G 단백질 결합 수용체 17 침묵에 의해 유도된 포도당 및 지질 대사의 재배선은 희소돌기아교세포 전구체를 수초화 세포로 전환할 수 있게 합니다
Jul 20, 2023
추상적인:성숙한 중추 신경계(CNS)에서 희소돌기아교세포(OL)는 수초 생산 덕분에 축삭에 대한 지지와 절연을 제공합니다. 수초화 세포로의 성숙 동안, OL지질에 대한 에너지 및 빌딩 블록이 필요합니다., 이는 엄청난 투자를 의미합니다.에너지 연료그리고탄소의 분자 소스. oligodendroglial G protein-coupled receptor 17 (GPR17)은 OL 성숙의 핵심 요소로 부상했습니다. pre-OL에서 최대 발현에 도달하지만 최종 성숙을 허용하기 위해 내면화되어야 합니다. 본 연구에서는 생리학적 GPR17의 역할을 규명하는 것을 목표로 한다.OL 대사의 하향 조절transcriptomics, metabolomics 및 lipidomics를 적용하여 OL을 차별화합니다. GPR17 침묵 후 성숙한 OL 마커의 상당한 증가와포도당 대사그리고지질 생합성. 우리는 또한 증가 관찰젖산염의 방출, 이는 부분적으로 책임이 있습니다.성숙 부스트의해 유발GPR17 하향 조절. 동시에, GPR17 고갈은 또한 특정 미엘린의 동역학을 변화시켰습니다.지질 종류. 전 세계적으로 이 연구는GPR17 발현, 젖산 방출그리고미엘린 구성, 그리고 GPR17을 표적으로 하는 혁신적인 개입이 탈수초성 질환에서 내인성 수초화를 촉진하는 데 도움이 될 수 있음을 시사합니다.
관련 CISTANCHE를 얻으려면 여기를 클릭하십시오.내인성 수초 형성 촉진
키워드:희소돌기아교세포 전구세포; 희소돌기아교세포;에너지 대사; 해당작용; 젖산염; 미엘린 지질; 트랜스크립토믹스;대사체학; 지질체학; 수초화
1. 소개
중추신경계(CNS)에서 희소돌기아교세포(OLs)는 축삭 기능을 보존하고 빠른 신경 전도를 가능하게 하는 예외적으로 높은 지질 함량을 특징으로 하는 절연 구조인 미엘린의 생산을 담당하는 세포입니다[1]. 이러한 특화된 기능은 희소돌기아교 전구세포(oligodendrocyte precursor cell, OPC)가 긴밀하게 조율된 분화 프로그램을 거치도록 요구하며, 그 동안 OPC는 점진적으로 신진대사를 변경하고 전형적인 미엘린 지질을 합성하여 원형질막의 구성을 수정합니다[2]. 하나의 OL은 분절당 최대 150개의 압축된 미엘린 막으로 최대 50개의 축삭을 수초화할 수 있으므로 상당한 에너지 요구가 필요합니다[3]. 시험관 내 연구는 해당작용 대 산화적 인산화의 비율이 OL 분화 단계에 의존한다는 것을 보여주었고[4,5], 새로 생성된 OL/후기 OPC가 복합 I 억제에 가장 취약하다고 제안했습니다[6]. 최적의 조건에서 배양된 출생 후의 OPC와 OL은 ATP 합성을 위해 산화적 인산화에 의존하는 반면 성인 OL은 우선적으로 해당과정을 사용합니다[7]. 흥미롭게도, 저혈당 환경에서 OL 발달 및 수초화는 케톤체 및 젖산염과 같은 모노카르복실레이트에 의해 지원될 수 있으며, 세포 내/외부로 이동하려면 모노카르복실레이트 수송체(MCT)가 필요합니다. Ichihara와 동료들은 젖산이 저혈당 조건에서 OPC 순환과 분화를 구출할 수 있고 이 효과가 젖산 수송체 억제제에 의해 억제됨을 보여주었고, 이는 젖산 가용성이 OL이 산화적 인산화와 미엘린 지질 합성을 지속할 수 있음을 시사합니다. . 콜레스테롤, 인지질 및 글리코스핑고지질을 포함하여 다양한 종류의 지질이 OL 및 미엘린 막에 존재합니다. 수초에 고유하게 존재하는 지질 종은 없지만 분화 동안 OL 막에서 여러 지질 종의 비율의 일관된 변화가 설명되었습니다 [8].
OL은 또한 신경 대사에서 능동적이고 역동적인 역할을 합니다[9]. 그들은 혈류에서 오는 포도당을 흡수하고 해당과정을 수행하여 피루브산과 젖산을 생성한 다음 MCT를 통해 축삭 구획으로 전달되어 미토콘드리아 호흡과 ATP 생성을 가능하게 합니다[10].
분화하는 동안 OPC는 특정 수용체와의 상호 작용을 통해 기능을 동적으로 조절하는 외인성 요인의 영향을 받습니다[11]. 이 중 G 단백질 결합 수용체 17(GPR17)은 다발성 경화증(MS)에서 유망한 재수초화 표적으로 부상했습니다. GPR17은 미성숙 O4 마커를 발현하는 중간 분화 단계에서 pre-OL에서 최대 수준에 도달하는 OPC에서 일시적으로 발현되는 수용체입니다. 시기적절하고 생리적인 OPC 성숙을 위해서는 일시적인 표현이 필요합니다. 실제로 O4-양성 단계 이후에 이 수용체는 점진적으로 하향 조절되어 말단 성숙 및 수초화를 허용해야 합니다[12,13]. 이 시기 적절하고 생리적인 표현에 대한 모든 간섭은 기능 장애를 초래하고 결국 수초화 실패를 초래합니다. GPR17의 과발현은 뇌 허혈[14], 큐프리존 및 리소레시틴 유도 탈수초[15,16], 알츠하이머 유사 상태[17], 근위축성 측삭 경화증[18] 및 실험적 자가면역과 같은 여러 질병 모델에서 설명되었습니다. 뇌척수염(EAE)[15,19]. 현저한 GPR17 상향 조절 및/또는 탈수초 병변의 경계에서 GPR17- 발현 세포의 축적이 MS[19,20], 외상성 뇌 손상[21] 및 선천성 백질뇌병증[22]의 영향을 받는 환자에서도 관찰되었습니다. 강력한 염증 유발 조건이 존재하는 경우, GPR17- 발현 세포는 병변 부위에 축적되어 중간 단계에 머물러 재수초화에 기여할 수 없습니다. 이는 수용체 하향 조절의 조절 장애가 재수초화 실패 및 질병에 기여함을 시사합니다. 진행. 이러한 데이터에도 불구하고 GPR17의 하향 조절에 따른 분자 현상은 완전히 밝혀지지 않았습니다. 중요한 것은 대사 기능 장애가 MS[24–26]를 포함한 다양한 신경퇴행성 장애[23]의 진행 메커니즘에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각됩니다. MS에서 대사 기능 장애의 존재는 생체 에너지 대사 산물의 역할과 OL 기능을 조절하는 관련 메커니즘을 더 잘 이해할 필요가 있습니다. 이러한 고려 사항을 바탕으로 본 연구에서는 GPR17 변조가 전사, 대사 산물 및 지질 프로파일링을 통해 분화하는 동안 OL 생체 에너지에 직접 영향을 미치는지 여부와 그 방법을 이해하는 것을 목표로 합니다. Transcriptomic 분석은 차별화된 OPC에서 GPR17 침묵이 성숙한 마커의 발현을 증가시키고 지질 및 포도당 항상성의 전사 조절에 관여하는 여러 유전자의 변화를 유도함을 보여주었습니다. 또한, 우리의 대사체학 분석은 GPR17 하향 조절 후 OL이 신진 대사를 재연결하고 OL 분화 프로그램에 직접적인 영향을 미칠 수 있는 젖산염의 방출을 증가시키는 것으로 나타났습니다. 또한 지질 분석을 통해 GPR17 침묵이 미엘린 특정 지질의 풍부함을 변경한다는 것을 보여주었습니다. 함께 이러한 결과는 분화하는 OL에서 GPR17 하향 조절이 에너지 대사 및 성숙한 수초화 세포로의 분화에 필요한 막 지질 모두의 변화를 유도하고 GPR17 표적화를 이용하여 일반적으로 탈수초성 질환과 관련된 대사 기능 장애를 구제할 수 있음을 시사합니다.
