사전 공포 학습을 통해 새로운 공포 기억을 대뇌 피질 네트워크에 직접 빠르게 동화시킬 수 있습니다. 3부
Sep 25, 2023
실험적 설계
데이터 재현성은 다양한 반복실험을 통해 평가되었습니다(S1 표). Te2의 첫 번째 CNQX 비활성화 실험(그림 1A-1C)은 우리가 수행한 첫 번째 실험이고 우리 연구의 주요 가설을 테스트하는 데 사용되었기 때문에 더 많은 반복 횟수로 수행되었습니다. 동물은 체중 균형 방식으로 다양한 행동 그룹에 선험적으로 할당되었습니다. 동일한 무리의 수컷 동물을 각 실험 그룹에 무작위로 할당했습니다. 우리는 먼저 우리 연구의 주요 가설을 다루었습니다. 즉, 대뇌 피질의 비활성화는 실험적으로 순진한 쥐와 이전 공포 사건을 배운 동물의 새로운 공포 기억의 통합에 다르게 영향을 미칠 수 있습니다.
수컷 동물은 더 강한 생존 본능과 번식 욕구를 가지고 있기 때문에 매우 강한 기억력을 가지고 있습니다. 야생에서 살아남는 동물들은 환경에 더 잘 적응하고 생명을 보호하기 위해 수많은 지리적 정보, 먹이 종류, 포식자의 흔적, 무리 구성원의 위치를 기억해야 합니다.
예를 들어, 숫사자는 영토 전체의 상태, 회원 관계, 경쟁자의 위치 등을 기억하여 영토와 그들의 지위를 보호해야 합니다. 수컷 얼룩말은 생존과 번식을 위해 초원 위의 수원과 먹이의 위치를 기억해야 합니다. 한때 한 탄산음료 회사는 수컷 북극곰이 잠수부와 그의 독특한 냄새를 기억할 수 있어 다음에 그를 볼 때 그를 식별할 수 있다는 광고를 게재한 적이 있습니다.
따라서 수컷 동물은 자신의 영토를 보호하고 충분한 식량을 공급하며 자손을 번식시키는 측면에서 강한 기억을 가지고 있어야 합니다. 이는 또한 예를 들어 기억 장애 및 알츠하이머병과 같은 질병을 탐구하는 인간 연구에서 중요한 주제가 됩니다.
인간 세계에서도 수컷 동물의 기억에서 영감을 얻을 수 있습니다. 새로운 것에 대한 지속적인 노출, 지속적인 학습 및 사고는 우리의 기억력과 적응력을 향상시키고 생활 수준과 업무 효율성을 향상시킬 수 있습니다. 그러므로 우리는 수컷 동물에게서 배우고, 계속해서 지식과 경험을 축적하며, 강한 생존 본능과 번식 욕구를 갖고 더 나은 미래를 만들어 나가자. 기억력을 향상시켜야 함을 알 수 있습니다. Cistanche Deserticola는 많은 독특한 효과를 지닌 전통 중국 약재이기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 그 중 하나는 기억력을 향상시키는 것입니다. 다진 고기의 효능은 산, 다당류, 플라보노이드 등 포함된 다양한 활성 성분에서 비롯됩니다. 이러한 성분은 다양한 방식으로 뇌 건강을 증진할 수 있습니다.
이들 그룹 사이에 통계적 차이가 있는 경우, 결국 식염수 주입을 통해 추가 대조 그룹을 수행했습니다. 유사한 접근법이 광유전학적 실험에 적용되었으며, AAV 대조군은 순진한 쥐와 이전에 훈련된 쥐 사이의 통계적 차이가 검출된 후에만 수행되었습니다. 이러한 실험 일정을 통해 우리는 동물 실험에 관한 유럽 및 이탈리아 법률(3 Rs 원칙)의 주요 문제인 불필요한 통제 그룹과 불필요한 동물의 사용을 피할 수 있었습니다.
행동 절차
모든 실험은 하루 중 가벼운 단계(오전 8시부터 오후 4시) 동안 수행되었습니다. 동물은 실험 요구 사항에 따라 서로 다른 작은 투명 버킷 내에서 시설에서 실험실로 단독으로 운반되었습니다.
