Preconditioning-activated AKT는 MDM2–p53 PathwayⅡ를 통해 허혈에 대한 신경 내성을 제어합니다.
Apr 23, 2023
3. 토론
우리의 결과는 PI3K / AKT 신호 전달 경로의 IPC 매개 활성화가 일차 피질 뉴런에서 MDM2-p53 복합체를 제어함으로써 신경 IT를 유발한다는 것을 보여줍니다. 먼저 검증된 IPC 실험 모델을 사용하여 신경 보호 [33,39–41] 측면에서 사전 조건화의 효율성을 확인했습니다.
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우리는 짧은(20분) 산소 및 포도당 결핍(OGD)에 이어 2시간의 재산소화에 의해 유도된 실험적 IPC가 신경 보호를 초래한다는 것을 발견했습니다. OGD(90분) 후 4시간의 재산소화(OGD/R). 우리는 IPC가 대뇌 피질 뉴런에서 caspase-3 활성화를 감소시킨다는 것을 보여줍니다. 이는 후속적이고 더 심각한 허혈성 손상 후 더 적은 세포 사멸과 관련이 있습니다.
pro- 및 antiapoptotic 신호 사이의 균형은 허혈 후 신경 생존을 보장하는 데 필수적입니다 [3,33,38,42–44]. 그러한 사건의 관련성이 출혈성 및 허혈성 생체 내 뇌졸중 모델 모두에서 나타났지만 [43,45], 이러한 신호 경로를 조절하는 메커니즘은 허혈성 내성의 맥락에서 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 항암제 AKT의 역할과 관련 경로는 암 세포[46,47]와 뇌 조직[38,48]에서 광범위하게 연구되었습니다. 그러나 지금까지 허혈 손상에 대한 IPC 매개 신경 관용에서 AKT/MDM2-p53 신호 전달 경로의 역할은 파악하기 어렵습니다.
여기에서 우리는 IPC에 의해 유발된 PI3K/AKT 신호 전달 경로의 활성화가 Ser166에서 MDM2의 인산화를 촉진하여 핵 전위 및 단백질 안정화를 유발하여 caspase-3 활성화를 통해 p53-유도된 세포사멸을 방지함을 발견했습니다. 허혈 후. 인산화를 통한 AKT의 활성화는 뉴런의 생존을 촉진하고[24,49] IT 유도에 기여할 수 있습니다[25,50]. 우리의 결과는 AKT 단백질의 상대적 풍부도가 허혈성 또는 전처리 자극 하에서 변하지 않는다는 것을 보여줍니다. 흥미롭게도 우리는 Ser473에서 AKT의 초기 PI3K 매개 인산화가 전처리 뉴런에서 허혈 유발 p53 안정화를 방지한다는 것을 발견했습니다.
그 효과는 p53 mRNA 수준[33,34,44]의 변형 때문이 아니라 OGD/R 이전의 IPC로 인한 p53 단백질 수준의 감소 때문이었습니다. MDM2는 p53 안정화의 주요 조절자이고 또한 AKT의 직접적인 표적이기 때문에 우리의 결과는 허혈에 대한 신경 내성에서 AKT/MDM2-p53 신호 전달 경로의 역할을 지적합니다. MDM2 mRNA는 OGD[34] 이후 급격히 증가하지만 MDM2 활성은 주로 번역 후 변형, 특히 인산화에 의해 조절됩니다[51]. 이것과 잘 일치하여 IPC 후 인산화에 의해 활성화되면 AKT가 차례로 핵 국소화 신호 근처에 위치한 잔기 Ser166에서 MDM2를 인산화하고[52], 이 효과는 OGD/R 손상 후에도 유지된다는 것을 발견했습니다.
우리의 결과는 Ser166에서 MDM2의 인산화가 p53 불안정화를 통해 IPC 매개 신경 보호 효과를 발휘하기에 충분하다는 것을 보여줍니다. 따라서 여기에서 우리는 허혈성 손상 후 AKT / MDM2-p53 경로의 시간 의존적 활성화를 확인했으며 실제로 IPC 활성화 AKT가 내인성 단백질 안정화뿐만 아니라 이소성 MDM2의 핵 전좌를 유발했음을 입증합니다.
더욱이 AKT는 핵 내에서 활성 상태를 유지하며 PI3K는 산화 스트레스에 반응하여 이동한 다음 AKT 인산화를 설명할 수 있습니다[53]. AKT 또는 AKT 녹다운의 PI3K 매개 인산화의 억제는 세포질에서 MDM2 단백질의 보유를 촉진하고 MDM2의 Ser166 인산화를 방지할 뿐만 아니라 허혈 유발 신경 세포 사멸에 대한 IPC 매개 신경 보호를 방지합니다. 반대로 활성 AKT가 핵 MDM2 단백질에 결합한다는 것을 보여주었습니다.
결과적으로 활성 AKT는 IPC 매개 신경 보호에 기여하는 MDM2의 인산화와 핵 안정화를 모두 촉진합니다. 우리의 결과는 IPC 촉진 신경 보호가 허혈성 손상 후 MDM2 핵 축적을 촉진하는 Ser166에서 MDM2를 인산화하는 PI3K 매개 AKT 활성화에 의존한다는 것을 보여줍니다.
따라서, wortmannin에 의한 PI3K/AKT의 억제 또는 siRNA에 의한 AKT 고갈은 IPC-촉진된 신경보호를 폐지하여 p53 안정화 및 허혈 후 후속 신경세포 사멸을 유도하였다. 따라서 우리의 결과는 허혈성 손상에 대한 신경 생존에서 AKT-MDM2 경로의 IPC 의존적 활성화의 필수적인 역할을 명확히 하는 데 도움이 됩니다.
p53 단백질은 뇌졸중 환자[34,42,54]와 일과성 허혈 발작 환자[3]의 신경세포 사망/생존 결정 예후 조절에 관여합니다. P53 안정화는 허혈/재관류 손상에 대한 사전 조절 매개 신경보호를 손상시킵니다[33]. 따라서 MDM2-p53 상호작용은 이러한 맥락에서 신경 생존과 [34] 허혈 손상에 대한 IPC 매개 내성에 중요할 것입니다 [33].
Thus, the control of such interaction will also have an impact on stroke outcomes. In this context, we recently found that a single-nucleotide polymorphism (SNP) 309T>MDM2 프로모터의 G는 MDM2의 발현을 결정하고 뇌졸중 환자의 회복을 조절합니다[34].
또한 Tp53 유전자 SNP(rs1042522)가 미토콘드리아 p53 안정화 및 허혈에 대한 신경 관용을 조절하는 동시에 뇌졸중 전에 일과성 허혈 발작을 앓는 환자의 기능적 회복을 예측하는 것을 관찰했습니다[3]. 따라서 p53 세포사멸 경로의 제어는 IPC의 신경보호 효과를 보장하는 데 필수적입니다.
이러한 결과는 환자의 이익을 위해 미래에 시행될 수 있는 연구에 대한 병진 접근법을 제공하며, PI3K/AKT–MDM2–p53 신호 경로를 허혈성 뇌졸중에서 사전 조절 촉진 IT 전략의 필수 표적으로 제시합니다. 요약하면, 우리는 IPC로 강화된 PI3K/AKT 신호 전달 경로가 Ser166에서 MDM2의 인산화를 촉진하여 MDM2 핵 전위 및 안정화를 유도하고, 이는 p53 불안정화를 촉진하고 후속적으로 허혈성 손상 후 유도된 세포사멸의 불활성화를 촉진함으로써 신경 IT를 유발함을 입증합니다.
우리의 결과는 허혈성 손상에서 MDM2-p53 세포 사멸 경로를 조절하는 IPC 매개 신경 관용에서 AKT의 조기 활성화의 잠재적 이점을 강조합니다. 이러한 발견은 IT 관련 장애에 대한 새로운 신경 보호 전략을 개발하기 위해 AKT-MDM2-p53 신호 전달 경로를 조절하는 메커니즘을 이해할 수 있는 기회를 강조합니다.
4. 재료 및 방법
4.1. 대뇌 피질 뉴런의 기본 문화
뉴런 배양물은 C57Bl/6J 또는 p53-null(Tp53-/-, B6.129S2, The Jackson Laboratory) 마우스 배아(14.5E) 피질로부터 준비되었습니다. 뉴런은 2% B27과 2mM 글루타민(Invitrogen, Madrid, Spain)이 보충된 Neurobasal 배지에 1.8 × 105개 세포/cm2로 시딩하고 가습된 5% CO2- 함유 분위기에서 37°C로 배양했습니다. 55].
4.2. 산소 포도당 박탈 및 전처리 모델
시험관 내(DIV) 9–1{{10}}일 후, 인큐베이터에서 37°C에서 90분 동안 세포를 배양하여 뉴런을 산소 및 포도당 결핍(OGD)에 노출시켰습니다. 에어록이 장착되어 있고 95% N2/5% CO2로 가스를 지속적으로 주입합니다. 배양 배지(포도당이 없는 완충된 행크스 용액: 5.26mM KCl, 0.43mM KH2PO4, 132.4mM NaCl, 4.09mM NaHCO3, 0.33mM Na2HPO4, 2mM CaCl2 및 20mM HEPES, pH 7.4)는 미리 95% N2로 가스를 공급했습니다. 30분 동안 /5% CO2. 이러한 조건에서 배양 배지의 산소 농도는 Clark 유형 산소 전극으로 측정했을 때 6.7 ± 0.5 μM이었습니다[56,57].
표시된 경우, 뉴런을 허혈 전처리(IPC; 20분 동안 짧은 OGD 후 2시간 재산소화)에 노출시킨 후 후속 장기 허혈(OGD, 90분) 및 4시간 재산소화(IPC + OGD/R)(그림 S1B) ). 동시에 뉴런은 95% 공기/5% CO2 또는 허혈성 전처리(IPC)의 습한 분위기에서 37°C의 정상 산소 상태(Nx)에서 배양되었습니다. 지시된 경우, 이전에 기술된 바와 같이 워트만닌(100nmol/L)의 부재 또는 존재 하에 버퍼링된 행크스 용액(pH 7.4)에서 IPC 30분 전에 뉴런을 배양하였다[19].
4.3. 세포 형질감염
뉴런(8 DIV) 또는 HEK-293T 세포를 MDM2 인간 프로모터로부터 YFP-태그된 Mdm2를 발현하는 플라스미드 벡터로 형질감염시켰다. MDM2p/Mdm2-YFP는 Uri Alon & Galit Lahav(Addgene 플라스미드 # 53962, Watertown, MA, USA)의 선물이었습니다[58]. 필요한 경우 동일한 조건에서 빈 벡터(pYFP)를 컨트롤로 사용했습니다. 제조사의 지시에 따라 Lipofectamine® LTX(Invitrogen, Carlsbad, MA, USA)를 사용하여 플라스미드 형질감염을 수행하였다. 세포를 1.5 μg/μL의 플라스미드 벡터로 형질감염시키고 24시간 후에 사용하였다.
6 DIV 뉴런에서 AKT 녹다운은 작은 간섭 이중 가닥 리보뉴클레오티드(siRNA)를 사용한 형질감염에 의해 달성되었습니다. 표적 서열은 다음과 같습니다: 50–CUCAAGUACUCAUUCCAGAtt–30, 안티센스: 5 0–UCUGGAAUGAGUACUUGAGgg–30 (마우스, s62216, 뉴클레오티드 1006–1025에 해당, GenBank 접근 번호 NM_009652) [59]. 음성 대조군으로는 Silencer™ Select Negative Control No.1 siRNA(siControl)를 사용했습니다. 모든 siRNA는 Ambion®, Invitrogen® 및 Thermo Fischer Scientific(Offenbach, Germany)에서 구입했습니다. protein knockdown 정도에 따라 transfection 3일 후 siRNA의 transfection 효율은 70~80%로 추정되었습니다. 사일런싱 실험을 위해 제조업체의 지침에 따라 Lipofectamine® RNAiMAX(Invitrogen)를 사용하여 뉴런을 siRNA(10nM)로 형질감염시켰습니다. 뉴런은 사용하기 전에 Neurobasal 배지에서 72시간 동안 추가로 배양되었습니다.
4.4. 아폽토시스 세포 사멸의 유세포 분석 검출
뉴런은 PBS(pH 7.4)에서 1mM EDTA 테트라나트륨 염을 사용하여 플레이트에서 조심스럽게 분리되었고 annexin V/APC 및 7-AAD로 염색되었으며, 이전에 설명한 대로 정확하게 수행되었습니다[55].
4.5. Caspase-3 활동 분석
Caspase-3 활성은 세포 용해물[33]에서 제조업체의 지침에 따라 SIGMA의 Fluorimetric Assay 키트 CASP3F를 사용하여 평가하고 405nm의 파장에서 방출 시 판독했습니다. 이 방법은 형광 7-아미노4-메틸 쿠마린(AMC) 모이어티의 방출을 기반으로 합니다. AMC 농도는 AMC 표준을 사용하여 계산됩니다.
4.6. Immunoblots 및 공동 Immunoprecipitation 분석
뉴런은 1% SDS, 2mM EDTA, 150mM NaCl, 12.5mM Na2HPO4 및 1% Triton X-100(NP40: 1% NP40, EDTA diK + 5mM, Tris pH{{13 }} mM, NaCl 135mM 및 10% 글리세롤) 포스파타제 억제제(1mM Na3VO4 및 50mM NaF) 및 프로테아제 억제제(100mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 50µg/mL 항파파인, 50µg/mL 펩스타틴, 50 µg/mL 아마스타틴, 50 µg/mL 류펩틴, 50 µg/mL 베스타틴 및 50 µg/mL 대두 트립신 억제제), 얼음에 30분 동안 보관하고 5분 동안 끓였습니다. 용해된 추출물의 분취량을 SDS 폴리아크릴아미드 겔(MiniProtean®, Bio-Rad)에 적용하고 항체로 밤새 4oC에서 블롯팅했습니다. 사용된 항체는 anti-AKT(9272), anti-p(Ser473)AKT(9271), anti-cleaved caspase-3(Asp175, 9661)(Cell Signaling, Danvers, MA, USA), anti-p53( 554157, BD Biosciences), 항-MDM2(2A10, ab-16895), 항(Ser166)MDM2(ab131355), 항-GFP(ab290; 또한 YFP 검출)(Abcam, Cambridge, UK), 항-LAMIN B(sc-374015, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germany) 및 antiGAPDH(Ambion, Cambridge, UK) 4℃에서 하룻밤. 서양고추냉이 과산화효소 결합 염소 항-토끼 IgG(Pierce, Thermo Scientific) 또는 염소 항-마우스 IgG(Bio-Rad)와 함께 인큐베이션한 후, 막을 Kodak에 노출시키기 전 5분 동안 강화된 화학발광 SuperSignal West Dura(Pierce)와 함께 즉시 인큐베이션했습니다. 1~5분 동안 XAR-5 필름을 사용하고 자동 방사선 사진을 스캔했습니다. 이전에 설명한 대로 ImageJ 1.48v 소프트웨어를 사용하여 밴드 강도를 정량화했습니다[60].
공면역침전 분석을 위해, 뉴런은 위에서 설명한 포스파타제 억제제가 보충된 50mM Tris(pH 7.5), 150mM NaCl, 2mM EDTA, 1% NP-40)를 함유하는 얼음처럼 차가운 완충액에서 용해되었습니다. 원심분리로 파편을 제거한 후, 신경 용해물(100 mg)을 항체 1 mg과 함께 4 °C에서 24시간 동안 배양한 다음 단백질 A-아가로스(GE Healthcare Life Sciences) 10 mL를 첨가하여 4 °C에서 2시간 동안 배양했습니다. ◦다. Immunoprecipitates는 용해 완충액으로 광범위하게 세척되었고 SDS-PAGE에 의해 분석되었으며 지시된 항체로 면역블롯팅되었습니다[61]. 상대적인 단백질 풍부도는 그림 S1에 나와 있습니다. 전체 얼룩 및 젤 스캔은 그림 S3에 포함되어 있습니다.
4.7. 면역세포화학 및 이미지 분석
뉴런을 유리 커버슬립에서 성장시키고 30분 동안 4%(w/v, in PBS) 파라포름알데히드로 고정하고 토끼 항-phosphoAKT(Ser473; 9271; Cell Signaling, MA, USA), 마우스 항-MDM2(2A10, ab-16895), 마우스 항-MAP2(1:500; M#1406, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) [55], 마우스 항-p53(1:200; 554157, BD Pharmingen , San Diego, CA, USA) 및 항-GFP(1:1000; ab290; 또한 YFP 검출에 대해 검증됨). Immunolabeling은 이차 항체 항 토끼 IgG-Cy3 또는 항 마우스 IgG-Cy2 (1:500; Jackson ImmunoResearch. Cambridge, UK)를 사용하여 검출되었습니다.
핵은 40,6-diamidino-2 phenylindole(DAPI; D9542, Sigma-Aldrich)로 염색되었습니다. Coverslip을 세척하고 유리 슬라이드에 SlowFade 광 변색 방지 시약(Invitrogen)에 장착하고 현미경(Nikon Inverted microscope Eclipse Ti-E, (NY, USA), 사전 중심 섬유 조명기 Nikon Intensilight 40X 대물렌즈가 장착됨)을 사용하여 검사했습니다. C-HGFI, 및 흑백 전하 결합 장치 디지털 카메라 Hamamatsu ORCAER 또는 405, 491 및 561 nm의 3개의 레이저를 갖는 스캐닝 레이저 공초점 현미경("Spinning Disk" Roper Scientific Olympus IX81, Tokyo, Japan), 고해상도 이미징을 위한 40×, 63× 및 100× PL Apo 오일 침지 대물렌즈 및 장치 디지털 카메라 Evolve Photometrics 장착.
모든 현미경 설정은 채도 이하의 형광 이미지를 수집하도록 설정되었으며 실험에서 촬영한 모든 이미지에 대해 일정하게 유지되었습니다. ImageJ 1.48v 소프트웨어(National Institutes of Health)로 이미지를 분석했습니다. p(Ser473)AKT 플러스 및 p53 플러스 뉴런의 백분율과 p(Ser473)AKT 및 p53의 최대 단백질 형광 강도의 정량화가 그림 S2A에 나와 있습니다. MDM2-GFP로 형질감염된 뉴런에서 MDM2-GFP의 핵세포질 분포는 내인성 MDM2의 세포질 평균 형광에 대한 핵 평균 형광의 비율로 계산되었으며, 24개의 뉴런(당 6개의 뉴런)에서 측정되었습니다. 4개의 다른 신경 세포 배양 조건)(그림 S2B)[62].
내인성 MDM2 염색 및 pSer473AKT의 최대 핵 형광 강도를 정량화하기 위해 이전에 설명한 대로 40개의 뉴런(4개의 서로 다른 배양에서 조건당 10개의 뉴런)을 측정했습니다(그림 S2C). 그림 5B에 표시된 대표적인 단면 강도 프로파일에서 각 조건 아래에 표시된 p(Ser473)AKT 및 MDM2의 백분율은 핵 평균 형광으로 정량화되었습니다. 모든 경우에서 핵은 DAPI 염색으로 확인되었습니다. wortmannin 또는 siAkt로 처리된 뉴런의 최대 핵 MDM2 형광 강도는 그림 S2D에 나와 있습니다.
4.8. 통계 분석
실험 결과는 일원 분산 분석에 이어 여러 그룹 간의 값을 비교하는 데 사용되는 Bonferroni 사후 테스트로 평가되었습니다. 결과는 평균 ± SEM으로 표현됩니다. Student's t-test는 두 그룹의 값을 비교하는 데 사용되었습니다. 모든 경우에 p < 0.05는 유의한 것으로 간주되었습니다(* p < 0.05 대 Nx; # p<0.05 versus OGD). Statistical analyses were performed using SPSS Statistics 24.0 for Macintosh (IBM).
Cistanche는 어떻게 뉴런을 보호합니까?
Cistanche가 세포 사멸(프로그램된 세포 사멸)을 줄이고 신경 생존을 촉진하여 신경 세포를 보호할 수 있다는 증거가 있습니다. Apoptosis는 손상되거나 원치 않는 세포를 제거하기 위해 신체에서 발생하는 자연스러운 과정이지만 과도하거나 부적절하게 발생하면 해로울 수 있습니다. Cistanche는 실험실 연구에서 세포 사멸을 억제하는 것으로 밝혀졌으며 이 효과는 손상으로부터 뉴런을 보호하는 데 도움이 될 수 있습니다.
또한 Cistanche에는 신경 보호 효과가 있는 것으로 밝혀진 몇 가지 생체 활성 화합물이 포함되어 있습니다. 예를 들어 산화 스트레스와 염증으로부터 뉴런을 보호하는 것으로 밝혀진 에키나코사이드가 포함되어 있습니다. 또한 항염증 및 항산화 특성이 있는 것으로 밝혀진 액티오사이드를 함유하고 있습니다.
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