2. 재료 및 방법
2.1. 동물 보호 및 사용에 대한 Animal Care International(유럽법 Dir. 2010/63/UE) 및 국가(이탈리아법 DL n. 26, 2014년 3월 4일) 지침을 따랐습니다. 모든 절차는 이탈리아 보건부(MPA에 5247B.N.L2Y)의 승인을 받았습니다. 임신한 쥐를 Charles River Italia에서 구입하여 섭씨 21도에서 12-h 명/12-h 암주기 하에 식이와 물을 임의로 공급하고 환경을 강화했습니다.
2.2. 쥐 OPC 격리
1차 랫트 OPC는 출생 후 2일(P2) Sprague-Dawley 랫트의 대뇌 피질에서 이전에 기술된 바와 같이 모아서 얻었다[27,28]. OPC를 폴리-D, L-오르니틴 코팅(최종 농도 50μg/mL, Sigma-Aldrich, 이탈리아 밀라노), 대사 분석을 위한 10cm 접시(2–4 × 105 세포/커버슬립), 폴리 D에 도금했습니다. , 면역세포화학용 L-오르니틴 코팅 13-mm 유리 커버슬립(1–2 × 104 세포/커버슬립) 및 폴리-D, L-오르니틴 코팅 6-웰 플레이트(7 × 104 세포/ coverslip) 리피도믹 및 qRT-PCR 분석용. 세포를 2% B27(Life Technologies, Monza, Italy), 2mM L-글루타민, 10ng/mL 인간 혈소판 유래 성장 인자-BB(Sigma-Aldrich, Milan, Italy), 및 3일 동안 증식을 촉진하기 위한 10 ng/mL 인간 기본 섬유아세포 성장 인자(Life Technologies, Monza, Italy).
2.3. siRNA 트랜스펙션
OPC는 증식 배지에서 분화 배지(2% B27(Life Technologies, Monza, Italy), 2mM L-글루타민 및 15nM T3 호르몬이 보충된 신경기저 배지)로 전환한 직후 형질감염되었습니다. 래트 GPR17 전사체(Dharmacon, Lafayette, CO, USA)에 특이적인 On-target plus SMARTpool siRNA를 제조사의 프로토콜에 따라 Lipofectamine RNAiMAX 시약(Life Technologies, Monza, Italy)으로 50 nM의 최종 농도로 형질감염시켰다. 비표적화 RNA 풀의 형질감염을 음성 대조군으로 사용했습니다.
2.4. 전사체 프로파일링 및 마이크로어레이 분석
RNA 추출 및 전사체 분석은 발표된 프로토콜에 따라 수행되었습니다[27]. 간략하게, OPC는 siRNA 트랜스펙션 2일 후에 RLT 완충액(Qiagen, Milan, Italy)으로 용해되었고 총 RNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 RNeasy Micro 키트(Qiagen, Milan, Italy)를 사용하여 추출되었습니다. RNA 품질은 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Milan, Italy)로 평가했습니다. RNA 무결성 번호(RIN) > 7인 RNA를 마이크로어레이 분석에 사용했습니다. 표지된 cRNA는 시아닌 3-CTP의 존재 하에 Low Input Quick-Amp Labeling Kit, 단색(Agilent Technologies, Milan, Italy)을 사용하여 총 RNA 100ng에서 합성되었습니다. 총 RNA는 SurePrint G3 Rat Gene Expression Microarrays(#G4858A-074036, Agilent Technologies, Milan, Italy)에서 혼성화되었습니다. 이 마이크로어레이는 현장에서 합성된 60-mer DNA 프로브로 구성되며 30,584개의 쥐 전사물을 나타냅니다. 혼성화는 회전 오븐(Microarray Facility, Laboratorio per le Tecnologie delle Terapie Avanzate, LTTA, Ferrara, Italy)에서 65°C에서 17시간 동안 수행되었습니다. 제조업체의 절차에 따라 단색 유전자 발현 분석을 수행했습니다. Feature Extraction 10.7.3 소프트웨어(Agilent Technologies, Milan, Italy)를 사용하여 마이크로어레이 원시 데이터를 얻었습니다. ±1.5의 배수 변화 및 FDR-조정된 p-값 < 0.07을 고려하여 두 실험 조건 사이에서 차등적으로 발현된 유전자 목록을 얻었다.
2.5. 생물정보학적 분석
소프트웨어 Metacore™(Clarivate Analytics, London, UK) 및 QIAGEN's Ingenuity® Pathway Analysis(IPA®, QIAGEN Redwood City, www.qiagen.com/ingenuity, 2017년 5월 14일 액세스)를 사용하여 경로 기반 클러스터화를 수행했습니다. 일반적인 생물학적 과정을 식별하기 위해 OPC에서 GPR17 침묵 후 차등적으로 발현된 유전자. ToppGene Suite는 유전자 온톨로지 기반 농축 분석을 수행하는 데 사용되었습니다[29].
2.6. 표적 대사체학 및 지질체학
Metabolomic 데이터는 이전에 설명된 [30,31]과 같이 직렬 질량 분석법(LC-MS/MS)과 결합된 액체 크로마토그래피로 얻었으며 아래에 설명된 일부 수정 사항이 있습니다. ExionLC™ AC 시스템(AB Sciex)과 결합된 API-3500 삼중 사중극자 질량 분석기(AB Sciex, Framingham, MA, USA)를 사용했습니다. 서로 다른 시점의 OPC 세포 및/또는 siRNA로 형질감염된 OPC 세포를 250 µL의 얼음처럼 차가운 메탄올/물/아세토니트릴 55:25:2{{5{{5{{ 66}}}}. 용해물을 4℃에서 15분 동안 15,000×g에서 회전시켰다. 그런 다음 샘플을 40 ◦C에서 N2 펠로우로 건조하고 후속 분석을 위해 125 μL의 얼음처럼 차가운 MeOH/H20/ACN 55:25:20에 재현탁했습니다. 아미노산 정량은 이전 유도체화를 통해 수행하였다. 간단히 말해서, 샘플 125µL 중 25µL를 수집하고 4{{80}} ◦C에서 N2 흐름 하에서 별도로 건조했습니다. 건조된 잔류물을 50 μL의 페닐-이소티오시아네이트(PITC), EtOH, 피리딘 및 물 5%:31.5%:31.5%:31.5%에 재현탁한 다음 에서 20분 동안 배양했습니다. RT, N2 펠로우에서 40 ◦C에서 90분 동안 건조하고 마지막으로 1{{1{{1{{1{{1{{110}}에서 재현탁} 9}}6}}5}}1}}0 MeOH/H2O 50:50 중 5mM 암모늄 아세테이트의 μL. 서로 다른 아미노산의 정량화는 50 ◦C로 유지되는 C18 컬럼(Biocrates, Innsbruck, Austria)을 사용하여 수행되었습니다. 양이온 모드 분석을 위한 이동상은 상 A: 물 중 0.2% 포름산 및 상 B: 아세토니트릴 중 0.2% 포름산이었습니다. 기울기는 T0: 100% A, T5.5: 5% A, T7: 100% A였으며 유속은 500µL/분이었습니다. 에너지 대사물질 및 보조 인자의 정량화는 시아노상 LUNA 컬럼(50mm × 4.6mm, 5µm, Phenomenex)을 사용하여 음이온 모드에서 5.5분 동안 두 번의 개별 실행으로 수행되었습니다. 프로토콜 A; 이동상 A는 물이고 상 B는 MeOH 중 2mM 암모늄 아세테이트였으며 구배는 T0: 80% B 0.5mL/분; T1: 80% B 0.5mL/분; T1.01: 20% B 0.5mL/분; T2.0: 20% B 0.5mL/분; T2.01: 80% B 0.5mL/분; T5.5: 80% B 0.5mL/분. 프로토콜 B; 이동상 A는 물이고 상 B는 MeOH 중 2mM 암모늄 아세테이트였으며 구배는 T0: 50% B 0.5mL/분; T1: 50% B 0.5mL/분; T1.01: 0% B 0.5mL/분; T2.0: 0% B 0.5mL/분; T2.01: 50% B 0.5mL/분; T5.5: 50% B 0.5mL/분. Acyl-carnitines 정량은 50 ºC로 유지되는 C18 컬럼(Biocrates, Innsbruck, Austria)을 사용하여 동일한 샘플에 대해 수행되었습니다. 샘플을 양이온 모드에서 5.5분 동안 분석했습니다. 이동상은 A: H20 중 0.1% 포름산 B: MeOH 중 0.1% 포름산 및 구배는 T0: 30% B, T0.8: 30% A, T2: 100% B, T3: 100% B, T3 .01: 30% B, T5.5: 30% B, 유속 500µL/min.
인지질과 지방산의 수준은 공개된 프로토콜[32,33]에 따라 아래에 설명된 일부 수정 사항에 따라 (LC)-MS/MS를 통해 평가되었습니다. 인지질은 HPLC 시스템(Agilent ) 및 CTC-PAL HTS 오토샘플러(PAL 시스템). 음이온 분석을 위해 cyano-phase LUNA 컬럼(50 mm × 4.6 mm, 5 µm; Phenomenex)을 통해 5분 동안 지질을 분리하였고, 이동상은 MeOH 중 5 mM ammonium acetate였습니다. 양이온화를 위해 XTerra RP18 3.5 µm 4.6mm × 100 mm 컬럼(Waters)에서 8분 동안 분석물을 분리했으며 이동상은 MeOH의 0.1% 포름산이었습니다. H2O/MeOH 97:3에서 10mM 디이소프로필에틸아민 및 15mM 아세트산으로 구성된 이동상을 사용하여 Hypersil Gold C8 컬럼(Life Technologies)에서 음이온 모드로 유리 지방산을 분석했습니다. 설명된 프로토콜에서 분석된 모든 대사산물은 이전에 다른 클래스의 대표자만 검증된 인지질을 제외하고 순수한 표준으로 검증되었습니다. MultiQuant™ 소프트웨어(버전 3.0.3, AB Sciex)는 데이터 분석 및 크로마토그램의 피크 검토에 사용되었습니다. 데이터 처리를 위해 원시 영역은 동일한 샘플의 모든 대사 산물 영역의 중앙값으로 정규화되었습니다. 구체적으로, 우리는 상대 대사체 풍부도(ma N)를 다음과 같이 정의했습니다.
여기서 Xn은 샘플 a, b, 에 대한 대사산물 n의 피크 면적을 나타냅니다. . . , z 및 Man =1 a는 샘플 a, b, 에 대한 대사산물 n의 피크 영역의 중앙값을 나타냅니다. . . , 지. 그런 다음 얻은 데이터를 로그10- 변환으로 변환하고 이분산성을 수정하고 데이터의 왜도를 줄이고 마스크 효과를 줄이기 위해 파레토 스케일링했습니다[34]. 구체적으로, 얻은 값을 log10으로 변환한 후 다음과 같이 Pareto의 방법으로 스케일링했습니다.
여기서 xi는 데이터 매트릭스(i(대사물질), j(샘플))의 변환된 값이고 si는 변환된 대사물질 값의 표준편차입니다[35]. 얻어진 값은 상대적인 대사산물 수준으로 간주되었습니다. 데이터 처리 및 분석은 MetaboAnalyst 5.0 웹 도구 [36]에 의해 수행되었습니다.
2.7. 면역세포화학 및 세포 계수
세포를 4% 수크로스를 함유하는 4% 파라포름알데히드 인산완충액에 고정시켰다. 토끼 항-GPR17(1:100; Cayman Chemical) 및 쥐 항-MBP(1:200; Merck Millipore, Milan, Italy)의 1차 항체가 사용되었습니다. 1차 항체의 배양은 실온에서 2.5시간 동안 또는 4oC에서 하룻밤 동안 수행되었습니다. 그런 다음 세포를 AlexaFluor 488 또는 AlexaFluor 555(1:600; Life Technologies, Monza, Italy)에 접합된 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양했습니다. 모든 항체는 0.3% Triton X-100가 포함된 인산염 완충 차단 용액(pH 7.4)에 희석되었습니다. 핵은 UV 형광 염료 Hoechst 33258(1:10,000; Life Technologies, Monza, Italy)로 표지되었습니다. 그런 다음 커버슬립을 형광 장착 매체(Dako)에 장착했습니다. 선택된 마커에 대한 양성 세포는 각 커버슬립(0.07mm2/Fifield)에 대한 20개의 무작위 필드에서 계산되었습니다. 결과는 100%로 설정된 대조군과 비교하여 정규화된 핵 수의 백분율로 표시되었습니다.
2.8. AR-C155858로 치료
siRNA 형질감염 1일 후(분화 1일), 대조군 및 GPR17-침묵 OPC를 AR-C155858(Tocris, UK; 최종 농도: 1μM) 또는 비히클(0.04%)로 처리했습니다. DMSO). 2일 후(분화 3일), OPC를 후속 RNA 분석을 위해 용해하거나 다시 처리한 다음 분화 5일에 수집했습니다.
2.9. 총 RNA 추출, Retrotranscription 및 qPCR 분석
형질감염 후 1, 2, 3 또는 5일에 세포를 Trizol 시약(Life Technologies, Monza, Italy)으로 용해시켰다. Total RNA는 Direct-zol RNA micro-prep kit(Zymo Research, Germany)를 사용하여 추출하였다. 유전자 발현 분석을 위해 SensiFAST™ cDNA 합성 키트(Bioline, London, UK)를 사용하여 총 RNA 400-800 ng부터 cDNA 합성을 수행했습니다. 모든 유전자의 발현을 SensiFAST™ SYBR Supermix(Bioline, London, UK)로 분석하고 제조업체의 프로토콜에 따라 CFX96 실시간 PCR 시스템(Bio-rad, Milan, Italy)을 사용하여 GAPDH 발현으로 정규화했습니다.
2.10. 통계 분석
데이터는 평균 ± SEM으로 표시되며 GraphPad Prism 8.0.1 소프트웨어로 분석됩니다. 정규 분포를 가진 두 그룹 간의 모든 비교를 위해 양측 unpaired Student t-test가 수행되었습니다. 인간 샘플에 대한 분석을 위해 양측 쌍 스튜던트 t-테스트를 사용했습니다. 정규 분포를 갖는 그룹의 다중 비교를 위해 Tukey 또는 Sidak의 다중 사후 테스트와 함께 일원 또는 양방향 분산 분석(ANOVA)이 사용되었습니다. 달리 명시되지 않는 한, p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
더 요청:
이메일:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel: 86 15292862950 추가
가게:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
