각 검사 조건에서 최소 2개의 빈도로 단백질이 발견되었습니다.

연락주세요oscar.xiao@wecistanche.com자세한 내용은

또한, 도 5B 및 6B의 막대 차트에서와 같이, 분비 세포 저산소 전제 조건에 따른 독특한 단백질 분포를 확인할 수 있습니다. 이 경우 완전한 정보를 위해 DAve 및 DCI 세트의 임계값을 초과하지 않는 단백질도 보고되었습니다. 태아는 저산소 제형에서 60kDa 열 충격 단백질(HSPD1, 그림 5B, 왼쪽 패널)이 풍부한 분비체 결과를 가지고 있는 반면, 출생 직후 대응하는 평활근 세포 수축성 미오신 조절 [52]라이트 폴리펩타이드 9(MYL9, 그림 5B, 오른쪽 패널). 임신 단계 간의 차이의 중요한 부분은 hAFS의 저산소 전제 조건에 더 많이 의존하는 것 같습니다. 전기차; 저산소 세포 프라이밍에서 얻은 f-have-EV는 Perlecan(HSPG2), Agrin(AGRN), Laminin Subunit -5 및 -1(LAMA5 및 LAMB1), Thrombospondin{17 }} (THBS1, 그림 6B, 왼쪽 패널). 저산소성 p-hAFS-EV에는 페리틴 중쇄(FTH1), Flotillin-1(FLOT1), Fascin(FSCN1), Annexin A6(ANXA6), Rab GDP 해리 억제제 베타(GDI2)와 같은 스캐폴딩 단백질이 Thy와 함께 포함되어 있습니다. -1 막 당단백질(THY1), 뉴로필린{31}}(NRP1) 및 매트릭스 금속단백질 14(MMP14, 그림 6B, 오른쪽 패널).

자세한 내용을 보려면 여기를 클릭하십시오.

f-hAFS의 각 검사 조건에서 단백질이 2 이상의 빈도로 발견되었습니다. EV 및 p-hAFS-EV는 Vesciclepedia 데이터베이스와 추가로 비교되었습니다[53]. 예상대로 식별된 단백질의 대부분(96%)은 이전에 참조 데이터베이스의 EV 및 엑소좀에서 설명되었습니다(그림 S3A).시스탄체 혜택이와 관련하여 Gene Ontology(GO) 농축 분석은 FunRich를 통해 수행되었습니다[54]. 데이터 세트의 GO 용어의 풍부함은 생물학적 과정, 분자 기능 및 세포 구성 요소에 대한 관련성에 따라 통계적으로 과도하게 대표되는 단백질 그룹을 찾기 위해 참조 데이터베이스의 자연량과 비교되었습니다(이 마지막 측면의 데이터는 데이터가 아닙니다. 표시되지만 요청 시 사용 가능). 확인된 단백질과 관련된 분자 기능의 분석과 관련하여, hAFS-CM 분획은 세포외 기질 및 세포골격, 세포골격 단백질 결합 및 구조적 분자 활성의 구조적 구성성분의 농축을 나타내는 반면(그림 S2), hAFS-EV는 구조적 세포골격 및 리보솜, DNA 및 RNA 결합 및 GTPase 및 샤페론 결합 인자의 구성요소(그림 S3C).

hAFS-CM 및 have-EV 둘 다에 대한 생물학적 과정 농축 분석은 태아 및 주산기 hAFS 분비 분획에서 조절된 대부분의 단백질이 세포 성장/유지 및 단백질 대사에 속하는 것으로 나타났습니다(그림 5C 및 6C). hAFS-EV 내에서 우리는 "세포 외 기질 구조 구성 요소"라는 용어가 저산소 f-hAF-EV와 독점적으로 관련되어 있음을 발견했습니다. 용어 "칼슘 이온 결합" 및 "구조적 분자 활성"은 주로 저산소 f-hAFS 및 p-hAFS 샘플에서 풍부했습니다(그림 S3B).

Figure 6. Comparative proteomics analysis of fetal- and perinatal hAFS-EVs. (A)Venn diagram illustrating the distribution of proteins identified with a frequency of at least 2 within f-hAFS-EVSnormo (dark yellow),f-hAFS-EVSHypo (red), p-hAFS-EVSnormo (light green), and p-hAFS-EVShypo (dark green). (B)Differentially expressed proteins were identified in fetal hAFS-EVs (left panel) and perinatal hAFS-EVs (right panel) by label-free quantification with MAProMa software. Left panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between normoxic control (dark yellow bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (red bars and positive DAve values) of f-hAFS-EVs over p-hAFS-EVs. Right panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between control normoxic (light green bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (dark green bars and positive DAve values) of p-hAFS-EVs over f-hAFS-EVs. Proteins with DAve (ratio of protein expression)>10.4I 및 DCI(미분 표현 신뢰도) I5I 이상이 필터를 통과하고 차등 표현된 것으로 간주됩니다. 보고된 단백질의 전체 목록과 자세한 매개변수는 표 S3을 참조하십시오. (C) 저산소 전처리 후 f-hAFS-EV(왼쪽 패널) 및 p-hAFS-EV(오른쪽 패널)에서 2 이상의 빈도로 식별된 단백질의 생물학적 과정 농축 분석. FunRich 도구를 기반으로 유전자 온톨로지 용어는 각 범주에 대해 농축된 유전자의 백분율을 보고하는 막대 차트에 표시됩니다(f-hAFS-EVsnormo의 경우 진한 노란색 막대, f-hAFS-EVShypo의 경우 빨간색 막대, p-hAFS의 경우 밝은 녹색 막대). -p-hAFS-EVShypo에 대한 EVsnormo 및 짙은 녹색 막대). Bonferroni가 수정된 유전자 온톨로지 용어만*p<0.05 are="">

Cistanche 캔 안티 에이징

2.6. 태아 대 주산기 has-CM 및 have-EV의 사이토카인 및 케모카인 프로파일링은 서로 다른 분포 패턴을 드러냈습니다.

우리는 이전에 측분비 효과를 통해 손상된 심혈관 세포에 대한 f-hAFS-CMhypo의 재생 능력을 검증했습니다[34,35,49]. 여기에서 우리는 f-hAFS-CMHypo의 사이토카인 및 케모카인 함량을 상응하는 p-hAFS 대응물(그림 7A, 그림 S4A 및 표 S4)과 비교하고 몇 가지 구별 요인을 발견했습니다.

ANGIOGENIN, 세포외 기질 금속단백분해효소 유도제(EMMPRIN), 인터루킨 8(IL-8) 및 단핵구 화학 유인 단백질-1(MCP-1)은 inf-hAFS-CMNypo가 독점적으로 풍부하게 발견되었으며 그렇지 않았습니다. p-hAFS-CMhypo에서 검출되었습니다. 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 2(IGFBP2) 및 오스테오폰틴(OPN)은 f-hAFS-CMhypo에서 p-hAFS-CMHypo에 비해 3.{16}}및 3.{18}}(" 피<0.05 and=""><0.01 respectively,="" figure="" 5a).="" plasminogen="" activator="" inhibitor-1(pai-1)="" was="" strongly="" expressed="" in="" both="" f-hafs-cmhypo="" and="" p-hafs-cmnypo="" (figure7a).="" other="" cytokines="" were="" detectable="" at="" low="" levels,="" namely="" cystatin="" c(cst3),="" fibroblast="" growth="" factor="" 19="" (fgf-19)interleukin-17a="" (il-17a),="" macrophage="" migration="" inhibitor="" factor="" (mif),="" pentraxin="" 3="">

태아 대 주산기 have-CM은 사이토카인 및 케모카인 프로파일에서 차등 발현을 나타내었지만, 해당 태아 대 주산기 EV 대응물은 더 낮은 발현 프로파일(그림 7B, 그림 S4B 및 표 S5)을 사용하더라도 더 균일하게 분포되었습니다. 그럼에도 불구하고 DiPeptidyl-Peptidase IV(DPPIV), 성장/분화 인자 15(GDF-15), IL-8은 f-hAFS-EVSHypo에 의해서만 발현되었지만 수준; ANGIOPOIETIN2, CD40 LIGAND 및 비타민 D 결합 단백질(VDBP)은 다시 한번 적은 양으로 검출되었음에도 불구하고 p-hAFS-EVShypo에서만 발견되었습니다. 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF)ENDOGLIN, FGF{17}}, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 3(IGFBP3), IL{21}}a, MIF OPN, PTX3, 기질 유래 인자{21}}와 같은 기타 사이토카인 {23}} 알파(SDF-1a)는 f-hAFS-EVShypo와 p-hAFS-EVSHvpo에서 모두 발견되었으며 PAI{29}}와 EMMPRIN이 더 많이 표현되었습니다(그림 7B).

BDNF, ENDOGLIN, IGFBP3 및 SDF-lo는 임신 단계에 관계없이 해당 hAFS-CM과 비교하여 모든 저산소 have-EV에서 독점적으로 풍부했습니다. 더욱이, EMMPRIN은 p-hAFS-CMhypo 내에서 검출되지 않았지만, EV 상응하는 분획에서 풍부한 것으로 밝혀졌다; 반대로, OPN은 f-have-EVShypo에서보다 f-have-CMhypo에서 더 풍부했던 반면, 상응하는 p-hAFS secretome 분획에서 비슷했습니다. FGF{11}}, MIF 및 PTX3은 태아 및 주산기 has-CM과 해당 hAFS-EV에서 유사하게 발현되었습니다. PAI{16}}는 저산소 분비체 분획이 매우 풍부했습니다.

그림 7. 태아 및 주산기 hAFS secretome 제형 내 사이토카인 및 케모카인 프로파일링. (A) 저산소 태아 대 주산기 have-CM(f-hAFS-CMHypo 대 p-hAFS-CMHypo) 내에서 검출된 사이토카인 및 케모카인의 발현은 임의 단위[AU]에 의해 픽셀 밀도로 보고됩니다. 값은 독립적인 실험의 평균 ±sem으로 표시되며 표 S4에 보고됩니다.*p=0.0485;**p{11}}.006.(B) 저산소 상태의 태아 주산기 hAFS-EV 대 (f-hAFS-EVSHypo 대 p-hAFS-EVSHypo) 임의 단위의 픽셀 밀도로 표현 [AU].시스탄체 콜레스테롤값은 n{0}}개의 독립적인 실험의 평균 ± sem으로 표시되며 표 S5에 보고됩니다. CST3: 시스타틴 C;EMMPRIN:세포외 기질 금속단백분해효소 유도제;FCFF-19: 섬유아세포 성장 인자-19; IGFBP2: 인슐린 유사 성장 인자(IGF) 결합 단백질 2;IL-8:인터루킨 -8;IL{10}}a:인터루킨{11}}a; MCP-1: 단핵구 화학유인 단백질-1;MIF: 대식세포 이동 억제 인자; PTX3: 펜트락신 3; PAI{16}}: 플라스미노겐 활성제 억제제{17}}; BDNF: 뇌 유래 신경영양 인자; DPPIV: 디펩티딜 펩티다제 IV; GDF-15: 성장 분화 인자-15;IGFBP3: 인슐린 유사 성장 인자(IGF) 결합 단백질 3;SDF-1a: 기질 유래 인자-1 알파; VDBP: 비타민 D 결합 단백질.

2.7.태아 및 주산기의 EV는 화물에 RNA 정보가 풍부합니다.

작은 비코딩 RNA가 표적 세포에 대한 EV 측분비 영향의 마스터 레귤레이터로 간주되었기 때문에[4,55], 우리는 주로 f-hAFS-EV 및 p-hAFS-EV 내의 microRNA(miRNA) 함량에 대한 RNA 시퀀싱 분석에 집중했습니다. Small RNA 프로파일링은 총 small RNA 양과 비교할 때 태아 및 주산기 hAFS-EV(약 35-36 퍼센트)에서 miRNA의 농축을 보여주었습니다(그림 8A). miRNA 성분은 rRNA(***p) p < 0.0001)과="" 함께="" 두="" ev="" 제형에서="" 가장="" 많이="" 대표되는="" 두="" rna="" 종="" 중="" 하나였습니다.="" 다음="" mirna는="" 분석된="" ev="" 샘플에서="" 가장="" 많이="" 농축되었습니다.="" mir{13}}p;="" mir{14}}a{15}}p;="" mir{16}}p;="" mir{17}}p;="" mir{18}}a{19}}p;="" mir-27b-3p,let{22}}a{23}}p,let{24}}b{25}}p,let{26}}f{="" {27}}p,let{28}}i{29}}p,mir{30}}p,mir{31}}p,mir-29a{33}}p,="" mir30a-5p,="" mir{36}}b-5p,mir-155-5p,mir-191-5p="" 및="" mir{40}}p.="" 참고로,="" 태아="" 및="" 주산기="" have-ev는="" 이러한="" mirna의="" 대부분을="" 공유했습니다(즉,="" let-7a-5p,let-7b-5p,let{47="" }}f-5p,="" let{49}}i{50}}p,="" mir{51}}p,="" mir{52}}p,="" mir{53}}a{54="" }}p,mir30a-5p,="" mir{57}}b{58}}p,="" mir{59}}p,="" mir-191-5p="" 및="" mir{61}}p,="" 그림="" 7b).="" 15개의="" 가장="" 풍부한="" mirna="" 종은="" 각="" 샘플의="" 총="" mirna="" 함량의="" 60%="" 이상을="" 차지했습니다.="" 반면에,="" 소포="" mirna="" 함량의="" 나머지="" 30%에서="" 약="" 100개의="" mirna가="" 발견되었습니다(그림="">

hAFS-EV 내의 miRNA 함량을 추가로 특성화하기 위해 우리는 hAFS 임신 단계 또는 시험관 내 저산소 세포 사전 조절이 특정 miRNA의 농축에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 조사했습니다. 가장 강력한 변조는 거의 모든 변조된 miRNA가 주산기 대응물보다 f-hAFS-EV가 풍부한 임신 단계 사이에서 발견되었습니다(그림 9A 및 표 1). 저산소 사전 컨디셔닝은 miRNA 화물에 더 약한 영향을 미치는 반면, 이 비교에서는 일부 miRNA가 저산소 및 정상 산소 제어 조건에서 농축된 다른 miRNA와 함께 어느 한 방향으로 진행되었습니다(그림 9A).

보완적인 분석으로, 우리는 조사된 두 임신 단계에서 파생된 EV에 대해 다양한 기증자와 배양 전처리에 걸쳐 가장 낮은 변동성을 가진 조사된 miRNA의 식별에 초점을 맞추었습니다. 이 분석의 결과인 miRNA는 높은 발현 수준에서 낮은 발현 수준까지 확장되었습니다(그림 9B). hAFS-EV 화물의 가장 안정적인 miRNA 코어 내에서 f-hAFS-EV와 p-hAFS-EV 간에 일부 공유 miRNA가 확인되었습니다(miR-21-5p, miR{7}}a{8}} 높은 수준에서 p, miR{9}}p; 희미한 수준에서 miR{10}}p,miR{11}}p 및 miR{12}}p, 표 2).

그림 9. 태아 및 주산기 hAFS-EV에서 miRNA의 차등 농축 분석. (A) 임신 단계에 따른 hAFS-EV miRNA 화물의 차등 농축을 위한 화산 플롯(왼쪽 패널) 및 분비 세포의 시험관 내 저산소 사전 컨디셔닝(오른쪽 패널). miRNA에 대한 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오. (B) 높은(노란색 점)에 따른 태아 hAFS-EV(왼쪽 패널) 및 주산기 hAFS-EV(오른쪽 패널) 내의 안정적인 miRNA의 가변성(X축)과 농축 수준(Y축) 간의 상관 관계의 산포도, 희미한(녹색 점) 및 낮음(진한 자주색 점) 농축. miRNA에 대한 자세한 내용은 표 2.RPM: 100만 회당 읽기를 참조하십시오.

3. 토론

버려진 인간 양수 샘플은 재생 의학 및 조직 공학에서 유망한 잠재력을 가진 기질 세포의 귀중한 원천으로 확인되었습니다. 분리와 관련된 윤리적 문제는 임신 II 삼분기(태아 hAFS) 동안 일상적인 산전 선별 양수천자의 남은 샘플에서 얻을 수 있거나 III 삼 분기 예정된 제왕절개 섹션에서 임상 폐기물로 폐기된 양수에서 얻을 수 있기 때문에 최소화됩니다. 절차(주산기 hAFS). 최근에 hAFS는 실험적 질병 모델에서 얻은 고무적인 증거를 감안할 때 인간 조직 복구 및 재생을 위한 잠재적 치료제로 제안되었습니다. 흥미롭게도, 태아-신생아 신경계 질환의 자궁 내 치료에도 제안되었습니다. 실제로, 전임상 연구에 따르면 양수 내 전달을 통해 산전 투여된 hAFS는 골수수막류[56-58]의 쥐 모델에서 측분비 활동을 통해 임신 기간 동안 척수를 보호하고 실험 설치류 위분리증에서 노출된 장의 손상을 감소시켰다고 제안했습니다[59 ]. 번역적 관점에서, hAFS의 자궁내 이식은 그들의 secretome(hAFS-CM o hAFS-EVs)의 가장 적합한 제제의 투여로 대체될 수 있습니다.시스탄체 데저티콜라 부작용이 전략은 표준 세포 요법의 한계(즉, 시간이 많이 소요되는 시험관 내 세포 확장)를 극복하는 동시에 기성품 및 즉시 사용 가능한 약제학적 제형을 제공함으로써 임신 기간 동안 신속하고 시기 적절한 개입을 허용할 것입니다.

덜 침습적인 산전 진단 기술의 최근 발전은 가까운 장래에 양수천자 절차의 감소를 초래할 수 있으며, 따라서 주산기 hAFS를 보다 접근 가능한 옵션으로 옹호합니다. 그럼에도 불구하고 태아 hAFS는 발달적으로 더 미성숙하기 때문에 더 효과적인 측분비 잠재력을 가질 수 있습니다. 이 시나리오 내에서 태아 및 주산기 c-KITt hAFS를 비교하고 분비체 분획을 프로파일링하는 데 집중했습니다. 우리는 측분비 능력의 가능한 임상 번역을 위해 고려해야 할 관련 구분을 강조했습니다.

이전의 독립적인 연구와 일치하게, 우리는 임신 단계가 이질적인 hAFS 형태와 중간엽 항원 프로파일에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여줍니다[25,26]. 그런 다음 표준 기질 면역 표현형을 넘어 세포 분비 및 측분비 활동에 영향을 미칠 가능성이 더 큰 매개 변수를 평가했습니다. 특히 골수 중간엽 전구 세포 내 CD 양성인 CD107a 높은 하위 집단의 존재는 최근 현저한 조절 및 치료 측분비 활성과 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다[47]. 여기에서 우리는 태아 및 주산기 hAFS가 관련 번역 의미와 함께 분비 능력을 지원하는 이 분자 서명에 의해 강하게 특징지어진다는 것을 밝혔습니다. 더욱이, 태아 hAFS는 비효율적인 호기성 대사를 특징으로 하는 반면, 성숙한 주산기 태아는 더 높은 산소 소비율과 ATP 합성을 보였다. 이것은 같은 경향을 보인 조산 신생아의 탯줄 기질 세포와 유사한 II 삼분기 hAFS의 더 미성숙한 대사 프로파일을 시사할 수 있습니다[60].

측분비 전위를 유발하기 위해 hAFS를 24시간 무혈청 저산소 프라이밍에 노출시켰습니다. 이는 우리가 이전에 태아 세포에 대해 성공적으로 개발한 [34,35,37] 전략이며 여기에서 처음으로 태아 세포에 대해 조사했습니다. 저산소 상태에서 태아 및 주산기 hAFS를 사전 조절하면 분비물 농도와 방출된 EV의 양이 증가하는 긍정적인 경향이 있는 반면, 임신 단계는 세포 분비물 수율이나 EV 형태 및 크기 분포에 어떤 영향도 미치지 않았습니다.

특히, hAFS 측분비 화물의 특성화는 우리가 평가한 다양한 조건에 따라 몇 가지 특정한 차이점을 드러냈습니다. 태아 hAFS secretome의 proteomic 프로파일링은 임신 단계 및 세포 저산소 전제 조건을 기반으로 식별 가능한 인자 분포를 나타냈습니다. 이것은 hAFS 측분비 전위가 Ⅱ에서 Ⅲ 임신 삼분기까지 성숙하는 동안 뚜렷한 동일성을 획득할 수 있으며, 이는 차례로 시험관 내에서 분비 세포를 자극함으로써 조절될 수 있음을 나타냅니다. hAFS-CM 및 hAFS-EVs의 생물학적 과정 농축 분석은 대부분의 조절된 단백질이 세포 성장/유지 및 단백질 대사와 일치할 수 있으며, 따라서 지금까지 보고된 세포 유익한 측분비 효과를 뒷받침할 수 있음을 시사했습니다. 특히, 저산소성 태아 hAFS 총 세크레톰은 열 충격 단백질 HSPD1(HSP60)이 풍부하여 당뇨병 마우스 피부 손상 모델에서 상처 치유를 지원하고 M2 표현형으로 왜곡되는 대식세포를 촉진하는 것으로 입증되었습니다[61] . 마찬가지로, 저산소 상태의 태아 hAFS-EV는 신경 발생(HSPG2[62], 세포 자가 재생, 뇌 및 심혈관 발달(LAMA5[63] 및 LAMB1[64]) 및 이동(THBS1[2])을 촉진하는 요인에 대해 풍부합니다. AGRN은 태아 hAFS의 저산소 프라이밍 후 EV에서도 발견되었습니다.cistanche 복용량 레딧우리의 발견은 AGRN이 염증 및 저산소 자극 자극 하에서 중간엽 기질 세포의 프로테옴에서 상향 조절된다는 이전의 증거와 일치합니다[65]. AGRN은 또한 면역 시냅스 신호 전달[66]과 관련이 있고 신생아 마우스 심장 재생[67]과 일치하여 재생 측분비 효과에 대한 발달적으로 어린 태아 hAFS의 뚜렷한 소인을 뒷받침하는 것으로 나타났습니다. 더욱이, 태아 hAFS는 ANGIOGENIN, EMMPRIM, IL-8 및 MCP{4}} 사이토카인[68]과 같은 혈관 재생 효능의 예측 인자의 농축에 의해 보여지는 바와 같이 저산소 전제 조건에 더 반응하는 것으로 확인되었습니다. 그들의 조건 배지. 이는 심근경색증, 뒷다리 허혈 및 허혈성 피부근막피판의 전임상 설치류 모델에서 내인성 신동맥신생을 촉진하는 태아 hAFS-CM의 측분비 효능에 대한 이전 증거를 뒷받침합니다. [34,{10}}]게다가, 태아 hAFS 총 세크레톰은 주산기에 비해 IGFBP2 및 OPN이 훨씬 더 풍부한 것으로 밝혀졌으며, 따라서 보다 확연한 프로 해결 및 노화 방지 조절 프로필을 시사합니다[{14}}]. 주산기 have-CM은 측분비 인자에서 덜 향상되지만 CST3[76,77] 및 MIF[78]와 같은 신경 영양 및 면역 조절 인자로 유사하게 보충되었습니다.

총 hAFS-CM과 비교하여 해당하는 저산소 태아 및 주산기 EV 대응물은 소포 구획에서 대부분 농축된 혈관 리모델링 매개체 EMMPRIN [79]을 제외하고 사이토카인 및 케모카인의 더 낮은 발현을 나타냈다. 이전에 보고된 태아 hAFS-EV[34,37]의 심장 활성 및 재생 촉진 프로필은 심장 보호 IL-8[80] 및 GDF{11}}의 독점적인 발현의 증거에 의해 여기에서 확인되었습니다. 내인성 성인 해마 신경발생을 유발하는 주요 측분비 인자[81,82] 뿐만 아니라 안트라사이클린에 의해 유발된 심장독성[78]에 대응합니다. 태아 및 주산기 hAFS-EV 모두 전구/줄기 세포 밀매 조절자 SDF-1 [{19}}]에 대해 유사한 발현을 보였습니다. 단백질체 분석은 저산소 주산기 hAFS-EV에서 NRP1[{21}}] 및 MP14[87]와 같은 혈관신생과 관련된 단백질의 발현 증가를 보고했습니다. 이러한 자극 프로파일은 골격근 허혈성 손상의 전임상 마우스 모델에서 Ⅲ기 hAFS의 내피 재생 특성에 대한 이전 결과를 설명할 수 있습니다[25]. 특히, 신경 성장 인자 BDNF는 비록 소량이지만 태아 및 주산기 EV 화물 모두에서 발견되었으며, 따라서 인간 뼈에서 분비되는 세포외 소포에서도 관찰된 바와 같이 신경 생존 및 신경 발달 과정에서 hAFS-EV에 대한 추정 신경영양 활성을 시사합니다. 골수 및 제대혈-MSC[8889]. 저산소 자극을 받는 태아 및 주산기 hAFS의 세크레톰 제형 모두 심장에서 M2 대식세포의 분극화에 관여하고 심장 보호 기능을 부여하는 내피 활성화 촉진제인 PAI{33}}가 풍부한 것으로 나타났습니다. 및 항섬유화 가능성[91].

MicroRNA(miRNA)는 줄기 세포 및 중간엽 기질 세포 EV 측분비 활성의 중요한 조절자로 광범위하게 다루어져 왔습니다[92,93]. 여기에서 우리는 hAFS-EV 내에서 가장 풍부한 miRNA 종이 각 샘플의 총 miRNA 함량의 60% 이상을 차지한다는 것을 발견했습니다. 이러한 miRNA는 중간엽 기질 세포-EV의 분자 화물을 특성화하고(let{8}}a{9}}p[4,95]), 혈관 재생에 영향을 미치고 섬유증을 억제함으로써 심근 허혈을 보호하는 것으로 보고되었습니다(let -7b{13}}p, let{14}}f{15}}p, miR{16}}p 및 miR{17}}p [96,97]), 프로모션 각질세포 기능(miR{20}}p[98])을 조절하여 상처를 치유하고 전뇌 허혈(miR{22}}a{23}}p[99,100]) 후 신경 세포 사멸에 대응합니다. 한편, 소포성 miRNA 함량의 나머지 30%에서 약 1000개의 miRNA가 발견되었다. 이러한 불균형 분포는 이전 연구[4]와 일치하며 대부분 농축된 miRNA를 hAFS-EV의 주요 생물학적 활성에 대한 추정 책임 있는 것으로 강조합니다. 흥미롭게도 태아 및 주산기 hAFS-EV는 15개 miRNA의 대부분을 공유했습니다. 참고로, 우리는 태아 hAFS-EV와 주산기 모두 다양한 농축 수준에 걸쳐 매우 안정적인 miRNA 세트를 포함하고 있음을 관찰했습니다. 이러한 증거는 hAFS-EV에 대한 qPCR 실험에서 내부 참조 대조군으로 사용되는 광범위한 "하우스키핑" 후보를 제안할 수 있습니다. 또한 이러한 안정적인 miRNA의 일관된 하위 집합(miR-16-5p,miR-21-5p,miR-22-3p,miR-29a{39}}p,miR{ {40}}y miR-221-5p)는 두 임신 단계 간에 공유되며 대부분이 풍부한 15단계와 겹치므로 훨씬 더 일정한 행동과 신뢰할 수 있는 사전 분해 분자 서명([96,{45 }}]). 참고로, 이러한 독특한 코어 내의 몇 가지 후보가 II 삼분기 양수 유래 중간엽 기질 세포(miR-29a-3p 및 miR{{ 49}}p[95]). 그럼에도 불구하고, 우리는 또한 재태 연령이 저산소 전제 조건보다 miRNA 화물을 더 많이 조절할 수 있음을 발견했습니다. III기 태아 hAFS에서 얻은 발달적으로 더 어린 EV는 이전에 배아 줄기 세포(miR{51}}p[101])의 생존력, 세포 증식 및 골수 기질 세포(miR)의 골형성 분화를 지원하는 것으로 나타난 miRNA로 풍부했습니다. -217 [102]), 종양 억제 가능성도 가지고 있습니다(miR-302-3p[103,104]);miR-383-5p[105,106]).

우리의 결과를 기반으로 태아 및 주산기 hAFS가 재생 의학에 이용될 매력적인 측분비 공급원을 나타낼 수 있음을 확인합니다. 그들의 표현형과 분비 활동은 유사했지만, 우리는 그들의 미래 치료 번역을 위한 유용한 통찰력으로 그들의 secretome 공식에서 몇 가지 독특한 측면을 강조했습니다.

4. 재료 및 방법

4.1.인간 양수 줄기 세포 분리 및 체외 배양

인간 양수 줄기 세포(hAFS)는 임신 2기 양수 천자(태아 hAFS, f-hAFS)를 통한 일상적인 산전 선별 검사에 의해 수집된 양수(AF)의 남은 샘플에서 분리하거나 임신 3기 동안 예정된 제왕 절개 분만 동안 임상 폐기물로 분리되었습니다. (주산기 hAFS,p-hAFS) IRCCS 산 마르티노 병원 산전 진단 및 주산기 의학과, IRCCS Istituto Gaslini 병원(이탈리아 제노바) 태아 및 주산기 의료 및 외과 병동 및 인간 유전학 연구실. 지역 윤리 위원회 승인(프로토콜 PR428REG2015) 및 헬싱키 선언 지침에 따라 모든 기증자로부터 사전 서면 동의를 받았습니다. II 삼분기 태아 AF 샘플은 평균 연령이 약 37.42±0.32세인 여성 기증자로부터 얻었습니다(n{10}} 범위는 36-41세까지). III 삼분기 태아 AF 샘플은 다음에서 얻었습니다. 평균 연령이 34.25±1.31세인 여성 기증자(n{17}} 범위는 26-에서 42세까지). 태아 및 주산기 hAFS는 정상 핵형에 대해 검증된 샘플에서 얻었고 부착성 AF 중간엽 기질 세포로부터 c-KIT 발현(CD117 MicroBead Kit, Miltenyi Biotechnology, Bologna, Italy)에 대한 면역자기 분류에 의해 분리되었습니다[16].시스탄체 추출물의 장점c-KIT* hAFS는 15% FBS(Fetal Bovine Serum, Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy), 18% Chang B 및 2% Chang C 배지(Irvine Scientific)가 포함된 최소 필수 배지(MEM)-알파에서 배양되었습니다. , Santa Ana, CA, USA) 1% L-글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy), 5% CO2 및 20% Oz 분위기의 37도 인큐베이터에서 배양 그들의 secretome을 분리하기 위해 사용되기 전에 시험관 내에서 5개 계대.

4.2.hAFS 대사의 생화학적 평가

Cell aerobic metabolism was evaluated in terms of oxygen consumption and ATP synthesis through the FI-Fo ATP synthase. Oxygen consumption rate (OCR) was measured at 37 ℃ in a closed chamber magnetically stirred using an amperometric electrode (Unisense-Microrespiration, Unisense A/S, Denmark). One hundred thousand (10>) 세포를 각 실험에 사용했습니다. 기초 호흡을 평가하기 위해 hAFS를 10분 동안 0.03mg/mL 디지토닌으로 투과시키고 인산 완충 식염수(PBS)에 현탁했습니다. 10mM 피루베이트 + 5mM 말레이트 또는 20mM 숙시네이트를 첨가하여 경로를 자극했습니다. - 단지 I, II 및 IV 또는 단지 Ⅱ 및 IV로 각각 구성된 길 [60].

글루타민, 장쇄 지방산 산화 및 포도당의 호흡에 대한 상대적 기여도를 평가하기 위해 디지토닌 투과화 후 세포를 성장 배지와 4uM의 BPTES, 4uM의 Etomoxir 및 4uM의 UK5에 현탁했습니다.{22} }99는 각각 글루타미나제, 카르니틴 팔미토일-트랜스퍼라제 1A(CPT1A) 또는 미토콘드리아 피루베이트 운반체(MPC)를 억제하기 위해 추가되었습니다. Fi-F.ATP synthase(ATP synthase) 활성은 고감도 luciferin/luciferase 방법으로 ATP 생산을 측정하여 검출하였다. 분석은 37도에서 2분 동안 수행되었으며 데이터는 30초마다 수집되었습니다. 첫 번째 실험 세트에서 1{38}}도 세포를 50mM KCl,1mMEGTA,2mMEDTA,5mMKH2PO4,2mMMgC12,0.6mMouabain,1mM P1P{26}}Di를 포함하는 배지에서 1{49}}분 동안 배양했습니다. (아데노신{27}}')펜타-포스페이트, 0.040 mg/mL 암피실린, 및 10mM Tris-HCl pH7.4. 그 후, 호흡 기질(10mM 피루베이트 + 5mM 말레이트 또는 20mM 석시네이트) 및 0.1mM ADP를 첨가하여 ATP 합성을 유도하였다. 반응은 Luminometer(GloMax 20/20 Luminometer, Promega, Milan, Italy)ATP 표준 용액(Roche, Basel, Switzerland)에서 루시페린/루시페라제 ATP 생물발광 분석 키트 CLSII(Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 측정되었습니다. 42}}/M이 보정에 사용되었습니다. 두 번째 실험 세트에서 ATP 합성은 4 uM BPTES, 4 uM Etomoxir 또는 4 uM UK5099의 존재하에 평가되었습니다. 이 경우, 10개의 세포는 대사 억제제 및 ATP 합성은 0.1mM ADP로 유도되었습니다. OxPhos(산화적 인산화) 효율(P/O 비율)은 생성된 ATP 농도와 호흡 기질 및 ADP가 있는 상태에서 소모된 산소량 사이의 비율로 계산되었습니다. 산소 소비가 에너지 생산에 완전히 사용될 때 P/O 비율은 피루브산과 말산 또는 숙시네이트를 추가한 후 각각 약 2.5 및 1.5이어야 합니다. 성장 매체에서. 포도당 소비는 340 nm에서 NADP가 감소한 후 헥소키나제(HK) 및 포도당{56}인산 탈수소효소(G6PD) 커플링 시스템에 의해 평가되었습니다. 검정 배지는 100mM Tris-HCl, pH7.4,2mM ATP, 10mMNADP, 2mMMgC12, 2IU의 헥소키나아제 및 2IU의 포도당 인산 탈수소효소를 포함했습니다. 340 nm에서 NAD 플러스의 감소 후에 젖산 방출을 분석하였다. 분석 배지는 100mM Tris-HCl(pH8), 5mM NAD 플러스 및 1IU/mL의 젖산 탈수소효소를 함유했습니다. 정제된 젖산 탈수소효소 4ug을 첨가하기 전과 후에 샘플을 분석하였다. 두 경우 모두 데이터를 세포 수로 정규화하고 각각 mM 포도당/10도 세포 또는 mM 젖산 방출/10도 세포로 표현했습니다[107].

4.3.hAFS의 유세포 분석 특성화

10만(1{14}}5)태아 및 p-hAFS 세포를 분리하고 마우스 항인간 CD107a-Alexa Fluor647-및 항인간 CD146-FITC- 접합 항체(eBioscience, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy). 제조업체의 지침에 따라 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mi-lan, Italy)를 사용하여 세포 사멸을 평가했습니다. 이벤트는 FACS Diva 소프트웨어(BD Bioscience, Bec-ton Dickinson, Milan, Italy)가 장착된 BD Bioscience FACS Aria II 분류기 및 분석기에서 수집되었습니다. 데이터는 FlowJo V9.0 소프트웨어(BD Bioscience, Becton Dickinson, Milan)를 사용하여 분석되었습니다. , 이탈리아). 4.4.노화 염색

표준 시험관 내 조건에서 계대 5까지 배양된 hAFS의 노화 표현형을 노화 -갈락토시다제 염색 키트(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)로 평가했습니다. 제조업체의 지침에 따라 하룻밤 동안 37도에서 SA{6}}gal에 대해 confluency를 염색했습니다. Leica DMil 현미경(Leica Acquire 소프트웨어 V3.4.4, Leica Microsystems, Milan, Italy 장착)에서 노화 현상을 수집하고 필드당 총 세포에 대한 SA{11}}갈양성 세포의 백분율로 평가했습니다.

4.5. hAFS Secretome 분획의 분리 및 농축

f-hAFS 및 p-hAFS는 1% O2 저산소증 대 20% O2 정상산소 상태(대조군)의 무혈청 배지(SF)에서 24시간 동안 배양되었으며, 후자는 기준 기준으로 사용되었습니다. 이 사전 조절 전략은 이전에 보고한 대로 생리 활성 측분비 인자의 방출을 향상시키는 데 사용되었습니다[34,35,37,49]. hAFS를 무혈청(SF) 배지(1% L-글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 고글루코스 Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM, 모두 Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy)에서 정상 산소 상태에서 24시간 동안 배양했습니다. (37도에서 20% O2 및 5% CO2) 또는 저산소(CellXpert C170i 및 Galaxy 48R CO2 인큐베이터에서 37도에서 1% O2 및 5% CO2, Eppendorf, Milan, Italy) 조건.

f-hAFS-CM 및 p-hAFS-CM을 수집하고 4도에서 300x g에서 10분 및 2{28}}} x g에서 20분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거했습니다. hAFS-CM은 3kDa 선택적 컷오프(Amicon Ultra{12}}, Merck Millipore Darmstadt, Germany)가 있는 한외여과막을 사용하여 4도에서 3{32}} x g에서 90분 동안 농축한 다음 4에서 추가로 농축했습니다. 3000×g에서 30분 동안 도. hAFS-EV는 hAFS-CM에서 직렬 초원심분리에 의해 분리되고 농축되었습니다. 간단히 말해서, hAFS-CM을 수집하고 4도에서 300xg에서 10분 동안 원심분리하고 2000xg에서 20분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거했습니다. 그런 다음 상층액을 10,000 x g에서 40분 동안 처리했습니다. 펠릿을 버리고 상청액을 Beckman Coulter의 스윙 버킷 SW55Ti 원심 분리기 로터를 사용하여 10,000xg에서 120분 동안 Optima L{30}}K(Beckmann Coulter, Milan, Italy)에서 초원심분리하여 추가로 처리했습니다. 이종 hAFS-EV를 함유하는 펠릿을 120분 동안 100,000xg에서 최종 원심분리와 함께 PBS에서 세척한 다음, 0.22um 공극 필터 막으로 여과된 PBS에 재현탁시켰다. hAFS-CM 및 hAFS-EV 표면의 단백질 농도는 BiCinchoninic Acid (BCA) assay(Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy)를 사용하여 측정되었습니다. 샘플을 570 nm에서 Gen5 마이크로플레이트 판독기에서 획득하여 용액의 ug/10도 생성 세포 측면에서 hAFS-CM 및 hAFS-EV 수율을 평가했습니다.

4.6. 투과 전자 현미경 및 나노 입자 추적 분석에 의한 hAFS-EV의 특성화

투과 전자 현미경(TEM) 분석은 Hitachi TEM 현미경(HT7800 시리즈, Hitachi High Technologies, Monza, Italy)에서 수행되었습니다. 디지털 이미지는 Mega view 3 카메라와 Radius 소프트웨어(EMSIS, Muenster, Germany)로 촬영되었습니다. f-hAFS 및 p-hAFS를 hAFS 완전 배지로 1:1로 희석한 3.7% 파라포름알데히드(PA) 용액에 고정하고 0.1M 카코딜레이트 완충액으로 세척한 다음 즉시 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했습니다. 2.5% 글루타르알데히드를 함유하는 0.1M 카코딜레이트 완충액(Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA). 세포 펠렛을 1시간 동안 사산화오스뮴에, 1% 우라닐 아세테이트 용액에 1시간 동안 후고정시켰다. 샘플은 등급화된 에탄올 시리즈를 통해 42도에서 24시간, 60도에서 48시간 동안 탈수되었고 에폭시 수지(Poly-Bed; Polysciences Europe GmbH, Minneapolis, Germany)에 포매되었습니다. Leica Ultracut microtome(Leica Microsystems, Milan, Italy)으로 초박형 섹션(50 nm)을 절단하고 50% 에탄올 용액에 5% uranyl acetate로 대조염색했습니다. f-hAFS-EV 및 p-hAFS-EV를 20uL PBS 용액에 재현탁하고 0.1M 인산 완충 용액(pH7.4)에 동일한 부피의 2% 파라포름알데히드를 첨가하여 고정했습니다. 그런 다음 EV는 parafilm의 5μL 방울에 그리드를 떠서 formvar-carbon 코팅 구리 그리드에 10분 동안 흡착했습니다. 그 후, 부착된 EV가 있는 그리드를 PBS로 헹구고 실온에서 5분 동안 2% 우라닐 아세테이트 용액으로 음성으로 염색했습니다. 스테인드 그리드는 보존을 개선하기 위해 2.5% 메틸셀룰로스에 포함되었고 검사 전에 공기 건조되었습니다. hAFS-EV의 형태 분석은 40.{46}}×g 배율로 무작위로 촬영한 10장의 현미경 사진에서 측정되었습니다. Radius 소프트웨어(EMSIS, Muenster Germany)의 측정 대화 상자에 포함된 임의의 선 기능을 사용하여 크기를 계산했습니다. hAFS-EV의 크기 분포를 시각화하기 위해 결과는 산점도 플롯과 각 크기가 중앙값 및 범위에 대한 선과 함께 점으로 표시되는 빈도 분포로 표시되었습니다.

f-hAFS-EV 및 p-hAFS-EV도 나노입자 추적 분석(NTA)으로 분석하여 10도 세포에서 방출되는 입자를 평가했습니다. hAFS-EV는 PBS 용액에서 1:100으로 희석되었고 각각 60초의 서로 다른 3개 이상의 프레임을 기록하는 NanoSight LM10(Malvern Instruments, Malvern, UK)에서 획득했습니다. 소프트웨어의 배치 프로세스 옵션을 사용하여 각 샘플의 세 가지 다른 수집을 분석했습니다. 4.7.hAFS-CM 및 hAFS-EVs의 LC-MS/MS 분석 4.7.1.용액 내 소화

hAFS-CM 및 hAFS의 3가지 생물학적 복제물에 대해 단백질체 분석을 수행했습니다. 정상 산소 또는 저산소 조건 후 f-hAFS 및 p-hAFS의 EV(n=24 다른 조건).hAFS-CM 및 hAFS-EV 샘플을 0.1M NHCO3 pH 7.9에 현탁하고 RapigestIM으로 처리했습니다. 0.25%(w/v)의 최종 농도에서 SF 시약(Waters Co, Milford, MA, USA). 생성된 현탁액을 100도에서 2{{40}}분 동안 교반하면서 인큐베이션했습니다. 분해는 0.1M NH4HCO3 pH7.9에서 37도에서 밤새 1:50(w/w)의 효소/기질 비율로 Sequencing Grade Modified Trypsin(Promega Inc, Madison, WI, USA)을 첨가하여 각 샘플에 대해 수행되었습니다. 10% CHSCN이 포함된 완충액. 아침에 트립신의 추가 분취량(1:100 w/w)을 첨가하고 소화를 4시간 동안 계속했습니다. 더욱이, 0.5% Trifluoroacetic acid(TFA) Gigma-Aldrich Inc., St Louis, MO, USA)를 첨가하여 효소 반응을 중단시키고 37도에서 45분 동안 배양하여 RapiGest 산 가수분해를 완료했습니다[108]. 수불혼화성 분해 산물은 13.{37}} rpm에서 10분 동안 원심분리하여 제거했습니다. 마지막으로, 트립신 소화 혼합물을 제조사 프로토콜에 따라 PierceTM C{39}} 스핀 컬럼(Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy)을 사용하여 탈염하고 0.1% 포름산(Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA)에서 0.1ug/μL의 농도로 물(LC-MS Ultra CHROMASOLVTM, Honeywell Riedel-de HaenTM, Muskegon, MI, USA).

4.7.2.액체 크로마토그래피

트립신 소화 혼합물은 트랩-용리 모드로 구성된 나노-액체 크로마토그래피 시스템인 Eksigent nanoLC-Ultra[2]2D System(Eksigent, AB SCIEX Dublin, Dublin, CA, USA의 일부)으로 구성된 플랫폼을 사용하여 분석되었습니다. 고해상도 질량 분석기와 결합됩니다. 간단히 말해서, 샘플(0.8 ug 주입)을 먼저 펩티드 트랩(200 um × 500 um ChromXP C18- CL,3 um,120 A) 3 μL/min의 유속으로 10분 동안 물에 0.1% 포름산을 사용하여 등용매 모드로 작동하는 로딩 펌프로 세척했습니다. 10포트 밸브의 자동 전환은 나노 역상 컬럼(75 um × 15 cm ChromXP C{21}}CL,3 um,120 A)에서 150분 동안 용리액 B의 구배를 통해 포획된 혼합물을 용리했습니다. (용리액 A, 물 중 0.1% 포름산, 용리액 B, 아세토니트릴 중 0.1% 포름산) 300 nL/min의 유속. 심층적으로 기울기는 5-10% Bin 3min,10-40% Bin 130min,40-95% Bin 10분 및 95% B에서 7분 동안 유지되었습니다. 4.7.3.질량분석법

MS/MS 분석은 나노스프레이 이온 소스가 장착된 LTQ-OrbitrapXL 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy)에서 수행되었습니다. 스프레이 모세관 전압은 1.7kV로 설정되었고 이온 전달 모세관 온도는 22{11}}도에서 유지되었습니다. 전체 MS 스펙트럼은 60000(최대 반값에서 전체 너비)의 분해능과 2 spectra/s의 스캔 속도로 양이온 모드에서 400-1600 m/z 범위에 걸쳐 기록되었습니다. 이 단계 다음에 0.5분의 동적 배제를 사용하여 전체 MS 스펙트럼(35% 충돌 에너지에서)에서 선택된 상위 5개 이온에 대해 데이터 종속적인 방식으로 순차적으로 생성된 5개의 저해상도 MS/MS 이벤트가 이어졌습니다. MS/MS 분석. 질량 분석기 스캔 기능 및 고성능 액체 크로마토그래피 용매 구배는 Xcalibur 데이터 시스템 버전 1.4(Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy)에 의해 제어되었습니다.

4.7.4.단백질 데이터 처리 및 데이터 마이닝

생성된 모든 데이터는 Thermo Scientific Proteome Discoverer 소프트웨어 버전 2.1에 포함된 Sequest HT 검색 엔진을 사용하여 검색되었습니다. 실험 MS/MS 스펙트럼은 1월 2일에 다운로드한 Uniprot Homo Sapiens proteome 데이터베이스(74600개 항목)의 in silico 분해에 의해 얻은 이론적인 질량 스펙트럼과 비교하여 트립신 펩티드 서열과 상관관계가 있었습니다. 020 (www.uniprot.org, 3월 1일0 3월 2일021에 액세스). 펩타이드 서열 및 관련 단백질의 식별을 위해 다음 기준이 사용되었습니다: 효소로서의 트립신, 펩타이드당 3개의 누락된 절단, 전구체 이온의 경우 ±50ppm의 질량 허용 오차, 및 단편 이온의 경우 ±0.8Da. 최대 deltaCN 0.05를 고려하여 PSM(Peptide Spectrum Match) 수준 0.01(strict)에서 최종 FDR(False Discovery Rate)을 제공하기 위해 Percolator 노드를 대상-유인 전략과 함께 사용했습니다. 최소 펩타이드 길이가 6개 아미노산이고 rank1인 펩타이드만 고려되었습니다. 단백질 그룹화 및 엄격한 절약 원칙이 적용되었습니다. MS 데이터는 PRIDE [10]파트너 저장소(ftp://massive.ucsd.edu/MSV000087013/, 2021년 3월 10일에 액세스)를 통해 ProteomeXchange 컨소시엄에 기탁되었습니다. SEQUEST 알고리즘에서 얻은 48개의 단백질을 정렬하고 정규화했습니다. , 라벨이 없는 비교. 사내 알고리즘, 즉 다차원 알고리즘 단백질 지도(MAProMa)가 이 목적을 위해 사용되었으며, 단백질에 대해 확인된 모든 스펙트럼의 평균에 해당하는 평균 펩타이드 스펙트럼 일치(aPSM)[111,112]를 사용하여 결과적으로 , 각각의 분석된 조건에서 상대적으로 풍부합니다. 심층적으로, 차등적으로 발현된 단백질을 선택하기 위해, 하위 그룹(태아 대 주산기-hAFS-CM 및 hAFS-EV 모두에 대해, 저산소 세포 사전 조절 자극도 고려)을 두 MAProMa에 0.4 및 5의 임계값을 적용하여 쌍으로 비교했습니다. 지수는 각각 DAve(미분 평균) 및 DCI(미분 신뢰도 지수)입니다. 단백질 발현의 변화를 평가하는 DAve를 (XY)/(X+Y)/0.5로 정의하였고, 차등 발현의 신뢰도를 평가하는 DCI를 (X + Y)×(XY)/2로 정의하였다. 용어는 두 개의 비교 샘플에서 주어진 단백질의 PSM을 나타냅니다. 또한 각 검사 조건에서 얻은 평균 단백질 목록을 선형 판별 분석(LDA)하고 F 비율이 가장 크거나 같거나( 4.5 이상) p-값이 가장 작은( 작거나 같은 단백질) 0.001) JMP 15.2 소프트웨어를 사용하여 Ward의 방법과 Euclidean의 거리 측정법을 적용한 계층적 클러스터링에 의해 유지 및 처리되었습니다. 구체적으로, F 비는 모델 평균 제곱을 오차 평균 제곱으로 나눈 값을 나타내는 반면, p-값은 실제로 모집단 평균 간에 차이가 없는 경우 계산된 것보다 큰 F 값을 얻을 확률을 나타냅니다. 4.8. hAFS-CM 및 have-EV의 사이토카인 및 케모카인 프로파일링

저산소 전처리 후 f-hAFS 및 p-hAFS에 의해 얻은 hAFS-CM 및 have-EV의 사이토카인 및 케모카인 프로파일링은 Proteome ProfilerTM Human XL Cytokine Array 키트(R&D System, Minneapolis, MN, USA)에 따라 평가되었습니다. 제조업체의 지침. 20ug의 hAFS-CM 및 hAFS-EV 샘플이 사용되었습니다. Chemidoc Mini HD9 Auto(Uvitec Cambridge, UK)로 막 이미지를 획득했습니다. ImageJ 소프트웨어(https: //imagej.nih.gov/ij/, 2021년 3월 10일에 액세스 [13]). 4.9.hAFS-EV 및 다음에서 RNA 추출

세대 시퀀싱

RNA는 제조업체의 지침에 따라 miRNeasy Micro Kit(Qiagen, Milan, Italy)를 사용하여 f-hAFS-EV 및 p-have-EV에서 분리되었습니다. 6 ~ 150개 뉴클레오티드(nt) 범위의 small RNA 함량을 평가하기 위해 small noncoding RNA 칩이 포함된 Agilent Small RNA Kit를 사용하여 RNA 무결성 및 크기 분포를 평가했습니다. Qubit microRNA Assay Kit(Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 microRNA(miRNA) 함량을 정량화했습니다. 18.5ng의 분리된 miRNA를 입력으로 사용하고 제조업체의 지침에 따라 QIAseq miRNA 라이브러리 키트(Qiagen, Milan, Italy)를 사용하여 miRNA 시퀀싱 라이브러리를 준비하고 증폭했습니다. Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTape를 사용하여 TapeStation(Agilent Technologies, Foster City, CA, USA)에 의한 품질 검사 및 정량화 후 라이브러리를 풀링했습니다. 풀링된 라이브러리는 "Sequencing Library qPCR Quantification" Guide(Illumina Inc, San Diego, CA, USA)에 따라 실시간 qPCR로 품질 관리를 평가하고 High Output Hit v2.5(75주기)를 사용하여 Illumina NextSeq 플랫폼에서 시퀀싱했습니다. Illumina Inc, San Diego, CA, USA). 기본 호출은 기본 Illumina NextSeq500 워크플로로 수행되었습니다.

4.10. miRNA 시퀀싱의 생물정보학 데이터 분석

Fastq 파일은 Cutadapt[114]를 사용하여 3' 어댑터와 저품질 베이스를 잘라내어 먼저 처리했습니다. 트리밍 후 삽입 서열과 UMI 서열이 확인되었습니다. 어댑터 서열이 없는 읽기, 16bp 미만의 삽입 서열이 있는 읽기 및 10bp 미만의 UMI 서열이 있는 읽기는 폐기되었습니다. 삽입 서열에 주석을 달기 위해 Bowtie를 사용하여 판독값을 GRCh38 인간 게놈 어셈블리에 정렬했습니다. 2차 분석은 합리적인 요청에 따라 사용할 수 있는 사용자 지정 R 스크립트로 수행되었습니다. Limma[116] 및 EdgeR Bioconductor 패키지[117]를 사용하여 차등 농축 분석을 수행했습니다.

4.11. 통계 분석

결과는 최소 3개(n{0}})개의 독립적인 실험의 평균 ±sem으로 표시됩니다. 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 이어 사후 Tukey의 다중 비교 검정 또는 스튜던트 t-검정에 의해 비교가 이루어졌습니다. 분석은 Graph-Pad Prism 버전 8.0.2(GraphPad Software, https://www.graphpad.com, 2021년 3월 10일 액세스)를 사용하여 수행되었으며 통계적 유의성은 * p로 설정되었습니다.<0.05. for="" proteomics="" analysis,="" the="" distribution="" of="" proteins="" in="" the="" examined="" conditions,="" functional="" enrichment="" analysis,="" and="" comparison="" of="" data="" versus="" the="" vesiclepedia="" database="" (http:/microvesicles.org,="" accessed="" on="" 10="" march="" 2021)="" were="" achieved="" using="" funrich="" (version="" 3.1.3,http://www.funrich.org,accessed="" on="" 10="" march="" 2021[54]),="" that="" uses="" hypergeometric="" test="" and="" bonferroni="" for="" statistics="" and="" allows="" the="" graphical="" visualization="" of="" data="" with="" venn="" and="" bar="" charts="" [118].="" 5.="">

결론적으로, 태아 및 주산기 hAFS는 크기 및 분포에서 유사한 분비 효능 및 EV 농축과 표현형적으로 동등하다는 것이 발견되었습니다. 그러나 그들의 secretome 프로필에서 몇 가지 차이점을 이해할 수 있습니다. 특히, 태아 hAFS의 발달 미성숙 프로파일은 보다 현저한 전-혈관형성, 친-재생 및 젊어지게 하는 secretome이 부여된 secretome 제형에 의해 요약될 수 있습니다. 그러나, 주산기 hAFS는 태아 hAFS와 유사한 내피 세포 이동, 면역 조절, 항염증 및 신경영양 잠재력과 관련된 인자의 발현을 통해 관련 주변분비 프로필을 여전히 유지합니다. 이러한 발견은 부상 관련 및 염증/허혈 기반 질병의 미래 측분비 요법을 지원하는 유용한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 따라서 태아 또는 주산기 hAFS를 가장 이상적인 세포 공급원으로 선택하는 것은 특정 임상 시나리오를 고려하여 평가되어야 합니다.

이 기사는 Int에서 발췌했습니다. J. 몰. 과학. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms