비만 또는 제2형 당뇨병 관련 신장 질환이 있는 환자에서 신장 골수성 관련 단백질 8 발현의 예측적 중요성
Mar 16, 2022
연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com
쿠와바라 다카시게1, 모리 키요시 1,2*, 카사하라 마사토1,3, 요코이 히데키1, 이마마키 히로타카1, 이시이 아키라1, 코가 켄이치1, 스가와라 아키라4, 야스노 신지3, 우에시마 겐지3, 모리카와 타카시5,코니시 요시오5, 이마니시 마사히토5, 니시야마 아키라6, 카즈와 나카오1,2, 무코야마 마사시1
1일본 교토 의과대학 대학원 의과대학 의학 및 임상과학과
2일본 교토대학 대학원 의과대학 의료혁신센터
3일본 교토 교토대학병원 임상중개과학연구소 EBM 연구부
4일본 오사카 오사카 적십자병원 신장내과,
5 오사카 시립 종합병원 신장·고혈압과
6 일본 가가와현 가가와대학 의과대학 약리학교실
추상적인
배경 및 목적: 우리는 toll-like receptor 4(TLR4)와 이의 내인성 리간드 중 하나인 골수성 관련 단백질 8(MRP8 또는 S100A8)이 마우스에서 당뇨병성 신병증의 진행에 중요한 역할을 한다고 보고했습니다. 이 연구의 목적은 의의의 중요성을 평가하는 것이었다.신장환자에서 MRP8 발현비만- 또는 제2형 당뇨병 관련신장 질환. 방법: 당뇨병, 비만 또는 대조군 대상에서 실시간 RT-PCR 및 면역조직화학(각각 n=28 및 65) 및 기준선과의 연관성에 의해 신장 생검 샘플의 MRP8 mRNA 및 단백질 발현 수준을 결정했습니다. 및 예후 매개변수를 분석했습니다. 염증유발 유전자 발현에 대한 MRP8의 효과는 대식세포를 사용하여 조사되었다. 결과:신장MRP8 유전자 및 단백질 발현 수준은 대조군에 비해 비만군 또는 당뇨병군에서 상승하였다. 모든 피험자 중에서 단변량 선형 회귀 분석에 따르면 기준선에서 사구체 MRP8-양성 세포수와 세뇨관간질 MRP{2}}양성 면적은 각각 당뇨병성 신병증(예: 수축기 혈압, 단백뇨 및 혈청 크레아티닌)뿐만 아니라 사구체 경화증 및 세뇨관 간질 섬유증의 정도와도 관련이 있습니다. 1년 후의 요단백 수치를 예측하는 독립적인 요인은 다변량 분석에 의해 조사되었으며 여기에는 사구체 MRP{3}}양성 세포 수(b=0.59, P,{6}}.001), 단백뇨가 포함되었습니다. 알려진 위험에 대한 조정 후 기준선에서 (b=0.37, P=0.002) 및 수축기 혈압(b=0.21, P=0.04) 요인. MRP8단백질 발현은 CD 양성 대식세포와 위축성 세관에서{17}}관찰되었습니다. 배양된 마우스 대식세포에서 MRP8 단백질 유도 염증성 사이토카인 발현은 또한 TLR{22}}의존적 방식으로 MRP8의 자동 유도를 유발했습니다.
결론: 사구체 MRP8 발현은 TLR4 신호전달을 통해 대식세포의 염증 변화를 유도함으로써 비만 또는 제2형 당뇨병 환자에서 단백뇨의 진행과 관련이 있는 것으로 보입니다.
소개
만성염증은 당뇨병의 발병기전에 중요한 역할을 합니다.비만및 심혈관 합병증 [1]. 만성 염증 과정에서 타고난 면역 수용체와 내인성 리간드의 관련이 관련되어 있습니다. 골수 관련 단백질 8(MRP8, S100A8 또는 calgranulin A로도 알려짐)은 원래 호중구 및 단핵구에서 세포질 칼슘 결합 단백질로 확인되었으며[2], 톨 유사 수용체 4(TLR4)에 대한 강력한 내인성 리간드로 널리 인식되었습니다. ) 패혈성 쇼크, 혈관 및 자가면역 장애를 포함한 다양한 질병에서 [3,4,5]. 우리는 최근에 MRP8/TLR4 신호전달이 고지혈증 유발 당뇨병성 신병증의 진행에 중요한 역할을 한다고 제안했습니다[6]. 사구체 대식세포와 집합관 세포는 각각 당뇨병성 신병증[6] 및 신장 섬유증[7]의 마우스 모델에서 MRP8의 주요 공급원입니다. 일반적으로 혈류에서 결합 파트너 MRP14와 이종이량체 복합체를 형성하는 MRP8의 혈장 수준은 비만 대상에서 증가합니다[8,9]. 그러나 비만 또는 비만 환자에서 MRP8의 신장 발현을 조사한 보고는 없습니다.유형2당뇨병및 신장 예후와의 연관성.
이 연구의 목적은 MRP8의 mRNA와 단백질 발현 수준을 결정하는 것이었습니다.신장일본 당뇨병성 신병증(DN) 환자의비만- 관련 사구체병증(ORG), 최소 변화 신증후군(MCNS) 또는 경미한 사구체 이상(MGA)을 모두 신장 생검으로 진단하고, 신장 MRP8 발현이 신장 결과를 예측할 수 있는지 여부를 평가합니다.