청각 훈련: 첫 번째 행동 세션. 청각적 공포 조건을 지닌 동물(CS1-CS2). 이 그룹에서는 쥐를 집에서 조심스럽게 꺼내어 수용실에서 방음실로 옮겼습니다. 일단 거기에, 동물을 충격 전달 장치에 연결된 스테인리스 스틸 막대 그리드(직경 1cm, 간격 1.5cm)가 장착된 직사각형 검정색 케이지(35 x 40cm)로 구성된 컨디셔닝 장치 내부에 배치했습니다.
쥐를 1분간 가만히 두었습니다. 이 시간 후, 15kHz 주파수(각각 15초 지속 시간, 80dB, 36초 시험 간격)의 순음으로 구성된 7개의 조건 자극(CS)이 투여되었습니다. 각 톤의 마지막 1초는 고통스러운 US(0.5mA, 1초)와 짝을 이루었습니다. 컨디셔닝 세션이 끝나면 쥐를 홈 케이지로 다시 데려왔습니다.
충격 전용 동물(shock-CS2). 이 그룹에서는 쥐를 동일한 컨디셔닝 장치 내부에 유사하게 배치했습니다. 그 직후, 각 쥐는 차례로 7-발 충격(1초, 0.5mA)을 받았습니다. 자극이 끝나면 동물을 다시 집으로 데려왔습니다. 컨디셔닝 케이지의 시간 영속성은 9초 미만이었습니다. 이전 연구에서는 이 절차가 고통스러운 자극과 감각 자극 사이의 연관 과정을 피할 수 있음을 보여주었습니다[29,30].
냄새 공포 조건을 갖춘 동물(odor-CS2). 이 그룹에서는 위의 실험 그룹에서 사용된 것과 동일한 직사각형의 검은색 우리 안에 쥐를 배치하고 충격 전달 장치에 연결했습니다. 쥐를 2분간 가만히 두었습니다. 이 시간 후, 바닐라 향으로 구성된 7개의 CS가 투여되었습니다(각각 10초의 지속 시간, 24초의 시험 간격). 각 냄새의 마지막 1초는 고통스러운 US(0.5mA, 1초)와 짝을 이루었습니다. 컨디셔닝 모듈은 오프셋 후 전달된 자극의 지속성을 피하기 위해 환기원 근처에 배치되었습니다. 케이지는 상부 그리드로 확보되었습니다. 냄새는 흐름 희석 후각계를 사용하여 제시되었습니다. 깨끗한 공기(1.5L/분)는 솔레노이드 밸브로 보내졌고, 작동 시 바닐라 냄새 10ml가 들어 있는 15ml 병에 공기가 전달되었습니다.
톤 전용 동물(Tone-CS2). 이 그룹의 쥐는 동일한 검정색 우리 안에 배치되었으며 US가 없는 경우 전달된 15-kHz 톤(7자극, 15초 지속, 36초 ITI)을 제공받았습니다.
사전 노출된 동물(Tone-CS1-CS2). 쥐를 컨디셔닝 케이지 안에 넣고 1분 후에 15-kHz 톤만 20번 제시했고, 24시간 후에 동일한 톤이 US와 짝을 이루어 CS1이 되었습니다.
백색소음 공포 조건화 동물(WN-CS2). 이 그룹에서는 쥐를 직사각형의 검정색 우리 안에 넣고 1분 동안 방해받지 않고 방치했습니다. 이 시간 이후에는 WN(각각 15초의 지속 시간, 75dB, 36초의 시험 간 간격)으로 구성된 7개의 CS가 투여되었습니다. 각 신호음의 마지막 1초는 고통스러운 미국(0.5mA, 1초)과 짝을 이루었습니다. 컨디셔닝 세션이 끝나면 쥐를 홈 케이지로 다시 데려왔습니다.
청각적 공포 학습: 두 번째 행동 훈련. 위 단락에 설명된 절차 2주 후, 동물은 또 다른 청각 공포 조건화 작업에 대한 훈련을 받았습니다. 이전 연구[10]에서와 같이 쥐를 표준 스키너 상자에 넣고 2분 동안 그대로 두었습니다. 이 시간 이후에는 3kHz 주파수(각각 8초의 지속 시간, 80dB, 22초의 시험 간 간격)의 순음으로 구성된 7개의 CS가 전달되었습니다. 각 톤의 마지막 1초는 고통스러운 US(0.5mA, 1초)와 짝을 이루었습니다. 컨디셔닝 세션이 끝나면 쥐를 홈 케이지로 다시 데려왔습니다.
기억력 유지에 대한 두려움. CS2(3kHz)에서 최근 획득한 청각적 공포 기억의 유지를 4일 후에 테스트했습니다. 광유전학 실험의 경우, CNQX 투여를 통해 대뇌 피질 비활성화를 수행한 시간 간격과 유사하게 CS2-US 학습 후 24시간 후에 레이저 전달을 통해 최근 기억 테스트를 수행했습니다(즉, 24시간 후 훈련). 쥐는 상황에 따른 단서에 대한 조건화된 공포 행동을 피하기 위해 조절에 사용된 것과 다른 장치에 익숙해졌고 다른 방에 배치되었습니다[10,62].
새로운 장치는 인클로저에서 악취가 나는 공기를 제거하고 60dB의 배경 소음을 제공하는 배기 팬이 장착된 소음 감쇠 상자 내에 검정색으로 칠해진 면이 있는 투명한 플라스틱 케이지로 구성되었습니다. 동물들은 습관화 세션 동안 하루 5분 동안 케이지를 탐색할 수 있었습니다. 공포 기억 유지 테스트 당일, 2분간의 자유 탐색 후 우리는 US가 뒤따르지 않는 3kHz의 4 CS2(8s—22 ITI)를 전달했습니다.
실험적 요구에 따라 필요한 경우, 두 번째 청각 공포 조건화 시험 2주 전에 획득한 원격 공포 기억 유지에 대해 쥐를 테스트했습니다. 이를 위해 3-kHz 톤에 대한 공포 기억 유지 테스트 후 7일 동안 동물을 새로운 환경(흑백 줄무늬 우리)에 배치한 다음 15-kHz 톤을 제시했습니다. 4개의 톤이 36초 간격으로 제시되었습니다.
상황별 훈련: 첫 번째 행동 세션. 상황에 따른 공포 조절 그룹(CtxA-CtxB). 이 그룹에서는 쥐를 우리에서 조심스럽게 꺼내어 양동이에 넣은 다음 사육실에서 방음실로 옮겼습니다. 일단 그곳에서, 충격 전달 장치에 연결된 스테인리스 스틸 막대 그리드가 장착된 앞서 언급한 직사각형 검정색 케이지로 구성된 컨디셔닝 장치 내부에 동물을 배치했습니다. 쥐를 1분간 가만히 두었습니다. 이 시간 이후에는 51초 간격으로 5 US(0.5 mA, 1초)가 투여되었습니다. 세션이 끝나면 동물을 집 우리로 다시 데려왔습니다.
충격 전용 그룹(shock-CtxB). 일단 컨디셔닝 장치 내부에 배치된 쥐는 즉시 5-발 충격(1초, 0.5mA)을 차례로 받았습니다. 컨디셔닝 케이지의 시간 영속성은 7초 미만이었습니다. 이전 연구에서는 이 절차가 고통스러운 자극과 감각 자극 사이의 연관 과정을 피할 수 있음을 보여주었습니다[29,30].
충격 전용 그룹(shock-CtxB). 일단 컨디셔닝 장치 내부에 배치된 쥐는 즉시 5-발 충격(1초, 0.5mA)을 차례로 받았습니다. 컨디셔닝 케이지의 시간 영속성은 7초 미만이었습니다. 이전 연구에서는 이 절차가 고통스러운 자극과 감각 자극 사이의 연관 과정을 피할 수 있음을 보여주었습니다[29,30].
새로운 상황에 따른 공포 조건화 및 최근의 공포 기억 유지. 위 단락에 설명된 절차 2주 후에 모든 그룹은 새로운 상황적 환경(다른 방에 배치된 스키너 박스 모듈)을 고통스러운 US(0.5mA, 1s)와 연관시키도록 훈련되었습니다. . 각 동물을 새로운 방에 넣고 2분 동안 그대로 두었습니다. 그런 다음 30초 간격으로 5개의 US에 노출되었습니다.
상황별 공포 기억의 유지는 공포 조건화 절차 후 4일 동안 쥐를 Skinner 상자 챔버에 3분 동안 다시 넣어 테스트했습니다. 광유전학 실험의 경우, CNQX 투여를 통해 대뇌 피질 비활성화를 수행한 시간 간격(즉, 훈련 후 24시간)과 유사하게 CtxB-US 학습 후 24시간 동안 레이저 전달을 통해 최근 기억 테스트를 수행했습니다. 실험적 요구에 따라 필요한 경우, 쥐는 새로운 연관이 있기 2주 전에 미국과 짝을 이루는 맥락에 동물을 배치하여 원격 공포 기억의 유지 여부를 테스트했습니다.
동물들은 서로 다른 상황별 절차에 따라 2개의 서로 다른 양동이에 담겨 컨디셔닝 챔버로 운반되었습니다.
동결 조치. 모든 실험 절차에서 공포 기억 유지에 대한 평가는 동결 반응으로 결정되었으며[10], 호흡 운동을 제외한 신체 이동성이 전혀 없는 것으로 분석되었습니다. 각 동물에 대해 냉동에 소비된 시간(초)은 동물 그룹을 알지 못하는 2명의 독립적인 관찰자가 오프라인으로 측정했습니다.
수술 절차
표적 부위에 선택된 물질을 투여하기 위해 쥐를 이소플루란으로 마취시켰습니다. 유도는 2L/min 의료용 공기에서 4%[vol/vol]로 수행되었으며 2%[vol/vol]의 연속 노출로 확장되었습니다. 쥐가 정위 장치에 장착되었을 때.
두개골을 절개하고 28-게이지 주입 바늘이 관통할 수 있도록 작은 버 구멍을 뚫었습니다. 주입 펌프에 장착된 10-ul 해밀턴 주사기를 사용하여 물질을 전달했습니다. 주입 후 바늘을 추가로 3분 동안 제자리에 두었습니다. 그런 다음 스테인레스 스틸 상처 클립으로 절개 부위를 닫고 진통제/항염증성 케토프로펜(2mg/kg 체중)을 동물에게 피하 주사하고 마취에서 회복될 때까지 동물을 따뜻하게 유지하면서 관찰했습니다.
이전 연구[10,32-34]와 마찬가지로 동물의 캐뉼러 삽입은 불필요했으며 활성 화합물은 정위적으로 직접 투여되었습니다. 이 절차는 영구 삽입 절차에 내재된 외과적 외상을 피하고 단일 바늘 관통으로 외상을 제한하기 때문에 유리합니다[10,32-34]. 실제로 전신마취는 기억 강화에 큰 영향을 미치지 않습니다 [10,32-34]. 학습 실험과 관련된 화합물 투여 시기가 정확하여 쥐가 훈련 후 약 1시간과 약 1일에 선택된 화합물을 투여받을 수 있도록 하기 위해 계획된 주입 시기 5분 전(예: 55분)에 이소플루란 마취를 유도했습니다. 쥐의 경우 훈련 후 60분에 투여하였고 동물의 경우 훈련 후 24시간에 주사를 23시간 및 55분에 투여했습니다. 각 쥐를 조절한 다음 별도로 수술했습니다. 서로 다른 행동 그룹에 속하는 동물은 인터리브 방식으로 조작되었습니다.
AMPA/카이네이트 글루타메이트 수용체 CNQX({{0}}시아노-7-니트로퀴녹살린-2,3-디온)의 선택적 억제제(Tocris, 10 ng /ul) [20,21]을 멸균 식염수(NaCl, 0.9%)에 용해시키고 HCl로 pH 7.4로 조정했습니다. 단백질 합성 억제제 아니소마이신(Merck, 125ug/ul)을 등몰량의 HCl에 용해시키고 멸균 식염수로 희석한 후 NaOH를 사용하여 pH 7.4로 조정했습니다. 멸균 식염수(0.9% NaCl)를 비히클 대조군으로 사용했습니다. 이 물질은 Paxinos 및 Watson atlas[26]에서 가져온 다음 정위 좌표에서 부위당 0.1ul/min의 속도와 부위당 0.5ul의 부피로 양측으로 주입되었으며, Te2 피질 필드는 Zilles atlas[25]를 참조합니다.
2차 청각 피질(Te2): 1) AP: -5,8 L: ±7,2 DV: -6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: -6.
전대상피질(ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: -2,2.
주입량(부위당 0.5ul)은 성인 쥐의 Te2[10,34] 및 ACC[55,63]에 활성 화합물을 주입한 이전 연구를 기반으로 선택되었습니다.
등쪽 해마를 비활성화하기 위해 활성 화합물을 다음 정위 좌표에서 부위당 0.6ul의 부피로 주입했습니다.
등쪽 해마: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: -4,2 L: ±2,6 DV: -3.
NMDA(Tocris, 18 ug/ul, 멸균 식염수 용액에 용해, 0, 부위당 4 ul)를 0.1 ul/의 비율로 투여하여 등쪽 해마의 비가역적 병변을 유발했습니다. 앞서 언급한 좌표의 지점에서 최소입니다. 식염수 주입 대조군과 가짜 수술 동물에 대해 동일한 좌표가 사용되었습니다.
Red Retrobeads(Lumaflur, 식염수에 1:2 희석, 0.6 ul)를 다음 좌표에 따라 BLA에 주입했습니다: AP: -2.8; L: ±5.4; DV: -8.3.
실험 종료 시 CNQX, 아니소마이신, 식염수 주사의 경우 바늘 자국이 남거나 NMDA 주사의 경우 병변의 확장이 조직학적으로 확인되었다. 쥐를 깊게 마취시키고 4% 포름알데히드를 심장 내로 관류시켰습니다. 그들의 뇌는 저온 유지 장치에서 30μm로 절단되었습니다. Nissl로 염색된 연속 절편은 기존 절차를 사용하여 준비되었으며 절편은 2.5배 확대된 현미경으로 조직학적으로 확인되었습니다.
광유전학 실험
바이러스 주입. 아데노 관련 바이러스 AAV5:CaMKII::eNpHR3.0-cherry 및 제어 벡터 AAV5:CaMKII -cherry는 University of North Carolina Vector Core(미국 노스캐롤라이나주 채플힐)에서 입수했습니다. Viraltiterwas5:8 Viral titer는 두 바이러스 모두에 대해 5.8 × 10^12 vg/ml였습니다. CaMKII 프로모터를 사용하면 피라미드 뉴런에 유리한 이식유전자 발현이 가능해집니다. 바이러스는 -80˚C 냉동고에 보관되었습니다. Te2 또는 ACC를 표적으로 하는 바이러스 주입은 각 구멍에 대해 0.5ul의 부피로 위의 정위 좌표에서 수행되었습니다. 바이러스를 0.1 ul/min의 속도로 주입하고 바늘을 추가로 5분 동안 그대로 두었습니다. 광유전학 실험 4주 전에 바이러스 주사를 수행했습니다.
조명.
광섬유(Plexon, 200/230 μm 코어, 길이 10 mm)를 BLA(AP=-2.8, L=± 5.4, V=-8.2 mm에 양측으로 이식했습니다. 브레그마에서). BLA에 대한 Te2 투영 또는 BLA에 대한 ACC 투영의 광유전학적 억제는 레이저 다이오드(Laserglow Technologies)에 연결된 PlexBright Optogenetic Stimulation System을 사용하여 얻었습니다. 황색광(589 nm)이 생성되어 광섬유를 통과합니다. 투영 부위의 조명에 대해 광섬유 끝에서 추정된 전력 밀도는 10~15mW였습니다. 공포 기억 유지 동안 빛 방출은 톤이 시작되기 4초 전에 시작되었고 톤 전체에 걸쳐 지속되었으며 톤 오프셋 후 4초에 중지되었습니다. 상황별 공포 조절 그룹에 속한 동물은 전체 상황 탐색(3분) 동안 가벼운 자극을 받았습니다. 쥐는 기억력 유지 시험 전 2일 동안 패치 코드에 익숙해졌습니다.
면역조직화학. 광유전학 실험이 완료되면 쥐를 깊게 마취시키고 4% PAF를 심장 내로 관류하여 바이러스의 확산을 조사했습니다. 뇌를 해부하고 4˚C에서 밤새 보관한 후 최종적으로 30% 수크로스에 옮겼습니다. 관상 단면(30 μm)을 저온 유지 장치에서 절단하고 PBS에 수집했습니다. 자유 부동 섹션을 차단 용액에서 실온에서 1시간 동안 배양했습니다. 그런 다음 이를 차단 용액의 1차 단일클론 마우스 항체 항 mCherry(1:500 희석, Abcam)에서 실온에서 밤새 배양했습니다. 이어서, 절편을 PBS로 세척하고 PBS에 희석된 2차 형광 AlexaFluor-568 항-마우스 항체(1:600, Invitrogen)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양했습니다. 절편을 PBS로 세척하고 DAPI(벡터)가 포함된 장착 매체로 장착하고 커버슬립을 씌웠습니다.
NMDA 주사를 맞은 쥐의 뇌도 유사하게 수집되었습니다. 여러 번 헹군 후 자유 부유 절편을 차단 용액 내 1차 단일클론 마우스 항-Neun(1:1,000 희석, Merck) 항체와 함께 실온에서 밤새 배양했습니다. 이어서, 절편을 PBS로 세척하고 비오티닐화된 말 항-마우스 항체(1:2{13}}0 희석, 벡터)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 아비딘-비오틴 복합체(ABC 복합체 1:100, 벡터, 2시간 및 절반 배양)를 디아미노벤지딘(0.03%, Merck)과 결합하여 Neun을 염색했습니다. 그런 다음 절편을 PBS로 헹구고 젤라틴 코팅 슬라이드로 옮기고 탈수시킨 다음 커버슬립으로 덮었습니다.
레트로 비드가 주입된 쥐의 Te2 섹션은 실온에서 하룻밤 동안 차단 용액에서 1차 다클론 토끼 항-Fos 항체(1:2,000, Cell Signaling)와 함께 배양되었습니다. 이어서, 슬라이스를 PBS로 세척하고 항토끼 Alexa 488(1:1,000, Invitrogen, PBS 중)과 함께 RT에서 1시간 동안 배양했습니다. 마지막으로, 면역표지된 섹션을 PBS로 세척하고, 젤라틴 코팅 슬라이드에 장착하고, DAPI가 보충된 장착 매체로 덮었습니다.
현미경 사용
mCherry 라벨링은 Zeiss Airyscan 공초점 현미경을 사용하여 검사했습니다. 두 개의 레이저가 사용되었습니다(405 및 561nm). 각각은 DAPI(세포핵에 대한 Nissl 염색) 및 Alexa 568(mCherry)의 피크 방출 스펙트럼에 해당합니다. ) 각각. 주사 부위의 바이러스 확산을 분석하기 위해 Te2와 ACC의 현미경 사진을 모자이크 이미지로 획득했습니다(각 단일은 10X 대물렌즈를 사용하여 획득했습니다). BLA에 대한 Axon 터미널은 1μm 간격(159μm 정사각형, 줌 비율, 1.0)으로 간격을 둔 10개 섹션의 z-스택으로 40x 대물렌즈를 사용하여 분석되었습니다.
cFos 면역 표지를 실시한 레트로비드 주입 동물의 경우 피크 방출 스펙트럼에 해당하는 3개의 다른 레이저를 사용하여 40× 배율(159 μm 평방, 확대/축소 비율, 1.0)에서 이미지를 획득했습니다. DAPI(세포핵에 대한 Nissl 염색), AlexaFluor 488(cFos) 및 Texas Red(Retrobeads)의 경우 각각. 0.7 μm의 단면은 10-μm z-스택을 따라 획득되었습니다. cFos, 비드 표지 및 이중 양성(cFos+ 비드 표지)을 발현하는 핵의 수는 브레그마로부터 6.7~7.3mm의 전후 좌표에서 Te2 영역의 각 동물에 대해 정량화되었습니다[10]. 그런 다음 데이터를 평균하여 각 동물의 평균을 산출하고 결과를 통계적으로 비교했습니다. Neun의 DAB 염색이 있는 절편의 이미지는 컬러 CCD 카메라를 통해 현미경에 연결된 Neurolucida 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다[10].
데이터 분석 및 제외 기준
각 그룹에 대한 n은 이전 연구[10,16,17], 해당 분야에서 이전에 발표된 연구(ACC[6,22,55] 및 Te2[10,59]에 대한 참고 자료 참조)에 따라 선험적으로 확립되었습니다. 다음 표(표 1)에 따라 G-전력 추정을 통해:
각 분석에 대해 우리는 각 그룹에 대해 최종 평균 동물 수를 8~10마리로 추정했습니다. 그룹은 동일한 실험 세션(S1 표)에서 내부 통제를 사용하여 실행되었습니다. 수술 및 행동 절차의 다양성을 고려하여 우리는 어떤 경우에는 실험 기준을 충족하고 포함된 더 많은 수의 실험 대상(최대 15% 이상)을 선험적으로 포함하여 임의의 제외를 피했습니다. 해마 연구의 경우, 서로 다른 시간 간격으로 NMDA 및 CNQX 주사의 효과를 평가하기 위해 우리는 서로 다른 그룹 간에 비히클과 가짜 수술 쥐 사이의 총 대조 동물 수의 균형을 맞추었습니다.
행동 분석, 조직학적 검사 및 세포 수는 맹목적으로 수행되었습니다. NMDA-돌이킬 수 없는 병변의 경우 바늘 자국 또는 병변의 국소화가 부적절한 동물은 데이터 분석에서 제외되었습니다(S1 표). 약리학 연구에서 잘못된 바늘 배치로 인해 총 465마리의 동물 중 57마리의 동물을 제외했습니다(Te2의 경우 22/255, ACC의 경우 31/179, 해마의 경우 4/31). 21마리의 동물에 대한 추적 연구에서 레트로비드 주입이 BLA를 놓친 3명의 피험자를 제거했습니다. Te2 광유전학 연구에서는 총 30마리 이상의 동물을 대상으로 광섬유의 배치가 목표 영역, 즉 쥐 1마리보다 높지 않았기 때문에 쥐 1마리를 제외했습니다. 결국 Te2와 2마리의 쥐에서는 바이러스가 없었는데, 이는 바이러스 확산이 주사 부위 Te2 면적의 각각 4.7%와 5.3% 미만이었기 때문이다. 통계 분석에 포함된 쥐의 최소 바이러스 확산은 전방 정위 좌표에서 39.6%, 후방 정위 좌표에서 50.2%였습니다.
마찬가지로, ACC 광유전학 실험에서는 총 32마리의 동물 중 광섬유의 배치가 목표 영역 위에 있지 않아 2마리의 쥐가 제거되었습니다. 2마리의 쥐는 ACC에 바이러스가 없었기 때문에 제외되었고, 1마리의 동물은 바이러스가 인접한 2차 운동 피질에 있었기 때문에 제외되었으며, 1마리의 쥐는 바이러스 확산이 주사 부위에서 ACC 영역의 2.3% 미만이었기 때문에 제외되었습니다. 나머지 쥐의 경우 최소 바이러스 확산은 전방 정위 좌표에서 33.3%, 후방 좌표에서 42.2%였습니다.
NMDA 병변 연구에서 병변은 대부분 등쪽 해마의 CA1 영역을 표적으로 삼았습니다. 등쪽 해마 전체 영역에 대한 해마 병변의 최소(빨간색) 및 최대 확장(분홍색)은 각각 전방 정위 좌표에서 23.2% 및 53.5%, 후방 좌표에서 28.3% 및 62.3%였습니다. 총 73마리의 동물 중, 4마리의 쥐는 병변이 없어 제거되었고, 추가로 3마리의 동물은 병변의 확장이 5.0%(즉, 4.8%, 4.3%, 3.1) 미만이어서 폐기되었습니다. %) 2 좌표의 해마 영역에 관한 것입니다.
영역 윤곽 분석은 ZEN 3.0 소프트웨어의 영역 윤곽 도구를 사용하여 육안 검사 및 수동 정량화를 통해 수행되었습니다. 그런 다음 면적 값을 해당 지역의 전체 면적에 대해 정규화했습니다. Te2, ACC 및 해마의 정위 좌표는 Paxinos 아틀라스[26]를 기반으로 했으며 Te2의 경우 피질 필드는 Zilles 아틀라스[25]를 참조했습니다.
통계 분석
모든 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 모든 데이터는 Levene의 등분산 검정을 통과했습니다. 따라서 모든 실험에서는 파라메트릭 통계가 사용되었습니다. 두 그룹의 데이터는 2-꼬리 짝이 없는 Student t-test를 사용하여 비교되었습니다. 다중 그룹 비교는 Tukey 사후 테스트와 1-방식 ANOVA 테스트를 사용하여 평가되었습니다. 그룹 간 및 그룹 내 차이를 해결하기 위해 그룹(CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2)을 사이로 사용하여 3 × 2 혼합 설계 ANOVA 모델을 계산했습니다. 피험자 변수 및 조건(최근 조건화 + 주입 전후)을 피험자 내 변수로 사용합니다. 그룹 × 조건 상호 작용이 중요한 경우 간단한 주효과 분석을 수행하고 Bonferroni 보정을 사용하여 각 p-값을 조정했습니다. 각 혼합 ANOVA 모델에 대해 Mauchly의 구형성 테스트를 통해 구형성 가정을 평가했습니다.
통계 매개변수(즉, 각 그룹에 대한 정확한 n 값, SEM, 통계 테스트, 효과 크기 및 정확한 p-값)는 범례에 보고됩니다. 동일한 표본 크기의 경우, 짝이 없는 t-검정의 효과 크기는 SD의 유사성에 따라 Cohen의 d 또는 Glass의 d를 계산하고, 다른 표본 크기의 경우 Hedges'g를 계산하여 결정되었습니다. 세포 수와 동결 사이의 상관관계는 피어슨 계수를 사용하여 계산되었습니다. 데이터가 통계적 접근 방식의 가정을 충족하는지 확인하기 위해 P < 0.05 수준에서 귀무 가설을 기각했습니다. 모든 통계 분석은 SPSS Statistics 22(IBM)를 사용하여 수행되었습니다.
지원 정보
S1 그림. CNQX가 주입된 Te2(A)와 ACC 피질(B)의 바늘 트랙의 확대, 예로 선택됨. (C) 시술 후 2주 동안 동일한 맥락으로 표현되었을 때 충격 전용 동물은 낮은 공포 반응을 보였으며, 이는 충격이 전달된 맥락에서 해당 시술이 조건부 동결을 유도하지 않았음을 입증합니다. (D) CS로 사용된 2개 톤(CS1, 3kHz 및 CS2, 15kHz)을 균형 조정하여 그림 1과 유사한 결과를 얻었습니다(Student t test, t(14)=3.44, p {{ 13}}.0040, Glass의 d=4.14). (E) 컨디셔닝 컨텍스트와 관련하여 다른 환경에서 테스트한 경우에도 컨디셔닝 후 2주 동안 냄새에 얼어붙은 냄새-CS 컨디셔닝 쥐에서 두려움이 이 신호 전달과 구체적으로 연관되어 있음을 보여줍니다. 스케일 바, 300μm. ��P < 0.01. 모든 데이터는 평균 및 SEM입니다. S1 Fig에 대한 요약 데이터는 S1 Supporting Figure Data라는 파일의 지원 정보에서 찾을 수 있습니다. (TIF)
S2 그림 CNQX 주사는 톤 단독 사전 노출 또는 CS1로 백색 잡음 톤을 사용하여 공포 일반화가 낮아진 쥐의 최근 청각 공포 기억 유지를 손상시켰습니다. 3 × 2 혼합 설계 ANOVA(그룹의 주 효과: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, θ2=0. 236, 조건의 주 효과: F(1,42)=0.161, p=0.691, eta2=0.004, 그룹 × 조건 상호 작용 F(2,42)=3.942, p=0.027, eta2=0.158)은 미국과의 연관성 이전에 3kHz 톤으로 동결되는 것이 더 낮음을 보여줍니다. 15kHz-US 페어링 전에 15kHz 톤 사전 노출을 받은 동물(n=10, p=0.001) 또는 백색 잡음에 조건화된 쥐(n=13 , p=0.008)을 CS1-CS2 동물(n=22)과 비교하여 다양한 공포 일반화 반응을 보였습니다. 그러나 Te2 피질에 CS-US 학습 및 cnqx 주입 후 최근 공포 기억은 모든 그룹에서 손상되었습니다(p > 0.05). 그룹 내 단순 주효과(CS-US 학습 전후, cnqx 주입 전후): CS1-CS2, p=0.025; 톤-CS1-CS2, p=0.189; WN-CS2, p=0.347) �P < 0.05, ��P < 0.01. 모든 데이터는 평균 및 SEM입니다. S2 Fig에 대한 요약 데이터는 S1 Supporting Figure Data라는 파일의 지원 정보에서 찾을 수 있습니다. (TIF)
S3 그림 (A) BLA를 표적으로 하는 레트로비드 주입의 무작위 예. (B 및 C) Te2(B) 및 ACC 피질(C)에 AAV 벡터가 주입된 동물의 BLA 위에 광섬유 배치의 예. 스케일 바, 500μm.
감사의 말
지속적인 지원과 조언을 해주신 E. Manassero 박사에게 감사드립니다.
저자 기여
개념화: 줄리아 콘치나, 안나마리아 레나, 베네데토 사케티.
데이터 큐레이션: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.
공식 분석: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.
자금 조달: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.
조사: 줄리아 콘치나, 안나마리아 레나, 루이셀라 밀라노.
방법론: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.
감독: 베네데토 사케티.
검증: Benedetto Sacchetti.
집필 – 원본 초안: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.
집필 – 검토 및 편집: Annamaria Renna, Luisella Milano.
참고자료
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