G 단백질 결합 수용체 17에 의해 유도된 포도당 및 지질 대사의 재배선

3. 결과

3.1. 차별화된 OPC의 GPR17 침묵은 지질 및 포도당 대사와 관련된 유전자의 발현을 크게 변경했습니다.

OL 분화 동안 GPR17 발현에 의해 크게 영향을 받는 생물학적 과정을 강조하기 위해, 우리는 쥐 GPR17에 특정한 SMART-pool siRNA로 쥐 OPC를 형질 감염시켜 그 발현을 방해했습니다. qRT-PCR로 성공적인 GPR17 녹다운을 검증한 후(그림 S1), 우리는 GPR17- 침묵 대 대조군 OPC에서 30,584개의 쥐 전사체에 대한 마이크로어레이 분석을 수행하고 다양한 생물정보학 도구로 차별적으로 발현된 유전자(DEG)를 분석했습니다. 먼저 Meta-Core에서 640 DEG를 연구하여 경로 농축 분석을 수행하고 크게 영향을 받을 것으로 예상되는 프로세스를 식별했습니다. 이 분석은 GPR17 기능[37]과 관련이 있는 것으로 이미 밝혀진 mTOR 신호의 변경과 "세포골격 리모델링" 그리고"지질 대사 조절" (1 번 테이블).

...을 더한

뼈 성장을 위한 Cistanche를 알고 싶으면 여기를 클릭하십시오

표 1. 소프트웨어 MetaCore는 GPR17 침묵 후 DEG에 대한 경로 강화 분석을 수행하는 데 사용되었습니다. 표는 분석 결과 가장 중요한 경로, 관련 유전자 수 및 데이터 세트에 포함된 공통 유전자 수를 보여줍니다.

그런 다음 IPA(Ingenuity pathway analysis) 도구를 사용하여 쿼리 데이터 세트와 비교하여 상당한 유사점과 차이점이 있는 선별된 IPA 데이터 세트를 자동으로 식별하는 분석 일치를 수행했습니다. 이 분석은 GPR17 발현과 지질 대사 사이의 예측된 연결을 강화하여 데이터 세트(표 S1)에서 38개 유전자의 발현 변화가 변경된 지방산 합성과 관련되어 있음을 보여줍니다(그림 1). 이 중 GPR17 침묵은 LXR(간 X 수용체 알파, 그림 2의 NR1H3 및 표 S1, 옥시스테롤에 반응하는 핵 수용체) 및 SREBP1(스테롤 조절 요소 결합 단백질 1, 그림 1 및 표 S1의 SREBF1)의 상향 조절을 유도했습니다. 지방산과 콜레스테롤 합성의 핵심 선수. 데이터 세트에서 우리는 또한 PDH(피루베이트 탈수소효소), Ldha(젖산 탈수소효소 알파) 및 Pdk1(피루베이트 탈수소효소 키나아제 1)을 포함한 몇 가지 변경된 유전자가 포도당 대사 및 크렙스 주기와 관련되어 있음을 관찰했습니다. 이러한 대사 과정을 조절하는 GPR17 수용체. 이에 따르면, DEG에 대한 유전자 온톨로지 기반 농축 분석(ToppGene 제품군)은 "모노카복실산 대사 과정"(GO:{{20}}032787, p- 값: 0.02), "신경계 발달 조절"(GO:0051960, p-값: 0.033) 및 "스핑고지질 대사 과정"(GO:0006665, p-값)과 같은 CNS 발달 및 세포 대사와 관련된 다른 과정을 뛰어넘음 : 0.043) (그림 2; 표 S2의 전체 목록).

전 세계적으로 이러한 변화는 GPR17 침묵이 지질 및 포도당 항상성의 전사 조절과 관련된 여러 유전자를 조정하고 미엘린 생성을 위해 콜레스테롤과 지질을 활용함으로써 세포를 수초화하는 트리거 역할을 할 수 있음을 시사합니다.

그림 1. 독창성 경로 분석 도구(IPA, Qiagen)를 사용하여 데이터 세트를 분석하고 데이터 세트에서 차별적으로 발현된 유전자의 패턴을 기반으로 증가 또는 감소할 것으로 예측되는 질병 및 생물학적 과정을 탐색했습니다. 이 분석에서 우리는 데이터 세트에서 차별적으로 표현된 지질 합성과 관련된 유전자를 포함하는 그림의 계획을 외삽했습니다(p-값=9.67 × 10-4 ). 상대 배수 변화(log2 비율)와 함께 이들 유전자의 전체 이름이 표 S1에 보고되어 있습니다. 빨간색은 상향 조절된 유전자입니다. 녹색, 하향 조절된 유전자

그림 2. Toppgene 제품군은 DEG에 대한 GO 기반 농축 분석에 사용되었습니다. 그림은 GPR17 침묵에 의해 잠재적으로 변경된 중추 신경계 및 세포 대사와 관련된 중요한 생물학적 과정 중 일부를 보여줍니다. 파란색 막대는 각 용어와 관련된 총 유전자를 나타냅니다. 빨간색 막대는 각 용어에 대한 데이터 세트와 공통된 유전자를 나타냅니다. 이 분석 및 상대적인 p-값으로 인한 생물학적 프로세스의 전체 목록은 표 S2에 보고됩니다.

3.2. 체외 OPC 분화 중 대사 분석

GPR17 발현과 특정 대사 경로의 활성화 사이의 상관관계를 평가하기 위해 생리학적 성숙 동안 배양된 OPC의 대사체 분석을 수행했습니다. OPC는 분화 배지에서 유지된 후 OL 성숙의 다양한 단계에 해당하는 4개의 다른 시점(0 후, 분화 1일, 3일 및 5일, DID)에서 용해되었습니다. 동시에, 모든 실험에서 성숙이 예상되는 타이밍으로 발생했는지 평가하기 위해 OPC를 배양하고 GPR17 및 MBP에 대해 염색했습니다. 결과는 GPR17- 발현 세포의 수가 3 DID에서 최대에 도달한 다음 5 DID에서 기저 수준으로 돌아온 반면, MBP 양성 세포의 수는 성숙 동안 점진적으로 증가했음을 보여주었습니다(그림 3a). 이전 결과 [37]. OPC 대사체 평가는 이전에 기술된 [38] 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)에 의해 수행되었으며, 당분해, 오탄당 인산 경로, 크렙스 회로, 지방산 산화, 이들의 보조 인자에 관련된 에너지 대사 산물에 초점을 맞춥니다. NADH, NAD 플러스, NADPH, NADP 플러스, ATP, ADP, AMP, 아미노산 및 일부 유도체. 분석된 4개 시점의 대사 프로필은 그림 3b에 보고되어 있습니다. 0일에 크렙스 주기에 속하거나 연결된 여러 대사물질(예: 석시네이트, 말산염, 알파-케토글루타레이트, 글루타메이트, 아스파르테이트, 알라닌 및 프롤린)의 수준이 더 높았습니다. 고도로 증식하는 상태에서(그림 3c). 중간 단계(DID 1에서 3까지)에서 OPC는 지방산 및 콜레스테롤 합성과 관련된 분자의 현저한 상향 조절을 보여주었습니다. 따라서 우리는 콜레스테롤과 지방산의 전구체를 나타내는 아세틸-CoA(그림 3c)와 지방산 합성의 특정 중간체인 말로닐-CoA의 수준이 증가하는 것을 관찰했습니다. DID 5에서 우리는 유리 세포 내 포도당의 상당한 증가와 병행하여 여러 아실 카르니틴 및 아미노산의 증가된 수준을 관찰했습니다(그림 3c). 또한 0일부터 DID 5까지 AMP 및 ADP 수준이 감소하고 DID 1과 DID 3 사이에 ATP가 일시적으로 증가하는 것을 관찰했습니다. 이 데이터는 0일부터 DID 3까지 다음을 나타냅니다. GPR17이 최대 발현에 도달하는 시간적 창에서 OPC는 주로 포도당과 아미노산을 사용하여 콜레스테롤과 지방산 생합성을 유지했습니다. DID 5에서 증가된 아실-카르니틴 수준으로 강조된 바와 같이 OPC는 지방산 이용에 의존할 가능성이 높습니다. 함께, 이 데이터는 생리적 분화 동안 OPC가 성숙한 수초화 OL이 되도록 에너지 대사를 점진적으로 재연결한다는 것을 나타냅니다.

3.3. 체외 OPC 성숙 동안 GPR17 침묵 후 대사체 분석

세포 분화 동안 발생하는 에너지 대사 변화를 유도하는 GPR17 수용체의 기여도를 밝히기 위해 스크램블된 RNA를 수신하는 대조군 OPC와 비교하여 GPR17- 침묵 OPC에서 대사체학을 수행했습니다. 우리는 먼저 GPR17 및 MBP에 대한 면역 형광 염색에 의한 OPC 성숙에 대한 GPR17 침묵의 영향을 조사했습니다. 예상대로 수용체 침묵 후 GPR17 염색의 감소를 발견했으며 3 DID에서 명확하게 볼 수 있습니다. 우리는 또한 3 DID(표시되지 않음)와 5 DID(그림 S2) 모두에서 성숙한 MBP 양성 OL의 수가 현저하게 증가하는 것을 관찰했습니다. 동시에, 자세한 qPCR 분석은 5개의 시점(0, 분화의 1, 2, 3 및 5일, DID)에서 수행되었으며, 제어 OPC에서 1 DID 후 GPR17 발현의 강력한 증가를 나타냅니다. 2 DID 이후부터 상당한 수준에 도달하고 MBP 발현이 최대 5 DID까지 점진적으로 증가하고 초기 마커 NG2가 크게 감소합니다(그림 4a). 반대로, GPR17 사일런싱 후(그림 4b), GPR17 mRNA는 DID1에서 더 낮은 수준에 도달한 다음 안정적으로 낮게 유지되었으며 MBP 발현은 더 증가하고 NG2는 더 감소했습니다. 각 시점에서 제어 OPC와 GPR17- 침묵의 NG2 및 MBP 발현을 직접 비교한 ​​것이 그림 4c에 나와 있습니다. 종합하면, 이러한 결과는 이러한 실험 조건에서 OPC의 GPR17 침묵이 분화 과정을 가속화했음을 시사합니다. 그 다음, 5개의 선택된 시점에서 LC-MS/MS에 의해 OPC 대사체학을 수행하였다. 각 시점에서 GPR17-silenced 및 control OPCs에서 얻은 대사 데이터를 비교하여 GPR17 silencing에 의해 상당한 영향을 받는 대사체를 식별할 수 있었습니다.

그림 3. (a) 그래프는 분화 동안 GPR17 플러스 및 MBP 플러스 세포의 백분율 변화를 보여줍니다. n 그룹당=3; Tukey 테스트를 사용한 일원 분산 분석. * p < 0.05, ** p < 0.01) (b) 히트맵은 0, 1에서 멈춘 각 단일 샘플의 대사산물 풍부도를 보여줍니다. , 3 또는 5 DID. 분석된 대사산물의 풍부도는 짙은 파란색(매우 낮음)에서 짙은 갈색(매우 높음)까지의 색채 척도로 표시됩니다. n 그룹당=4–5. (c) 조건(분화에서 0, 1, 3 및 5일, DID; 피셔의 LSD 테스트를 사용한 일원 분산 분석) 간에 유의미하게 다른 풍부한 대사 산물.

DID 1(그림 5a)에서는 중요한 변화를 찾지 못했습니다. DID 2(그림 5b)에서 우리는 Krebs 주기의 일부 대사산물(malate, fumarate citrate)의 상당한 증가, 유리 carnitine(CO), acetyl-carnitine(C2), propionyl-carnitine(C3: 0), 부티릴-카르니틴(C4:0), 발레릴-카르니틴(C5:0), 헥사데카노일-카르니틴(C16:0 및 포도당의 현저한 감소 , 젖산염, 크레아틴 및 오르니틴 감소 oilactate 및 creatine과 propionyl-carnitine(C3)의 증가는 DID3에서도 관찰되었습니다(그림 5c). DID 5(그림 5d)에서는 여전히 유리 카르니틴의 증가를 발견했습니다( CO), 아세틸카르니틴(C2), 프로피오닐-카르니틴(C3:0), 부티릴-카르니틴(C4:{{30}}), 발레릴-카르니틴(C5:0 )tetradecanoyl-carnitine(C14:0), hexadecanoyl-carnitine(C16:0), octadecanoyl-carnitineC18:0), octadecenoyl-carnitine(C18:1), 분화된 세포(그림 3 참조), 디히드록시아세톤-3-인산/글리세르알데히드3-인산(DHAP/GAP), 푸마레이트 및 시트레이트의 증가, 아세틸-CoA, Met-SO크레아틴, 타우린 및 카르노신.

그림 4. OPC 성숙에 대한 GPR17 침묵의 효과. GPR17(녹색), NG2blue) 및 MBP(적색)의 발현 수준은 대조군 조건(스크램블 RNA로 형질감염된 세포 및 GPR17 침묵(b) 후)에서 분화 동안 실시간 PCR에 의해 평가되었고, T{{ 6}}(0로 설정). 각 시점당 n=6. Tukey의 다중 비교 테스트를 사용한 일원 분산 분석(a): ** p < {{10} }.001 대 DID 0-2-3-5, @ p < 0.05 대 DID 3-5; ## p < 0.01 대 일 0, SSS p < {{30}}.001 대 DID{ {21}}; (b): *** p < 0.001 대 DID 0-2-3-5, @@@ p < 0 .001 대 일 0, # p < 0.05, ### p < 0.001 대 일 0.S p < 0.05, SS p < 0.01, SSS p < 0.001 V. DID 5. (C) 각 시점에서 GPR17-silenced OPCs vs. control OPCs(0으로 설정)의 NG2 및 MBP 표현. Fold change(FC)는 LOG,(FC)로 보고되었습니다. 하나의 샘플 t-테스트, * p < 0.05, * p < 0.01, *** p < 0.001 대 제어 OPC의 상대 DID.

그림 5. OPC에서 GPR17 침묵에 의해 유도된 대사 변화. ( a – d ) GPR17 침묵 후 각 대사 산물의 양은 상대 대조군 샘플의 양으로 정규화되었습니다. 결과 배수 변화는 각 시점(분화에서 1, 2, 3, 5일)에 대한 화산 플롯을 생성하는 데 사용되었습니다. 점선 수평선 위의 점은 통계적으로 유의미한 변화를 보인 대사산물을 나타냅니다(FDR에 의해 수정된 Fisher의 LSD; p.adj < 0.1). 녹색은 GPR17 침묵 후 발현이 낮은 대사 산물, 빨간색은 발현이 높은 대사 산물입니다. n 각 그룹당=7–9. DID: 차별화된 일수.

3.4. GPR17은 OPC 성숙 중 젖산 방출을 조절합니다.

위에서 설명한 대사체학 결과를 기반으로 GPR17 침묵이 세포 내 젖산 수준을 감소시키는 것으로 밝혀졌습니다. 이 감소가 젖산 대사의 일반적인 감소 또는 이 대사 산물의 증가된 방출을 반영하는지 평가하기 위해 우리는 다른 시점에서 세포 용해물 및 해당 배지에서 그 수준을 측정했습니다. 그림 6에서 볼 수 있듯이 대조군 조건에서 세포 내 젖산염은 DID 2(그림 6a)(GPR17 수용체 발현도 최대일 때)에서 가장 풍부하게 도달한 다음 세포가 성숙되면 감소합니다. 대신, GPR17 침묵 후, 세포내 젖산의 상승이 폐지되었고, 그 수준은 분화를 향해 더욱 감소했습니다. 실제로, 각 시점에서 GPR17-침묵 OPC와 대조군 OPC의 젖산 수준을 비교한 결과 DID 2와 3에서의 젖산 수준 감소가 강조되었습니다(그림 6b). 세포외 젖산염은 다른 동역학을 따랐고, 대조군 조건에서 DID 2-3-5에서 DID 1에 비해 상당한 감소를 보인 반면, GPR17- 침묵 OPC에서는 안정적으로 더 높게 유지된 다음 DID 5에서 상당히 감소했습니다(그림 6c ). 그러나 두 실험 조건 사이의 다른 시점에서 젖산 수준을 비교할 때 GPR17 침묵은 생리적 감소를 방해했습니다.젖산 존재 증가DID 2 및 3의 매체에서(그림 6d),방출 증가를 암시.

그림 6. OPC의 GPR17 침묵은 젖산 대사를 변화시킵니다. (a) 제어 조건(녹색 선) 및 GPR17 침묵(주황색 선) 후 OPC 성숙 중 젖산 풍부. n 그룹당=7–9. Tukey의 다중 비교 테스트를 사용한 일원 분산 분석. * p < 0.05, ** p < 0.01 대 DID2 CTL; §§ p < 0.01, §§§ p < {{30}}.001 대 DID1 siGPR17(b ) 각 시점(n=7–9)에서 GPR17 사일런싱 후 젖산염 수준을 대조군 샘플(1로 설정)에 대해 정규화했습니다. ** p < 0.01; 하나의 샘플 t-테스트. GPR17-침묵 및 대조군 OPC의 조정 배지는 대사체학 분석에 사용된 것과 동일한 배양에서 수집되었습니다. 배지의 젖산염 수준은 LC-MS/MS로 평가했습니다. ( c ) 제어 조건 (녹색 선) 및 GPR17 침묵 (주황색 선) 후 OPC 성숙 동안 세포 외 공간의 젖산 풍부. Tukey의 다중 비교 테스트를 사용한 일원 분산 분석. ** p < 0.01, *** p < 0.001 대 DID1 CTL; § p < 0.05 대 DID5 siGPR17. (d) 각 시점에서 GPR17 사일런싱 후 세포외 젖산염 수준을 대조군 샘플(1로 설정)에 대해 정규화했습니다. * p < 0.05; ** p < 0.01; 하나의 샘플 t-테스트. 대조군(e,g) 및 GPR17-침묵(f,h) OPC에서 MCT1 억제 효과는 억제제 처리된 샘플 대 상대 대조군(비히클 처리된)에서 MBP의 발현을 분석하여 평가되었습니다. , 분화 3일 및 5일에. n 그룹당=6.

하는 메커니즘 중 하나OPC는 젖산염을 방출할 수 있습니다.모노카르복실레이트 운반체 MCT1을 통합니다. 더욱이, 최근 연구에 따르면 OPC 자체가 세포 주기 및 분화를 촉진하는 MCT 수용체를 통해 세포외 젖산염을 획득할 수 있다고 보고되었습니다[39]. 따라서, 우리는 GPR17 사일런싱에 의해 유도된 증가된 젖산염 방출이 MCT1에 의해 매개될 수 있는지 그리고 이것이 동일한 조건에서 OPC 성숙에 대해 관찰된 효과에 부분적으로 책임이 있는지 여부를 궁금해했습니다(그림 4). 이를 위해 정상적인 분화 동안과 GPR17 침묵 후 MCT1의 선택적 억제제 인 AR-C155858로 OPC를 처리했습니다. 예상대로 젖산 방출은 두 조건 모두에서 성공적으로 억제되었습니다(그림 S3). 상이한 실험 조건에서 OPC 성숙에 대한 MCT1 억제의 효과는 MBP의 발현 수준을 분석함으로써 평가되었다. 통계적 유의성(p=0.07)에 가까운 MBP 유전자 발현의 약간의 감소는 GPR17에 대한 특정 siRNA로 형질감염된 샘플에서만 발견되었습니다(그림 6e–h). 그러나 대조군 RNA(siNEG)로 형질감염된 샘플에서는 유의한 변화가 나타나지 않았습니다. 이러한 결과는 GPR17 하향 조절에 의해 매개되는 세포 외 젖산염의 증가가 OPC의 성숙을 촉진한다는 것을 시사합니다. 그러나 MBP 감소의 작은 범위는 이 대사 산물이 프로세스에 관련된 유일한 요인이 아님을 나타냅니다.

3.5. OPC 성숙 동안 GPR17 침묵 후 지질 분석

GPR17 silencing 후 transcriptomic 분석 결과는 또한 그 기능과 미엘린의 주요 구성 요소인 지질과 콜레스테롤의 합성 경로 사이의 잠재적 연결을 강조했습니다. 지질 대사에서 GPR17의 역할을 추가로 조사하기 위해 0일과 비교하여 분화에서 2, 3 및 5일 후에 GPR17-침묵 OPC의 지질 분석에 LC-MS/MS를 적용했습니다. 분석된 지질 목록, 상대 배수 변화 및 p-값이 표 S4에 보고되어 있습니다. 실험 그룹에서 가장 풍부한 두 가지 지질 클래스는 지방산과 디아실-포스파티딜콜린(PCaa) 계열이었습니다. 대조군 OPC의 분화 동안, 우리는 지질 종류의 풍부함에서 어떤 중요한 변화도 발견하지 못했습니다. 대신, GPR17-침묵형 OPC는 특히 DID 3 및 5에서 대조군 OPC에 비해 자유 지방산, 세라마이드, 아실-알킬-포스파티딜콜린(PCae) 및 포스파티딜이노시톨(PI)의 풍부함이 변경된 경향을 보였습니다. 그러나 디아실-포스파티딜에탄올아민(PEaa)과 스핑고미엘린(SM)만이 통계적으로 유의한 변화를 보였습니다(그림 7).

그림 7. OPC 분화 동안 GPR17 침묵에 의해 유도된 지질 등급 풍부도의 변화. 서로 다른 시점에서 대조군 조건에서 각 지질 등급의 풍부도가 보고됩니다. (e) LysoPE(리소포스파티딜에탄올아민), (f) PCaa(디아실-포스파티딜-콜린), (g) PCae(아실-알킬-포스파티딜-콜린), (h) PEaa(디아실포스파티딜-에탄올아민), (i) PEae (acyl-alkyl-phosphatidyl-ethanolamines), (i) PI(phosphatidylinositols), (k) PS(phosphatidyl-serines), (D SM(sphingomyelins). n=5 for each group. 동역학: 양방향 ANOVA 후 Tukey의 다중 비교 테스트 siGPR17: 양방향 ANOVA 후 Sidak의 다중 비교 테스트 * p.adi < 0.05, ** p.adi < 0.01.

각 시점에서 GPR17-침묵 및 대조군에서 얻은 지질 데이터를 비교하여 GPR17 침묵에 크게 영향을 받는 지질을 식별할 수 있었습니다. 2 DID 이후에는 유의미한 변화가 발견되지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음). 3 DID 후, diacylphosphatidylcholine(PCaa) C40:4는 덜 풍부했고 diacyl-phosphatidylethanolaminePEaa) C34:3은 GPR17- 침묵 OPC에서 더 풍부했습니다(그림 8a). 분화 5일 후, GPR17 사일런싱은 몇 가지 디아실-PC 및 디아실-PE의 감소와 스핑고미엘린(SM) C18:1 및 SM과 함께 여러 플라스마로겐(아실 알킬-PC)의 부수적인 증가와 같은 지질 풍부의 몇 가지 변화를 가져왔습니다. (OH) C16:1(그림 ​​8b). 이러한 데이터는 GPR17의 하향 조절이 미엘린의 주성분인 PC 및 PE의 지질 프로필을 변경함을 나타냅니다.

그림 8.OPC에서 GPR17 침묵에 의해 유도된 지질 변화. ( a, b ) GPR17 침묵 후 각 지질의 양은 상대 대조군 샘플의 양으로 정규화되었습니다. 결과 배수 변화를 사용하여 각 시점(분화 3, 5일)에 대한 화산 플롯을 생성했습니다. 점선 수평선 위의 점은 통계적으로 유의미한 변화를 보인 대사산물을 나타냅니다(FDR에 의해 수정된 Fisher의 LSD; p.adj < 0.1). 녹색은 발현이 낮은 지질, 빨간색은 GPR17 침묵 후 발현이 높은 지질입니다. n 그룹당=5.

더 요청:

이메일:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: 86 15292862950 추가

가게:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop