Hsa-microRNA-4535-매개 TGF/Smad 신호를 통한 H2O2/UVB 유도 진피 섬유아세포 콜라겐 분해에 대한 Cistanche Tubulosa의 보호 효과
May 10, 2023
추상적인
이 연구는 H2O2/UVB로 유발된 손상에 대한 cistanche의 보호 효과의 기본 메커니즘을 광 손상의 생체외 및 생체 내 모델을 사용하여 조사하는 것을 목표로 했습니다. 또한, 우리는 이 과정에서 miRNA 조절의 관련성을 확인했습니다. H2O2/UVB 처리된 HS68 인간 진피 섬유아세포 및 UVB 유도된 C57BL/6J 누드 마우스는 시험관내 및 생체내 광손상 모델로 사용되었습니다. 결과는시탕슈 트리트먼트H2O2/UVB에 의해 유발된 세포 생존력 감소, TGF/Smad 신호 손상 및 피부 노화 완화. microRNA 어레이 분석 및 데이터베이스 검색 결과에 따라 has-miR-4535이 Smad4를 표적으로 하는 잠재적 후보 miRNA로 확인되었습니다. 체외,시탕슈 트리트먼트Smad2/3/4 복합체를 활성화하고 H2O2/UVB에 노출된 세포에서 hsa-miR-4535 발현을 억제했습니다. 생체 내에서, C57BL/6J 누드 마우스의 등쪽 피부에 저용량(12mg/kg) 및 고용량(24mg/kg)의 시스탄슈를 국소 적용하면 TGF/Smad 콜라겐 합성 신호 전달을 촉진하여 UVB 유발 피부 광손상을 상당히 완화시켰습니다. 감소표피 과형성, 주름 형성,피부노화, 게다가hsa-miR-4535 발현 억제. 종합하면, 우리의 연구 결과는 hsa-miR-4535과 TGF/Smad 콜라겐 합성 신호 사이의 연관성을 나타냅니다.그리고 이러한 요인들이광 보호 메커니즘담배피부 섬유아세포에서H에 대하여2O2/UVB로 인한 노화. 증거는담배~와 함께노화 방지 속성될 수 있다스킨 케어 제품의 보충제로 간주됩니다.
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소개
인간 피부 노화의 임상 징후에는 주름 증가, 이완 및 불규칙한 색소 침착이 포함됩니다[1]. 피부 노화의 과정은 복잡하며 내인성 노화와 외인성 노화의 두 가지 유형으로 나눌 수 있습니다. 내적노화는 시간의 경과와 유전적 요인에 의한 것이며, 외적노화는 광노화라고도 하며 주로 자외선에 노출되어 발생한다[2, 3]. 이전 연구에서는 내인성 및 외인성 노화 과정에서 풍부한 활성산소종(ROS)이 생성되는 것으로 나타났습니다. ROS의 축적은 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 신호 전달을 유도하고 다운스트림 전사 인자인 활성제 단백질-1(AP-1)을 활성화할 수 있습니다. 활성화된 AP-1는 핵으로 이동하여 MMP(matrix metalloproteinases)의 프로모터 영역에 결합할 수 있습니다[4]. MMP는 아연에 의존하는 큰 엔도펩티다제 그룹으로, 피부 진피 세포외 기질(ECM)의 분해에 기여합니다. 특히 콜라게나제인 MMP-1는 콜라겐 1형과 3형의 절단에 관여한다[5]. ECM의 주요 구성 요소인 콜라겐 I형과 III형은 피부 진피에 지지력과 힘을 부여할 수 있으며 이들의 혼란은 노화된 피부의 특징적인 주름과 늘어짐을 유발합니다[6]. Transforming growth factor-beta(TGF )는 인간 피부 진피에서 콜라겐 합성을 긍정적으로 조절할 수 있는 TGF 1, TGF 2 및 TGF 3의 세 가지 다른 이소형을 가진 유비쿼터스 및 강력한 사이토카인입니다[2]. TGF는 TGF 수용체 유형 I(TRI) 및 II(TRII)를 포함하는 특정 세포 표면 세린/트레오닌 키나아제 수용체 복합체와 상호작용하여 신호를 개시합니다. TRI 인산화는 R-Smads(Smad2 및 Smad3)의 인산화를 유발합니다. 활성화된 R-Smads는 Smad4와 상호작용하여 핵 전위를 조절하고 Smad 결합 요소(SBE)의 프로모터에 결합함으로써 콜라겐 유형 I 및 III을 전사적으로 활성화합니다[7, 8]. 내인성 또는 광노화에 의해 유도된 증가된 ROS 생성이 TGF/Smad 신호 전달 경로 손상에 기여하며, 이는 결과적으로 인간 피부 진피 섬유아세포에서 콜라겐 합성 감소를 초래한다는 증거가 늘어나고 있습니다[9, 10].
플라보노이드 계열의 천연 구성원인 cistanche(3,5,7-trihydroxyflavone)는 Alpinia officinarum과 프로폴리스에 풍부합니다. cistanche는 허혈성 뇌졸중, 당뇨병 및 다양한 암 유형을 치료할 수 있는 잠재적인 후보입니다[11-13]. 또한, cistanche는 라디칼 소거 및 항염증 활성을 가지고 있습니다[14, 15]. 우리는 이전에 Cistanche가 H2O2- 유도 염증을 감소시키고 HS68 세포에서 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체(IGFI-R)/ERK1/2 신호 경로를 통해 콜라겐 형성을 촉진한다는 것을 보여주었습니다[16, 17]. 또한 한 연구에 따르면 cistanche는 Alpinia officinarum의 화합물로 확인되었으며 진피 섬유아세포에서 콜라게나제 억제 효과를 나타냅니다[18]. 그러나 cistanche가 피부 피부 노화를 조절하는 방법과 관련된 더 자세한 분자 메커니즘은 알려져 있지 않습니다.
MicroRNA(miRNA)는 평균 길이가 22개 뉴클레오티드인 작은 단일 가닥 비코딩 RNA 분자 그룹입니다. 성숙한 miRNA는 DNA 서열에서 전사됩니다. 대부분의 경우, 성숙한 miRNA는 표적 mRNA의 3' 비번역 영역(UTR)에 결합하여 mRNA 번역을 침묵시킵니다[19]. 인간 피부에서 miRNA는 세포 대사, 암, 노화 및 콜라겐 형성의 조절에 중요한 역할을 합니다[20-23]. 예를 들어, miR-377은 DNA 메틸트랜스퍼라제 1(DNMT1) 발현을 억제하여 진피 섬유아세포 노화를 유도할 수 있으며, 이는 이후 p53 프로모터 및 진피 섬유아세포 노화에서 더 적은 메틸화로 이어집니다[22]. 인간 피부의 UVB에 의한 손상에서 miRNA 프로파일
유두 세포(nHDPs)는 이전에 조사되었습니다[24]. 그러나, 특히 천연 화합물의 관여에서 miRNA 조절을 통한 UVB 유도 진피 섬유아세포 노화는 거의 알려져 있지 않습니다. 이 연구는 H2O2/UVB로 유발된 피부 손상에 대한 시스탕의 보호 효과와 이 과정에서 마이크로 RNA 매개 콜라겐 분해의 역할을 조사하는 것을 목표로 했습니다. 우리는 또한 콜라겐 합성 조절에 관여하는 마이크로 RNA를 확인하는 것을 목표로 했습니다.
결과
cistanche는 HS68 인간 진피 섬유아세포에서 UVB/H2O2- 유도 세포독성을 억제합니다.
체외에서 시스탕의 세포독성(그림 1A)을 조사하기 위해 HS68 세포를 다양한 용량의 시스탕(0, 10, 20, 30, 40, 50 μM)으로 처리했습니다. 24시간 동안. MTT 분석 결과는 cistanche가 HS68 세포에 세포독성이 없음을 보여주었습니다(그림 1B). 다음으로, 우리는 24시간 동안 H2O2(0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) 및 UVB(0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²)의 다른 용량에 HS68 세포를 노출시켰습니다. H2O2 및 UVB 처리는 용량 의존적 방식으로 세포 생존력을 감소시켰습니다(그림 1C, 1D). H2O2 및 UVB 노출 후 물통의 세포 보호 특성을 평가하기 위해 H2O2-(200 μM) 및 UVB 유도(40 mJ/cm²) 후 다른 농도의 물통(10, 20, 30 μM)으로 HS68 세포를 처리했습니다. ) 손상. H2O2 또는 UVB 단독 처리
HS68 세포에서의 효과.
세포 생존율의 감소가 세포 사멸에 의한 것인지 성장 억제에 의한 것인지를 결정하기 위해 다양한 용량의 H2O2(50, 100, 200, 300, 400 μM)에 노출된 HS68 세포에서 웨스턴 블롯팅을 통해 여러 세포자살 및 생존 마커의 발현을 확인했습니다. 24시간 동안. 우리는 p-Akt와 같은 생존 마커의 발현이 상당히 감소하고
그림 1. cistanche는 HS68 인간 진피 섬유아세포에서 UVB/H2O2- 유도 세포독성을 억제합니다. (A) cistanche의 화학 구조. (B) 상이한 농도의 시스탄체(10, 20, 30, 40, 50 μM로 처리된 HS68 세포의 세포 생존율 ) 24시간 동안. (C 및 D) 다양한 용량의 H2O2(100, 150, 200, 250, 300 μM)에 노출되거나 24시간 동안 UVB(25, 30, 40, 50, 60 J/cm2)로 조사된 HS68 세포의 세포 생존력. (E 및 F) 1시간 동안 H2O2(200 μM)에 노출되거나 UVB(40 J/cm2)로 조사된 후 23시간 동안 시스탄체(10, 20, 30 μM)로 처리된 HS68 세포의 세포 생존율. cistanche의 세포 보호 효과는 MTT 분석에 의해 결정되었습니다. 대조군 세포에는 100% 생존력이 지정되었습니다. 값은 평균 ± SE로 표시됩니다. 결과의 정량화가 표시됩니다(n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 대 처리되지 않은 대조군 세포; ##P < 0.01, ###P < 0.001 대 H2O2 또는 UVB 처리된 세포.
TGF/Smad 신호는 인간 피부 진피 섬유아세포에서 콜라겐 형성에 도움이 됩니다[25-27]. 따라서, 우리는 H2O2에 노출된 HS68 세포에서 TGF/Smad 경로를 통한 콜라겐 합성에서 시스탕의 역할을 조사했습니다. 웨스턴 블롯 결과는 cistanche가 H2O2-에 노출된 HS68 세포에서 콜라겐 합성뿐만 아니라 TGF /Smad 신호를 상당히 향상시켰음을 나타냅니다(그림 4A). 또한, 콜라겐 I형과 III형의 해체는 노화된 피부 섬유아세포의 전형적인 특징 중 하나이다[28]. MMP 계열이 콜라겐 이화작용에 연루되어 있기 때문에 [29], 우리는 다음으로 MMP-1 활성화에 대한 cistanche의 영향을 확인했습니다. 우리는 cistanche가 H2O2- 강화된 MMP-1 수준을 억제하여 HS68 세포에서 콜라겐 분해를 방지한다는 것을 발견했습니다(그림 4A).
또한, 우리는 H2O2 단독으로 처리된 HS68 세포 또는 면역블롯팅 및 면역형광 염색을 사용하여 시스탕과 함께 처리된 HS68 세포를 비교함으로써 이러한 보호 작용의 기초가 되는 세포하 분자 메커니즘을 확인했습니다. cistanche 처리는 HS68 세포에서 H2O2에 노출되어 파괴된 p-smad2/3 및 Smad4의 핵 축적을 강화했습니다.
(그림 4B, 4C). 이러한 발견은 Cistanche가 HS68 세포에서 TGF /Smad 경로를 활성화하여 H2O2-유도 콜라겐 단편화를 개선할 수 있음을 나타냅니다.
그림 4. cistanche는 HS68 세포에서 H2O2- 유도 TGF /Smad 콜라겐 합성 경로 손상을 약화시킵니다. (A) HS68 세포를 1시간 동안 H2O2(200 μM)에 노출시킨 다음 23시간 동안 시스탄체(30 μM)로 처리했습니다. 콜라겐 합성 관련 경로 성분(TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1) 및 콜라겐 분해 관련 단백질(MMP-1)의 단백질 발현을 웨스턴 블롯으로 검출하였다. (B) 핵 및 세포질 분획에서 p-smad2/3, Smad4의 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 검출하였다. GAPDH는 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. 값은 평균 ± SE로 표시됩니다. 결과의 정량화가 표시됩니다(n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 대 처리되지 않은 대조군 세포; #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001 vs. H2O2- 처리된 세포. (C) 항-p-Smad2/3, Smad4 항체 및 FITC/PE-접합된 2차 항체를 사용하여 p-Smad2/3(녹색), Smad4(적색) 발현을 검출하였다. DAPI는 핵 위치(파란색)를 나타냅니다. 형광 현미경(200×)을 사용하여 이미지를 캡처했습니다.
hsa-miR-4535이 HS68 세포에서 Smad4의 발현 및 다운스트림 신호 전달에 미치는 영향을 확인하기 위해 hsa-miR-4535 유사체 또는 억제제로 HS68 세포를 형질 감염시키고 Smad4를 측정했습니다. 및 그것의 하류 콜라겐 발현. 결과는 hsa-miR-4535 억제제에 의한 hsa-miR-4535의 억제가 H2O2- 처리된 HS68 세포에서 Smad4 mRNA 및 단백질 발현의 하향 조절을 상당히 역전시킨다는 것을 입증했습니다(그림 7A-7C). . 또한, hsa-miR-4535의 억제는 H2O2-가 H2O2- 처리된 HS68 세포에서 COL1A1 및 COL3A1 손상을 부분적으로 회복시켰습니다(그림 7C).
반대로, hsa-miR-4535 모방 형질감염의 결과로 강화된 hsa-miR-4535 발현은 H2O2에 노출된 HS68 세포에서 Smad4의 cistanche 매개 상향 조절을 차단했습니다(그림 7D-7F). miR-4535의 과발현은 cistanche 유발 COL1A1 및 COL3A1 수준을 부분적으로 감소시켰습니다(그림 7F). hsa-miR-4535의 과발현(그림 8A–8C) 또는 siRNA에 의한 Smad4의 억제(그림 8D, 8E)는 H2O2 노출 후 시스탕케 처리 하에서 콜라겐 합성을 감소시켰습니다. 놀랍게도 우리는 둘 다 직접 Smad4
H2O2- 처리된 HS68 세포에서 hsa-miR-4535 모방 역전된 cistanche 유도 콜라겐 합성을 사용한 침묵 및 처리. 종합하면, 우리는 cistanche가 H2O2에 노출된 HS68 세포에서 Smad4 신호를 향상시키기 위해 hsa-miR-4535 수준을 감소시킴으로써 잠재적으로 콜라겐 합성을 조절한다고 결론지었습니다.
그림 5. Hsa-miR-4535은 Smad4를 대상으로 합니다. (A) 시스탕슈로 처리된 HS68 세포에서의 마이크로RNA 발현을 마이크로어레이를 사용하여 평가하였다. (B) miRDB 및 TargetScanHuman 데이터베이스를 기반으로 hsa-miR-4535에 의해 규제될 수 있는 잠재적인 mRNA 후보를 묘사하는 벤 다이어그램. hsa-miR-4535에 대한 Smad4-3'-UTR mRNA의 추정 miRNA 결합 부위의 서열 분석. 일치 항목은 직선으로 표시됩니다. (C) HS68 세포를 Smad4-3'-UTR-WT(야생형; 0.5 μg/mL) 및 hsa-miR-4535 모방체(2{ {25}} nM) 또는 Smad4-3'-UTR MT(돌연변이; 0.5 μg/mL) + hsa-miR-4535 mimic(20 nM)을 24시간 동안 처리합니다. 루시퍼라제 활성을 결정하고 Renilla의 활성으로 정규화했습니다. 결과의 정량화가 표시됩니다(n=3). ***P < 0.001, Smad4-3′-UTR-MT 및 hsa-miR-4535 모방 그룹 대비. G1=컨트롤, G2=시스탄체(10μM), G3=시스탄체(30μM)
Western blotting 결과는 cistanche가 HS68 세포에서 UVB 강화 MMP-1 발현을 억제함을 확인했습니다(그림 9A). 또한, 우리는 cistanche가 UVB에 의해 유발된 p16 및 p21 수준의 상승을 감소시킨다는 것을 입증함으로써 UVB 노출에 노출된 HS68 세포에서 cistanche의 노화 방지 효과를 명확히 했습니다(그림 9A). cistanche가 Smad4를 표적으로 하는 hsa-miR-4535의 억제를 통해 UVB 유도 콜라겐 분해를 약화시킬 수 있는지 여부를 평가하기 위해 qPCR을 사용하여 UVB 및 cistanche 공동 처리된 세포에서 hsa-miR-4535 및 Smad4 수준을 조사했습니다. 우리는 hsa-miR-4535 발현이 UVB에 노출된 세포에서 상당히 상향 조절되었지만 cistanche 처리 후에 감소했음을 발견했습니다. 반대로, Smad4 발현은 UVB 노출에 의해 억제되었고 이 억제는 cistanche 처리에 의해 현저하게 역전되었습니다(그림 9B, 9C). 총체적으로, 우리의 연구 결과는 cistanche가 HS68 세포에서 Smad4 신호 전달을 촉진하기 위해 hsa-miR-4535 수준을 억제함으로써 콜라겐 형성의 UVB 유도 감소를 복원하기 위해 H2O2와 유사한 효과를 발휘한다고 제안했습니다.
또한, Cistanche 적용은 UVB 손상 피부 조직에서 TGF , p smad2/3 및 Smad4 단백질 발현을 구했습니다(그림 12C). 우리의 연구 결과는 cistanche가 hsamiR-4535을 억제하여 P-smad2/3의 활성화를 위한 Smad4 발현을 향상시켜 최종적으로 콜라겐 합성을 촉진함으로써 잠재적으로 UVB 유발 손상으로부터 피부를 보호할 수 있음을 나타냅니다(그림 13).
그림 9. cistanche는 TGF/Smad 콜라겐 합성 경로를 강화하고 피부 노화를 약화시킬 뿐만 아니라 UVB에 노출된 HS68 세포에서 hsa-miR-4535 발현을 억제합니다. HS68 세포를 UVB(40 mJ/cm2 )에 노출시킨 다음 23시간 동안 시스탄체(30 μM)로 처리했습니다. (A) 콜라겐 합성 관련 경로 성분(TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1), 콜라겐 분해 관련 단백질(MMP{20}}) 및 노화- 연관된 마커(p16 및 p21)가 웨스턴 블롯에 의해 검출되었습니다. GAPDH는 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. (B 및 C) hsa-miR-4535 및 Smad4의 RNA 발현은 qRT-PCR에 의해 검출되었습니다. 값은 평균 ± SE로 표시됩니다. 결과의 정량화가 표시됩니다(n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, 대 처리되지 않은 대조군 세포; #P < 0.05, ##P < 0.01 대 UVB 노출 세포.
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