sections were scored in a blinded fashion on a scale of0–2 with 0 representing o neutrophils in the alveolar space, 1 representing 1–5 neutrophils in the alveolar space, and 2 representing >폐포 공간에 있는 5개의 호중구. NIS-Elements D 3.{10}} 소프트웨어를 사용하여 40X에서 Nikon DS-Fi1 컬러 카메라(Nikon Inc.)가 장착된 Nikon Eclipse 55i 현미경을 사용하여 이미지를 캡처했습니다. NIS-Elements D 3.0 소프트웨어를 사용하여 치조 벽 두께를 측정했습니다. 데이터는 가짜 값으로 정규화되었습니다.
4.8. 신장 사구체 손상 평가
신장were collected, weighed, and fixed in a 10% buffered formalin solution. Paraffin sections (3 µm) were prepared and stained with Periodic acid-Schiff to assess the degree of glomerular injury on approximately 30 images per section, per rat. Thirtyglomeruli per section were scored in a blinded fashion on a 0–4 scale with 0 representing a normal glomerulus, 1 representing a 25% loss, 2 representing a 50% loss, 3 representing a 75% loss, and 4 representing >다발에 있는 모세관의 75% 손실. 이전에 언급한 것과 동일한 현미경, 카메라 및 소프트웨어를 사용하여 이미지를 캡처했습니다.
4.9. 신장 기능 측정
CLP 절차 동안 카테터를 경정맥에 삽입하고 목 뒤쪽의 피하로 외부화했습니다. 3일 프로토콜이 끝날 때까지 매일 카테터를 헤파린 처리된 식염수로 세척했습니다. 프로토콜의 마지막 날에 쥐는 480nm에서 FITC 시니스트린을 여기시키는 2개의 발광 다이오드로 만들어진 NIC-신장 장치(MediBeacon; Mannheim, Germany)를 조립하기 위해 짧은 이소플루란 마취를 받았습니다. 531 nm, 마이크로프로세서 및 배터리. 이 장치는 양면 접착 패치(MediBeacon)를 사용하여 쥐의 등에 부착되었고 쥐의 등 면도 부위에 설치류 재킷으로 고정되었습니다. 래트를 별도의 케이지에서 15분 동안 회복하도록 하고 기준선 측정을 기록했습니다. 기준선 측정 후, FITC-시니스트린(5 mg/100g 체중; FTC-FS001, MediBeacon)의 일시 주사를 경정맥을 통해 투여한 후 멸균 식염수를 일시 주사하였다. bolus 주입 후 2시간 동안 FITC-sinistrin의 배설 동역학을 경피적으로 측정하고 MDPLab 평가 소프트웨어가 있는 one-compartment 모델을 사용하여 FITC-sinistrin의 제거 반감기(t1/2)를 계산하는 데 사용했습니다. (MediBeacon) 검증된 경험적으로 파생된 변환 계수 [35,36]에서 GFR을 계산합니다.
4.10. 통계 분석
검정력 분석은 10–12 동물/그룹의 n이 0.80의 검정력(1- )과 제1종 오류( ) 0.05로 Sham과 CLP 쥐 사이의 혈소판 활성화 차이를 5~10% 이상 감지할 수 있습니다. 모든 데이터는 평균±SD로 표시됩니다. 모든 데이터는 D'Agostino-Pearson 정규성 테스트를 통해 가우스 분포와 일치하는지 확인했습니다. 사후 분석으로 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 일원 ANOVA로 통계 분석을 수행했습니다. p < 0.05의="" 값은="" 통계적으로="" 유의한="" 것으로="">
저자 기여:
개념화, CAS, JMW 및 DCC; 방법론, JMW 및 D.CC; 검증, OKT, JMW 및 DCC; 형식 분석, MB-R., CAS, OKT, JMW 및 D.CC; 조사, MB-R., CAS, OKT, RWT, CHB, CAG, GAT, JMW 및 DCC; 자원, JMW 및 DCC; 데이터 큐레이션, MB-R., CAS 및 DCC; 쓰기 - 원본 초안 준비, MB-R. 및 CAS; 쓰기 - 검토 및 편집, MB-R., CAS, OKT, RWT, CHB, CAG, GAT, JMW 및 DCC; 시각화, MB-R., CAS, JMW 및 DCC; 감독, OKT 및 DCC; 프로젝트 관리, DCC; 자금 조달, DCC 모든 저자는 출판된 원고 버전을 읽고 동의했습니다.
자금:
이 간행물에 보고된 연구는 수상 번호 P20GM104357 및 P30GM103328로 국립 보건원의 국립 일반 의학 연구소의 지원을 받았습니다. 이 연구는 수상 번호 F31HL149257(OKT), R{6}}HL130456(DCC) 및 R01HL151407(DCC)로 국립 보건원의 국립 심장 폐 및 혈액 연구소와 국립 당뇨병 및 소화기 연구소의 지원을 받았습니다. 그리고신장질병수상 번호 R01DK109133(JMW)에 따라 국립 보건원의 내용 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
기관 검토 위원회 성명서:
이 연구에서 수행된 모든 실험 절차는 동물의 사용 및 관리에 대한 국립 보건원 지침에 따라 수행되었습니다. 모든 프로토콜은 University of Mississippi Medical Center의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다(프로토콜 1487A, 승인 07/02/2019). 동물의 관리 및 취급은 윤리적 동물 치료에 대한 국립 보건원 지침에 따랐습니다.
데이터 가용성 설명:
보고된 결과를 뒷받침하는 모든 데이터는 원고에 표시되며 자유롭게 사용할 수 있습니다.
이해 상충:
저자는 이해 상충을 표현하지 않습니다.
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