재료 및 방법
윤리 선언문
인간 연구는 헬싱키 선언에 명시된 원칙에 따라 수행되었으며 교토 대학 의과 대학과 오사카 시립 종합 병원의 인간 연구에 관한 윤리 위원회에서 각각 승인되었습니다. 모든 참가자는 서면 동의서를 제공했습니다. 동물 연구 프로토콜은 교토 대학 대학원 대학원 동물 연구 위원회(허가 번호: Med Kyo 13318)의 승인을 받았습니다. 모든 동물 수술은 나트륨 펜토바르비탈 마취하에 시행되었으며 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.
연구 과목
다음을 가진 단백뇨 환자비만또는 신장 생검을 받은 제2형 당뇨병이 이 연구에 등록되었습니다. 감염성 질환, 암, 간 질환 또는 콜라겐 질환이 있는 환자는 제외하였다. 단백뇨는 최소 2회의 연속 측정에서{1}} 0.5g/g 크레아티닌 또는 300mg/g 크레아티닌을 초과하는 요 알부민을 초과하는 요단백으로 정의되었습니다.비만25보다 큰 체질량 지수(BMI)로 정의되었습니다.{1}}(kg/m2). 제2형 당뇨병은 세계보건기구의 기준에 따라 진단되었습니다. 신장 생검 입원 시 생화학적 측정은 단면 분석을 위한 기준 특성으로 사용되었습니다. 예상 사구체여과율(eGFR)은 일본신장학회에서 제안한 단순화된 예측식을 사용하여 계산되었습니다. eGFR(ml/min/1.73 m2)=1946 [연령(년)]20.287 6 [혈청 크레아티닌(mg perdl)]21.094 60.739(여성용), 이는 MDRD의 검증된 국소 변형[ 10]. 크레아티닌의 혈청 농도는 효소적 방법을 사용하여 측정되었습니다.
면역조직화학은 2000년부터 2011년까지 교토대학병원 의학임상과학부에서 신장 생검을 받은 일본 환자 65명을 대상으로 분석했다. 이 기간 동안 모든 환자의 생검으로 입증된 진단은 파일 S1의 표 S1에 나열되어 있습니다. 이 연구에서 조사한 피험자는 DN(n=19), ORG(n=10) 및 MGA(n=19) 또는 MCNS(n=17). 사용 가능한 잔여 샘플이 10개 미만의 사구체를 포함했기 때문에 이러한 범주의 일부 사례는 제외되었습니다. DN의 정의는 (1) 당뇨병 발병 후 5년 이상의 지속 기간, (2) 미세 또는 거대 단백뇨의 존재, (3) 사구체 기저막 비후, 간간막 확장, 결절과 같은 DN과 양립 가능한 조직병리학적 변화로 구성됩니다. 경화증(Kimmelstiel-Wilson 결절) 및/또는 세동맥 유리질증, (4) 신장 장애의 다른 원인 배제 [11]. ORG는 두 가지가 모두 있는 대상에서 국소 분절 사구체 경화증 및/또는 사구체 비대증으로 형태학적으로 정의되었습니다.비만및 단백뇨, 그 정의는 위에 설명되어 있습니다[12,13].
mRNA 발현 분석을 위해 18S ribosomal RNA(rRNA) 수준이 real-time RT-PCR에 의한 검출 민감도 한계보다 낮은 저품질 시료는 제외하였다. 등록된 피험자는 2000년에서 2010년 사이에 오사카 시립 종합 병원에서 신장 생검을 받은 22형 당뇨병 환자와 생검에서 입증된 MGA를 가진 6명의 비당뇨 대조군 피험자로 구성되었습니다.
표 1과 2는 각각 면역조직화학 검사 또는 유전자 발현 분석으로 검사한 환자의 기준선 임상적 특징을 요약한 것이다. 광학 현미경의 경우 조직 표본을 표준 절차에 따라 처리했습니다. 절편은 hematoxylin-eosin, 과요오드산-Schiff, 과요오드산 메테나민은 또는 Masson trichrome으로 염색하였다(그림 S1). 전체 사구체 중 전체 경화증이 있는 사구체 수와 세뇨관간질 섬유증의 상대적 면적 비율은 진단 및 임상 데이터를 알지 못하는 2명의 병리학자에 의해 독립적으로 평가되었습니다.
cistanche의 효과: 신장 질환 치료
신장 결과의 정의
선형 회귀 분석과 로지스틱 회귀 분석을 통해 다음 두 가지 예후 지표를 각각 조사했습니다. 기준선에서 또는 만성 투석의 시작에서.
면역조직화학
MRP8 및 CD68의 면역조직화학은 다음을 사용하여 수행되었습니다.신장4% 완충 파라포름알데히드로 고정된 섹션(두께 4mm). 시트레이트 완충액으로 항원을 회수한 후, 신장 절편을 10% 염소 혈청과 함께 배양한 다음 마우스 항-인간 MRP8(1:100; BMA biomedicals, Augst, Switzerland)[14] 또는 마우스 항-인간 CD68 항체(1:50 ; DAKO, Ely, UK), 각각. 1차 항체는 양고추냉이 퍼옥시다제 결합 2차 항체와 3,{14}디아미노벤지딘 사염산염(Dako USA, Carpinteria, CA)으로 시각화되었습니다. 핵은 헤마톡실린으로 대조염색되었다. MRP{15}}양성 세포는 10개 이상의 사구체에서 계산되었으며, MetaMorph 7.5software(Molecular Devices, Downingtown, PA, USA ). CD{20}} 및 MRP{21}}양성 세포의 공동 국소화는 직렬 섹션으로 평가되었습니다. 첫 번째 항체 없이 염색된 음성 대조군에서는 MRP8이나 CD68 신호가 없었습니다(그림 S2). 항-MRP8 항체를 20몰 과량의 재조합 인간 MRP8 단백질(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)과 함께 4uC에서 밤새 사전 인큐베이션하면 염색이 완전히는 아닐지라도 현저하게 감소되어 항체의 특이성을 추가로 뒷받침합니다(그림 S3). .
신장을 치료하는 Cistanche
mRNA 발현 평가
겨울 왕국신장섹션은 이전에 설명한 대로 레이저 캡처 미세 절개(LM200; Olympus, Tokyo, Japan)에 의해 사구체 및 비사구체 조직으로 분리되었습니다[15]. 총 RNA는 RNeasy 미니 키트(Qiagen, Tokyo, Japan)로 추출했습니다. mRNA 발현 수준은 TaqMan 실시간 PCR(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에 의해 결정되었습니다[16,17]. 모든 유전자의 발현 수준은 18S rRNA(internal control) 수준으로 표준화하였다. 프라이머 및 프로브 서열은 파일 S1의 표 S2를 참조하십시오. 진핵생물 18S rRNA는 사전 개발된 TaqMan 분석 시약(Applied Biosystems)으로 검출되었습니다.
표 1. 면역조직화학에 의해 MRP8 단백질 발현에 대해 분석된 신장 생검 환자의 기준선 임상 특성.
MGA: 경미한 사구체 이상, MCNS: 최소 변화 신증후군, ORG:비만관련 사구체병증, DN: 당뇨병성 신병증, BMI: 체질량 지수, BUN: 혈액 요소 질소, CRP: C 반응성 단백질. 데이터는 6 SD를 의미합니다. *MGA, MCNS, ORG 및 DN 그룹 간의 전반적인 차이는 ANOVA.doi:10.1371/journal.pone.0088942.t001에서 비교했습니다.
대식세포의 MRP8 치료
골수 유래 대식세포는 이전에 설명한 대로 C57BL/6J 유전적 배경(Oriental BioService, Kyoto, Japan)에서 야생형 또는 TLR4 녹아웃(KO) 마우스[18]에서 생성되었습니다. 간단히 말해서, 적혈구의 용해 후, 골수 세포를 20% 소태아 혈청 및 50ng/ml 재조합 인간 대식세포-집락 자극 인자(Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)를 함유하는 배지에 재현탁시키고, 다음에서 배양하였다. 5% CO2 대기에서 37uC. 7일째에, 대식세포를 재조합 마우스 MRP8(Abnova, Taipei, Taiwan) 또는 비히클과 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. Polymyxin B(25 mg/ml, NacalaiTesque, Kyoto, Japan)를 이전에 설명한 대로 내독소의 오염을 최소화하기 위해 각 웰에 첨가했습니다[3,19]. Noendotoxin은 ToxinSensorChromogenic LAL Endotoxin Assay Kit(GenScript, Piscataway, NJ, USA)에 의해 25mg/ml의 폴리믹신 B와 함께 이후 테스트된 MRP8의 모든 농도에서 검출되었습니다. RNeasy MiniKit으로 세포의 총 RNA를 추출하고, 인터루킨-1 베타(IL{23}}b), 종양 괴사 인자-알파(TNFa) 및 MRP8의 mRNA 발현 수준을 TaqMan 실시간으로 측정했습니다. RT-PCR. 모든 유전자의 발현 수준은 설치류 GAPDH 수준에 의해 정규화되었습니다(내부 대조군, 사전 개발된 TaqMan 분석 시약). Real-Time PCR을 위한 프라이머 및 프로브 시퀀스는 파일 S1의 표 S2에 나열되어 있습니다.
통계 분석
데이터는 평균 6 SD로 표시되거나 적절한 경우 695% 신뢰 구간(CI)을 의미합니다. 4개 그룹 간의 비교를 위해 Bonferroni의 사후 분석을 사용한 one-way 또는 two-way ANOVA를 사용하고 x2 검정을 사용하여 범주형 변수를 비교했습니다. 적절한 경우 두 그룹 간의 비교를 위해 학생의 짝지어지지 않은 t-검정을 적용했습니다. Spearman 상관 계수는 두 변수 간의 연관성을 결정하기 위해 추정되었습니다. 생검 1년 후 사구체 또는 세뇨관간질 MRP8 발현 또는 요단백 수준의 정도를 결정하는 기준선 공변량의 효과를 조사하기 위해 단변량 및 다변량 선형 회귀 분석을 수행했습니다. 로지스틱 회귀 분석을 사용하여 신장 사건의 발생을 예측하는 설명 변수를 분석했습니다. 모든 데이터는 StatView 5.{9}} 소프트웨어(SAS InstituteInc., Cary, NC, USA)를 사용하여 분석되었습니다. P 값{10}}.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
cistanche의 효과: 신장 질환 치료
결과
우리는 MRP8 단백질 발현 수준을 비교했습니다.신장DN, ORG 및 비비만, 비당뇨병 대조군(MGA 및 CNS) 그룹 중에서. 면역조직화학 분석에서 DN의 사구체 MRP8-양성 세포수(그림 1A)와 세뇨관간질 MRP8-양성 영역(그림 1B)이 MGA, MCNS, 및 ORG(P<0.01). org="" subjects="" also="" showed="" a="" tendency="" of="" elevated="" mrp8expression="" compared="" to="" mga="" and="" mcns="" (fig.="" 1a,="" 1b).="" furthermore,="" glomerular="" mrp8="" mrna="" expression="" levels="" in="" dn="" subjects="" were="" significantly="" higher="" compared="" to="" non-dm="" control="" subjects="" (p,0.01,="" fig.="" 1c).="" in="" non-glomerulus="" tissues,="" mrp8mrna="" expression="" levels="" were="" much="" lower="" than="" those="" in="" glomeruli,="" both="" in="" non-dm="" and="" dm="" groups.="" abundant="" mrp8="" protein="" expression="" in="" the="" tubulointerstitium="" of="" dn="" cases="" was="" not="" clearly="" reflected="" into="" increased="" mrna="" expression,="" which="" may="" be="" partly="" caused="" by="" deposition="" of="" blood-derived="" proteins="" in="" the="" tubulointerstitium="" as="" discussed="" in="" the="" next="" section.="" as="" shown="" in="" representative="" photos="" (fig.="" 1d–g,="" see="" fig.="" s4="" in="" detail),="" renal="" biopsy="" samples="" from="" mga="" and="" mcns="" subjects="" showed="" few="" mrp8-positive="" cells="" in="" glomeruli="" (fig.="" 1d,="" 1e="" and="" fig.="" s4).="" in="" org="" subjects,="" somemrp8-positive="" cells="" appeared="" in="" glomeruli="" and="" tubulointerstitium(fig.="" 1f="" and="" fig.="" s4).="" in="" dn="" subjects,="" a="" marked="" increase="" of="" mrp8-expressing="" cells="" in="" glomeruli="" and="" significant="" expansion="" of="" mrp8-positive="" areas="" in="" the="" tubulointerstitium="" were="" observed="" in="" a="" focal="" manner="" (fig.="" 1g="" and="" fig.="" s4).="" of="" note,="" mrp8-positive="" cells="" were="" absent="" in="" nodular="" sclerosing="" lesions="" of="" diabetic="" glomeruli="" (fig.="" s4:dn="" case="" 2,="" 3)="" as="" described="" previously="" for="" sclerotic="" lesions="" in="" anca-associated="" glomerulonephritis="" [20].="" paired="" immunohistochemistry="" for="" cd68="" and="" mrp8="" in="" serial="" sections="" suggested="" thatmrp8="" signals="" were,="" at="" least="" in="" part,="" observed="" in="" macrophages="" expressing="" cd68="" (fig.="" 2),="" as="" we="" reported="" in="" a="" mouse="" model="" of="" diabetic="" nephropathy="" [6].="" besides,="" focally="" injured="" atrophic="" tubular="" epithelial="" cells="" also="" strongly="" expressed="" mrp8,="" which="" were="" surrounded="" by="" mrp8(+)-,="" cd68(+)-positive="" macrophages="" (fig.="" 2,="" fig="" s4:="" dn="" case="" 3-5).="" in="" the="" cases="" with="" nephrotic="" range="" proteinuria,="" mrp8="" staining="" was="" also="" observed="" along="" brush="" borders="" of="" proximal="" tubules="" both="" in="" mcns="" and="" dn="" cases="" (fig.="" s4).="" since="" the="" sample="" number="" of="" mrna="" expression="" was="" too="" small="" for="" multivariate="" analysis,="" the="" following="" analyses="" were="" performed="" using="" data="" from="" patients="" studied="" by="">
표 2. 실시간 RT-PCR로 MRP8 mRNA 발현을 분석한 신장 생검 환자의 기준 임상 특성.
사이의 연관성신장신장 생검 당시의 MRP8 신호 및 기준 임상 파라미터를 횡단면으로 분석하였다(표 3). 단변량 분석에서 사구체 및/또는 세뇨관간질 MRP8 단백질 발현은 연령, 수축기 및 확장기 혈압, 요단백, 혈청 크레아티닌, BUN 및 HDL 콜레스테롤, eGFR, 전체 사구체 경화증 및 세뇨관간질 섬유증의 정도와 유의한 상관관계가 있었습니다. 이러한 매개변수는 공선성으로 인해 확장기 혈압, eGFR 및 BUN을 제외하고 다변수 분석을 통해 추가로 조사되었습니다. 세뇨관간질 섬유증의 비율은 사구체MRP8 신호(b=0.62, 조정 P=0.{12}}2) 및 tubulointerstitialMRP8 신호(b=0.85, 조정 P ,0.001), 각각. 또한, 세뇨관간질 MRP8 신호는 기준선 단백뇨와 독립적으로 상관관계가 있었습니다(b=0.20, 조정된 P=0.01). 사구체 또는 세뇨관 간질의 MRP8 신호와 임상 매개변수 사이의 산점도 분석은 MCNS군이 특히 요단백 및 혈청 LDL 콜레스테롤 수치와 관련하여 다른 그룹과 뚜렷한 분포 패턴을 보입니다(그림 S5A-D, S6A-D). MCNS 그룹을 제외하면 MRP8 신호와 요단백 또는 혈청 LDL-콜레스테롤 수치 간의 상관관계가 개선되었습니다(그림 S5E–F, S6E–F). 따라서 우리는 MCNS 환자를 제외한 하위 분석을 수행했으며 다변량 분석을 통해 요단백이 사구체MRP8 신호와 상관관계가 있는 독립적인 요인임을 발견했습니다(표 4; b=0.36, 수정 P=0.03 ).
다음으로 선형회귀분석 또는 로지스틱회귀분석을 수행하여 1년 후의 단백뇨와 1년 이내의 신장질환 정도인 신장 결과를 예측하는 설명인자를 확인하였다. 사구체와 세뇨관 간질 MRP8 신호 사이에 좋은 연관성이 있었기 때문에(그림 S7, R=0.67,P,0.{11}}01), 이러한 매개변수는 대안적으로 추가 분석에 등록되었습니다. . 우리는 다중 회귀 분석을 통해 신장 생검 후 1년에 기준 매개변수와 요단백 간의 연관성을 평가했습니다. 표 5에서 볼 수 있듯이 사구체 MRP8 신호(b=0.59, 수정 P,0.001)는 1년 후 단백뇨의 정도와 기준선 수축기 혈압(b {{13} }.21, 수정 P=0.04) 및 기준선 단백뇨(b=0.37, 수정 P=0.002)였습니다. 이러한 매개변수는 신장 기능 장애(혈청 크레아티닌), 전체 경화증 및 세뇨관 간질 섬유증의 정도를 포함하여 알려진 다른 당뇨병성 신병증 위험 인자와 무관했습니다[11,21-24]. 반면에, tubulointerstitial MRP8 신호(b=0.34, 수정 P=0.09)는 1년 후 요단백 수준에 대한 독립적인 예측 인자가 아니었습니다. 신장 생검 후 1년 이내에 7명의 환자(DN에서 6명, ORG 사례에서 1명)에서 신장 관련 사건이 발생했습니다. 단변량 분석에 따르면 사구체 경화증 및 세뇨관 간질 섬유증, 사구체 및 세뇨관 간질 MRP8 신호의 정도뿐만 아니라 기준선에서의 혈압, 신장 기능 장애 및 요단백 수준이 신장 사건의 발생에 대한 중요한 예측 인자였습니다. 그러나 다변량 분석에 의해 공변량은 서로 상쇄되었으며(파일 S1의 표 S3), 이러한 매개변수 간의 높은 상관 관계로 인해 가능성이 높습니다.
마지막으로, 우리는 배양된 대식세포를 사용하여 TLR4에 대한 내인성 리간드로서 MRP8의 효능을 조사했습니다. 야생형 마우스의 골수 유래 대식세포에서 IL-1b 및TNFa와 같은 전염증성 사이토카인 유전자의 MRP8 단백질 유도 상향 조절과 1{{ 15}}–1000ng/ml. MRP8의 이러한 효과는 TLR4 KO 마우스에서 얻은 대식세포에서 대략 2/3로 억제되었습니다(P,0.01)(그림 3).
그림 1. MRP8에 대한 면역조직화학 및 mRNA 분석신장생검 샘플. 사구체 MRP{{0}}양성 세포 수(A) 및 세뇨관간질 MRP8-양성 영역(B)의 정량화. 사구체 및 비-사구체 분획(C)에서 MRP8의 mRNA 발현. 열린 막대: MGA 또는 MCNS인 비비만, 비당뇨병 대조군, 닫힌 막대: ORG 또는 DN(A–C). MGA, MCNS, ORG 및 DN 그룹(D–G)의 대표 사진. MGA: 경미한 사구체 이상, MCNS: 최소 변화 신증후군, ORG: 비만 관련 사구체병증, DN: 당뇨병성 신병증. *P,0.01.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g001
논의
본 연구는 MRP8이 ORG 및 비비만, 비당뇨병 대조군(MGA 및 MCNS)에 비해 DNas 환자의 사구체 및 세뇨관 간질에서 풍부하게 발현된다는 것을 입증했습니다. 또한, ORG 대상에서 MRP8 발현 수준은 MGA 또는 MCNS 대상보다 높은 경향이 있었습니다. 모든 피험자를 포함한 기본 횡단면 조사에서 단변량 선형 회귀 분석에 따르면 사구체 MRP8-양성 세포 수와 세뇨관 간질 MRP{6}}양성 면적은 각각 다음과 같은 다양한 알려진 위험 요소와 상관관계가 있었습니다. 당뇨병성 신병증(수축기 혈압, 단백뇨, 혈청 크레아티닌 등) 뿐만 아니라 사구체 경화증 및 세뇨관간질 섬유증의 정도가 있습니다. 다변량 분석에 따르면 세뇨관 간질 MRP8-양성 영역은 단백뇨 및 세뇨관 간질 섬유증과 유의한 상관관계가 있었습니다. 사구체 MRP8-양성 세포 수는 1차 분석에서 세뇨관간질 섬유증과 유의한 상관관계가 있었고, MCNS 그룹을 제외한 하위 분석에서는 단백뇨와 유의한 상관관계가 있었습니다. Immunohistochemistry는 MRP8이 CD68(+)-발현 대식세포와 위축성 세뇨관에 의해 적어도 부분적으로 발현되었음을 나타냅니다. 이러한 연구 결과는 다음과 같은 가능성을 제기합니다.신장사구체 또는 세뇨관간질의 MRP8 신호는 당뇨병성 신병증의 새로운 표지자 역할을 할 수 있습니다.
그림 2. 당뇨병성 신증 사례의 연속 섹션에서 CD68 및 MRP8 단백질 발현의 국소화. 한 쌍의 신장 표본(A 및 C, 또는 B 및 D)에서 CD68(A, B) 및 MRP8 발현(C, D)의 발현. 화살표는 CD68 및 MRP8 신호의 공동 위치를 나타냅니다.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g002
예후 연구에서 다변수 분석에 따르면 신장 생검 후 1년의 요단백 수치는 기준선에서 사구체 MRP{0}}양성 세포 수, 요단백 및 수축기 혈압과 독립적으로 연관되어 있습니다. 참고로 사구체 MRP8 발현은 일변량 분석에서 1년 후(b= 0.87), 베이스라인 요단백(b=0.78)보다 훨씬 더 강한 요단백과 가장 강한 상관관계를 보였다. 부분적으로는 사구체 MRP8 발현이 MCNS 환자에서 관찰되는 것과 같은 '양성' 형태의 단백뇨에서 크게 증가하지 않기 때문입니다. MCNS 환자의 단백뇨 수준은 신장 생검으로 진단할 때 매우 높지만 일반적으로 면역억제 요법 시작 후 1년 이내에 해결됩니다. 이러한 발견은 사구체 MRP8 발현이 기저 단백뇨 또는 전체적인 사구체 경화증 및 세뇨관간질 섬유증을 평가하는 일상적인 병리학적 분석으로 대체될 수 없는 질병 표지자로서의 독특한 예측 특성을 가질 수 있음을 시사합니다. 더욱이, 우리는 사구체 MRP8 발현이 단순한 표지자 또는 방관자가 아니라 아래 논의된 바와 같이 사구체 손상의 적극적인 역할을 한다고 추측합니다.
다중회귀분석에 등록된 설명변수로 계산된 결정계수(R2)는 각각 0.52*와 0.74#이었다. y, 년; 혈압, 혈압; gCr, g 크레아티닌; T-콜, 총 콜레스테롤; HDL-콜, HDL 콜레스테롤; LDL-콜, LDL 콜레스테롤; GS, 사구체 경화증; TI, tubulointerstitial.doi:10.1371/journal.pone.0088942.t003
표 4. MCNS 그룹 제외 후 기준 임상 파라미터와 MRP8 신호 간의 관계에 대한 하위 분석.
표 5. 신생검 1년 후 요단백 수치 예측인자 규명을 위한 다중회귀분석
그림 3. 골수 유래 대식세포에 대한 MRP8의 효과. 골수 유래 대식세포(BMDM)를 재조합 마우스 MRP8로 4시간 동안 자극했습니다. 오차 막대는 95% CI를 나타내며 통계 분석은 로그 변환 값으로 수행되었습니다. 양방향 ANOVA는 유전자형, MRP8 농도 및 3개 유전자 모두의 발현에 대한 이들의 상호작용에 상당한 영향을 미치는 것으로 나타났습니다(모든 비교에서 P,{11}}.{18}}01). n=4. WT, 야생형; KO, 녹아웃; IL{15}}b, 인터루킨 1 베타; TNFα, 종양 괴사 인자-알파. *다른 농도 중 P,0.01, 유전자형 중 #P,0.01.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g003
종단 연구의 또 다른 시도에서 로지스틱 회귀 분석은 1년 이내에 신장 질환의 발생에 대한 독립적인 예측 변수를 찾지 못했습니다. 우리는 이것이 부분적으로 tubulointerstitial MRP8 발현과 tubulointerstitial fibrosis가 단변량 분석에서 신장 사건에 대한 두 가지 강력한 예측 인자 였기 때문에 부분적으로 추측하지만 다변량 분석에서는 그 중요성이 서로 취소되었습니다. 이 두 매개변수는 강한 상관관계를 보여(R=0.68, P,{3}}.001)(그림 S8), 이 두 매개변수가 신장 사건을 예측하는 것과 동일할 수 있음을 시사합니다. 실제로, interstitial MRP8 발현은 Masson trichrome 염색에 의해 평가된 interstitial fibrosis와 상당히 유사한 패턴을 보였다. 간질 MRP8의 양은 점상 분포에서 사구체 MRP8의 특징과 다른 특징을 갖는 대식세포의 신호보다는 위축성 세뇨관의 양성 신호에 크게 의존합니다. 게다가, 작은 표본 크기, 짧은 관찰 기간, 그리고 신장 질환이 발생한 소수의 피험자는 검출력을 감소시켰을 수 있습니다. 세뇨관 상피 세포에서의 MRP8 발현은 신장 섬유증의 마우스 모델에서 세뇨관간질 염증의 진행에 원인이 되는 역할을 하기 때문에[7], DN에서 tubulointerstitial MRP8의 역할을 명확히 하기 위해서는 추가 분석이 필요할 것입니다.
우리의 이전 연구[6]에 따르면, MRP8 mRNA는 MGA가 있는 대조군 대상체와 비교하여 인간 DN 대상체의 사구체 분획에서 우세하게 상향 조절되었습니다. 한편, MRP8 단백질 발현은 사구체 뿐만 아니라 세뇨관간질에서도 관찰되었다. 이와 관련하여 DN의 tubulointerstitium에서 MRP8 염색의 두 가지 뚜렷한 패턴이 있음을 주목해야 합니다. 하나는 심하게 위축된 세뇨관에서 강렬하고 국소적인 염색이었습니다. 다른 하나는 ORG 및 MCNS에서도 발견되는 근위 세뇨관의 브러시 경계를 따라 분포된 약한 염색이었습니다. 후자의 신호는 혈액에서 유래하고 근위 세뇨관에 의해 재흡수되는 MRP8 단백질을 나타낼 가능성이 높으며, 이는 MRP8 mRNA 발현 증가를 동반하지 않아야 합니다. MRP8 이외의 단백질과 관련하여 우리와 다른 사람들은 최근에 신장 합성이 아닌 재흡수에 의해 야기되는 근위 세뇨관에서 면역 반응성 단백질 검출의 유사한 현상을 보고했습니다[25,26]. 반면에, 특히 사구체 삼출성 병변과 위축성 세뇨관 주변의 심하게 흉터가 있는 섬유성 병변에서는 항체 흡수 시험에서 약간의 MRP8 염색이 남아 있기 때문에 비특이적 신호의 존재를 완전히 부정할 수 없습니다(그림 S3).
사구체 MRP8 신호는 주로 DN 피험자에서 구두점 패턴을 보여주었습니다(그림 1, 그림 S4). CD68과 MRP8은 모두 마우스 모노클로날 항체에 의해 검출되었기 때문에 이중 면역염색이 아닌 연속 절편으로 이들 분자의 위치를 평가했습니다. MRP8의 염색 패턴은 IgAnephritis[27], membranoproliferative glomerulonephritis[14], ANCA 관련 사구체신염[20]을 포함한 다른 염증성 신장 질환의 패턴과 양립했으며, 여기서 우리가 보고한 대로 대식세포가 MRP8의 주요 공급원으로 제안되었습니다. 설치류 모델[6]. 또한 호중구는 혈관 합병증에 영향을 미치는 MRP8의 또 다른 원인으로 간주될 수 있습니다[28]. 현재, 우리는 왜 MRP8이 사구체에 침투하는 골수 계통 세포에서 주로 상향 조절되는지 분자 메커니즘을 조사하고 있습니다. 시험관 내 연구에서는 MRP8이 염증성 사이토카인 발현을 유도하고 또한 TLR 의존적 방식으로 대식세포에서 MRP8 자체의 발현을 강화하는 것으로 나타났습니다. 또한, MRP{19}}양성 세포는 결절 경화 병변에 없었으며, 이는 사구체 MRP8이 진행 중인 사구체 손상을 반영할 수 있음을 시사합니다[20]. 중요하게도, 가장 큰 규모의 인간 연구에서 제1형 당뇨병 환자의 혈액 단핵 세포에서 MRP8 유전자 발현이 신병증을 비롯한 당뇨병 합병증이 있는 대상체에서 유의하게 상승한다고 보고했습니다[29].
레닌-안지오텐신계(RAS)의 억제가 신장 결과의 중요한 결정 요인이기 때문에 우리는 RASblockade가 신장에 미치는 영향을 조사했습니다.신장MRP8 발현. 우리는 RAS 차단이 있거나 없는 DN 환자 사이에서 신장 MRP8 mRNA 발현에 유의한 차이가 없음을 발견했습니다(그림 S9). 아마도 RAS 차단으로 치료된 사례가 RAS 차단이 없는 경우보다 더 심각한 고혈압 및 단백뇨를 갖는 경향이 있기 때문일 것입니다.
비만인 사람과 생쥐에서 증가된 혈장 MRP8/14복합체는 다음 정도를 반영할 수 있습니다.비만지방 세포와 백혈구에서 유래합니다[8,9]. 우리의 ORG 사례는 근위 세뇨관에서 MRP8이 약간 염색되어 MRP8의 혈장 수준이 증가했음을 시사합니다. 대조적으로, tubulointerstitial MRP8 발현과 체질량 지수 사이에는 유의한 상관 관계가 없었습니다(그림 S6G). 따라서 로컬 MRP8 발현은신장보다는 신장 손상에 대한 표지자로 더 잘 작용할 수 있습니다.비만[8,9].
신장 기능 장애 개선을 위한 시스탄체
우리의 연구에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 연구된 각 그룹의 표본 수는 적었습니다. 동일하지 않은 대상이 mRNA 및 면역조직화학 분석에 등록되었습니다. 우리는 신장 생검을 받은 환자만을 분석하였기 때문에 여기에서 조사된 환자의 구성은 일반적인 제2형 당뇨병 환자 또는 일반적인 만성 당뇨병 환자의 구성을 반영하지 않을 수 있습니다.신장질병 주제. 나이가 우리 데이터에서 MRP8 신호와 관련된 독립적인 요인으로 유지되지는 않았지만(표 3), 노화는 만성 염증과 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다[30]. 나이의 영향을 완전히 무시할 수는 없습니다. 항체 흡수 시험에서 대부분의 MRP8 신호가 소실되었지만 일부 양성 신호는 남아 있었는데 이는 첫 번째 항체의 비특이적 결합으로 인한 것일 수 있습니다. 위에서 논의한 바와 같이, 신장 생검에 의한 신장 MRP8 발현의 조사는 특히 다음과 관련된 만성 신장 질환의 병태생리학 및 예후를 이해하는 데 도움이 됩니다.비만및 당뇨병, 그러나 외래 진료소에서 일상적이고 반복적으로 사용하기에는 단점이 있습니다.
요약하면, 본 연구는 MRP8의 발현이신장현재 병리학 적 상태를 반영하고 또한 환자의 신장 결과를 예측합니다.비만또는제2형 당뇨병. 대규모 비만 또는 당뇨병 환자의 요중 MRP8 수치를 연구하는 추가 조사가 필요할 수 있습니다.
지원 정보
그림 S1 (A) 과요오드산 Schiff, (B) 과요오드산 메테나민 은 또는 (C) Masson trichrome으로 염색된 DN 환자의 신장 생검 섹션을 보여주는 대표적인 사진. 이 환자에서 전체 사구체의 수와 세뇨관간질 섬유증의 상대 면적 중 전체 경화증이 있는 사구체 수(화살표)의 비율은 각각 33% 및 65%였습니다. (사소한 말다툼)
그림 S2 DN 환자의 MRP8 및 CD68 단백질에 대한 면역조직화학. 오른쪽 열의 사진은 1차 항체가 없는 음성 대조군 실험을 보여줍니다. (티프)
그림 S3 MRP8 염색에 대한 항체 흡수 테스트. PBS: 인산완충식염수, rhMRP8: 재조합 인간MRP8.(TIF)
그림 S4 MGA, MCNS, ORG 및 DN 그룹에서 MRP8 발현의 대표적인 사진.(TIF)
그림 S5 사구체 MRP{1}}양성 세포 수와 임상 매개변수 간의 상관관계. MRP8 신호의 로그 변환 값을 사용했습니다. 4개 그룹(A-D, G) 또는 MCNS 그룹을 제외한 3개 그룹(E, F)을 사용하여 상관관계를 분석했습니다. 열린 원: 작은 사구체 이상(MGA), 닫힌 원: 최소 변화 신증후군(MCNS), 열린 삼각형:비만-관련 사구체병증(ORG), 닫힌 삼각형: 당뇨병성 신병증(DN).(TIF)
그림 S6 세뇨관간질 MRP{1}}양성 영역과 임상 매개변수 간의 상관관계. MRP8 신호의 로그 변환 값을 사용했습니다. 이러한 상관관계는 4개 그룹(A-D, G) 전체 또는 MCNS 그룹(E, F)을 제외한 3개 그룹을 사용하여 분석되었습니다.(TIF)
그림 S7 사구체와 세뇨관간질 MRP8 발현 사이의 상관관계. MRP8 신호의 로그 변환 값을 사용했습니다.(TIF)
그림 S8 세뇨관 간질 MRP{1}}양성 영역과 세뇨관 간질 섬유증 간의 상관관계. MRP8 신호의 로그 변환 값을 사용했습니다.(TIF)
도 S9 레닌-안지오텐신 차단이 있거나 없는 DN 환자에서 MRP8의 신장 mRNA 발현.NS: 유의하지 않음. n=15(예), 6(아니요). 22명의 DN 사례 중 1명의 환자에서 약물에 대한 정보가 제공되지 않았습니다.(TIF)
파일 S1 지원 테이블.
표 S1, 2000년에서 2011년 사이에 교토 대학 병원 의학 및 임상 과학부에서 신장 생검을 받은 모든 사례의 병리학적 진단. 표 S2, TaqMan 실시간 RT-PCR에 대한 프라이머 및 프로브 서열. 표 S3, 1년 이내에 신장 질환 발생에 대한 로지스틱 회귀 분석. (DOC) 감사의 말 통계적 조언을 해주신 S. Tanaka, 기술 지원을 해주신 Y. Ogawa, N.Igarashi, C. Kimura, 비서 지원을 해주신 A. Yamamoto와 SOgino에게 감사드립니다. 저자 공헌 TK KM MK HY MI AN KNMM 실험을 구상하고 설계했습니다. 실험 수행: TK HI AI KK TM YK MI AN. 데이터 분석: TK KM MK HY AS SY KU KN MM. 기여한 시약/재료/분석 도구: TK KM. 논문 작성: TK KMMM.
cistanche의 효과: 신장 질환 치료
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인용: Kuwabara T, Mori K, Kasahara M, Yokoi H, Imamaki H, et al. (2014) 예측 의의신장다음 환자에서 골수 관련 단백질 8 발현비만- 또는 제2형 당뇨병 관련 신장 질환. 플로스원 9(2): e88942. doi:10.1371/journal.pone.0088942
편집자: Utpal Sen, University of Louisville, 미국
2013년 9월 11일에 접수됨; 2014년 1월 14일 수락됨; 2014년 2월 18일 게시
저작권: 2014 Kuwabara et al. 이것은 크리에이티브 커먼즈 저작자 표시 라이선스의 조건에 따라 배포되는 오픈 액세스 기사로, 원본 저자와 출처가 표시되는 경우 모든 매체에서 무제한 사용, 배포 및 복제를 허용합니다.
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