여러 네프론 특이적 세포에서 액틴 세포골격의 동시 안정화로 다양한 손상으로부터 신장을 보호합니다

만성 신장 질환그리고급성 신장 손상기계적으로뚜렷한 신장 질환. 만성 신장 질환은 다음과 관련이 있습니다.족세포 손상, 급성 신장 손상신장 세뇨관 상피 세포에 영향을 미칩니다. 이러한 차이점에도 불구하고,기본적인 특징둘 다급성 및 만성 신장 질환조절 장애가 있는 액틴 세포골격입니다. 우리는 그것을 보여주었습니다GTPase 다이나민의 약리학적 활성화족세포 손상을 개선합니다.만성 신장 질환의 쥐 모델~에 의해액틴 중합 촉진. 여기서 우리는 강성과 극성을 조절하는 다이나민의 역할을 설정합니다.신장 관상 상피 세포액틴 필라멘트를 가지형 네트워크로 가교함으로써. 소분자 작용제에 의한 다이나민의 가교 능력의 활성화는 손상으로부터 근단막의 액토미오신 피질을 안정화시키고, 이는 결국신장 기능을 보존합니다급성 신장 손상의 다양한 쥐 모델에서. 특히, 다이나민 작용제는 족세포를 약화시키고 동시에관상 손상알포트 증후군의 유전적 쥐 모델에서. 우리의 연구는 타당성에 대한 증거를 제공하고 다음을 강조합니다.새로운 전체론적 네프론 보호 치료법의 이점.

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그만큼급성 신장 손상의 주요 원인(아키)는국소 빈혈, 저산소증, 또는신독성1. 되돌릴 수는 있지만 AKI는 사망률이 높고 확실한 치료법이 없는 중요한 건강 관리 문제를 나타냅니다. 병인에 관계없이 AKI는 주로 필수 전해질과 물 수송을 조정하는 데 참여하는 관형 브러시 경계를 형성하는 정점 미세 융모의 신장 세뇨관의 분극 상피 세포를 손상시킵니다2. AKI의 초기 형태학적 특징은 정점 막1에서 액토미오신 피질의 파괴로 인한 브러시 경계 및 세포 극성의 손실입니다.

세포 극성의 확립과 유지에는 신호 전달 계통, 막 수송, 세포골격 역학이 포함되며, 이 모든 것이 고도로 조정되어 있습니다3. 정점 막의 구성은 피질 강성을 확립하여 극성 단백질의 클러스터링을 촉진하는 액토미오신 네트워크의 구조에 의해 크게 결정됩니다. 미오신 II 모터는 피질 강성의 주요 생성자로 간주되지만, 액토미오신 피질의 구조는 수많은 액틴 결합 단백질(ABP)에 의해 확립됩니다.

알려진 ABP 외에도 신장 세뇨관의 브러쉬 경계에는 세포내이입에서의 역할로 가장 잘 알려진 GTPase인 다이나민8이 매우 풍부합니다9. Dynamin은 이량체, 사량체, 고리 및 나선과 같은 다중 올리고머화 상태로 조립되는 본질적인 성향을 가지고 있습니다. 우리는 처음으로 직접적인 다이나민-액틴 상호작용을 확인했고10 다이나민의 올리고머화가 신장 필터의 선택성에 필수적인 특화된 세포인 족세포11,12에서 액틴 중합을 조절한다는 것을 보여주었습니다. CKD의 쥐 모델을 사용하여 우리는 다이나민 의존성 액틴 중합의 활성화가 독특한 구조와 기능을 복원하여 족세포 손상을 역전시키는 것으로 나타났습니다.

여기서 우리는 그것을 보여줍니다신장 관상 상피 세포, 다이나민은 필라멘트성 액틴(F-액틴)을 분기된 네트워크로 교차 연결합니다. Dynamin의 가교 능력은 올리고머화 상태와 F-actin의 길이에 의해 정의됩니다. 다이나민 올리고머화의 약리학적 활성화는 액틴 네트워크를 안정화하여 세포 완전성을 안정화함으로써 AKI에 대응하여 산화 스트레스로 인한 손상으로부터 신장 상피 세포를 부분적으로 보호합니다. 우리의 연구는 다이나민을 프록시로 통해 AKI의 약물 가능 표적으로 신세뇨관 세포의 정점 막의 액토미오신 피질을 식별합니다.

결과 Dynamin 올리고머화는 정점 막의 강성과 형태를 확립합니다.

분극화된 신세뇨관 상피 세포에서 다이나민-액틴 상호작용의 역할을 조사하기 위해 우리는 재구성된 시스템13, 세포11,13 및 전체 유기체12. 세포 표현형은 F-액틴의 상태와 밀착 연접 단백질 폐색연대-1(ZO-1)의 염색 패턴을 따라 Madin-Darby Canine Kidney(MDCK) 세포에서 평가되었습니다. 세포 극성의 바이오마커로 간주됩니다. 알려진 액틴 중합 억제제인 ​​Cytochalasin D(CytoD)와 latrunculin A(LatA)는 F-액틴 수준을 감소시키고 불연속 ZO-1 염색을 유도했습니다(보충 그림 1a). 대조적으로, Bis-T-23는 ZO-1 염색에 아무런 영향을 주지 않고 F-액틴 수준의 약간의 증가를 유도했습니다. LatA 이전에 Bis-T-23를 추가했지만 이후에는 F-액틴 수준과 세포 극성을 부분적으로 보존했습니다. DMSO 차량이나 다이나민 억제제 dynole14 모두 어떤 효과도 나타내지 않았습니다 (보충 그림 1a).

주사 전자 현미경(SEM)을 통해 우리는 정점 막에 초점을 맞춘 약물 유발 세포 형태의 변경을 시각화할 수 있었습니다(그림 1a). 평균 MDCK 세포 높이는 11 ± 2 µm이었고, 미세융모의 평균 길이는 0.63 ± 0.2 µm(표 1)로 신장에서 관찰되는 범위 내에 있었습니다15. LatA는 세포 높이와 미세 융모 길이를 감소시키고 균일하게 분포된 미세 융모를 클러스터로 이동시키는 반면 Bis-T-23는 반대 효과를 유도했습니다(표 1, 그림 1a). LatA 이전에 추가된 경우 Bis-T-23는 세포 높이와 미세융모 길이를 부분적으로 보존했습니다. 미세융모는 기저부에서 피질 액틴에 의해 정의된 절묘한 길이 제어를 나타내기 때문에 이러한 데이터는 Bis-T-23가 정점 막에서 액토미오신 피질을 변형했다는 증거를 제공합니다.

Bis-T-23가 피질 액틴에 미치는 정확한 효과를 확인하기 위해 백금 복제 전자 현미경(PR-EM)을 사용하여 라멜리포디아 내의 액토미오신 피질을 시각화했습니다. LatA는 액틴 네트워크의 밀도를 감소시켰으며, 이 효과는 LatA 이전에 Bis-T-23를 추가함으로써 부분적으로 사라졌습니다(그림 1b). LatA가 액틴 단량체를 격리하여 액틴 필라멘트 해중합을 가속화함에 따라 우리는 다음으로 Bis-T-23에 ​​의한 액틴 오신 피질의 관찰된 보존이 액틴 중합에 대한 긍정적인 영향 때문인지 여부를 조사했습니다. 족세포 추출물10,11에서 관찰된 액틴 중합의 강력한 자극과 대조적으로, Bis-T-23는 MDCK 세포 추출물에서 액틴 중합을 약간만 증가시켰습니다(보충 그림 1b). 유사하게, 추출물로부터의 내인성 다이나민-2(Dyn2)의 면역 고갈 또는 다이노드에 의한 GTPase 활성의 억제는 액틴 중합의 한계 손상을 초래했습니다(보충 그림 1c). LatA와 CytoD는 액틴 중합을 크게 손상시켰지만 LatA 또는 CytoD 이전에 Bis-T-23를 첨가하면 억제 효과를 극복할 수 없었습니다(보충 그림 1d, e). 액틴 필라멘트 핵형성을 자극하여 액틴 중합을 유도하는 약물인 Jasplakinolide는 전체 중합 수준을 크게 증가시키지 않았으며(보충 그림 1d), 이는 MDCK 세포 용해물이 거의 최대 수준의 중합된 액틴을 나타냄을 나타냅니다. 함께, 이들 데이터는 MDCK 세포의 정점 막의 형태에 대한 Bis-T-23의 효과가 액틴 중합 이외의 메커니즘에 의해 유도되었음을 나타냅니다.

신장 상피 세포의 브러시 경계에서 Dyn2 및 F-액틴의 풍부한 위치와 세포내이입에서 다이나민의 역할에 대한 상식을 바탕으로 우리는 다음으로 Bis-T{4}}가 세포내이입의 변경을 통해 액틴에 간접적으로 영향을 미치는지 조사했습니다. 예상대로 Dyn2와 F-actin은 서로 다른 모양과 크기로 정의되는 정점 막 아래의 actomyosin 피질, 미세 융모 및 clathrin 코팅 구덩이 (CCP)에 공동으로 위치합니다 (보충 그림 1f). 우리는 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경을 사용하여 CCP의 역학을 조사했습니다. Bis-T-23는 최고 농도에서도 CCP의 수명 분포에 영향을 미치지 않는 반면, dynole은 생산적인 CCP의 수를 감소시켰습니다(보충 그림 1g). 세포내이입 수준과 세포 형태 변화 사이의 상관관계 부족은 Bis-T- 23가 세포내이입에서 다이나민의 역할에 영향을 주지 않고 피질 액틴을 표적으로 삼는다는 것을 주장합니다.

신장 세포 극성은 정점 막에서 세포 강성을 확립하는 아토미오신 네트워크의 구조와 지속적인 수축에 의해 유지되므로 다음으로 원자간력 현미경(AFM)을 사용하여 세포 강성을 측정했습니다. Nanowizard IV 시스템과 JPK 분석 소프트웨어를 사용하여 다양한 실험 설정에서 Young's Modulus21의 변화를 확인했습니다(보충 그림 2a). LatA로 처리하면 MDCK 세포에서 세포-세포 접촉 강성과 정점 세포 강성이 크게 감소했습니다 (그림 1c-e). 대조적으로, Bis-T-23는 DMSO 비히클에 비해 세포 강성을 크게 증가시켰으며(그림 1c-e), 이는 세포 높이, 미세융모 수 및 액틴 네트워크 밀도에 대한 긍정적인 효과와 일치합니다(표 1 및 그림 1b)22. LatA 이전에 Bis-T-23를 추가하면 Bis-T-23가 액틴 네트워크에 미치는 긍정적인 영향에 따라 세포 강성에 대한 LatA의 부정적인 영향이 크게 감소했습니다(그림 1c-e). 및 정점 세포 형태 (표 1, 그림 1b).

그림 1 Dynamin 올리고머화는 신장 상피 세포의 액틴 구조에 영향을 주어 세포 강성을 정의합니다. 1에 대해 DMSO(0.1%) 또는 Bis-T-23(30 μM, 0.1% DMSO)로 처리된 MDCK 세포의 대표적인 SEM 이미지 2{{23}에 대한 DMSO(0.1%) 또는 LatA(0.2 µM, 0.1% DMSO) 추가 전 0분 } 분 삽입된 부분(주황색 상자 영역)의 확대 이미지는 정점 막의 미세융모의 배열, 분포 및 밀도를 보여줍니다. b (a)에서 설명한 대로 처리된 MDCK 세포의 대표적인 PR-EM 이미지. 이미지는 표시된 조건 하에서 MDCK 세포의 액토미오신 피질 조직의 변화를 보여줍니다. c (a)에서 설명한 대로 처리된 MDCK 세포의 영률 맵의 대표 이미지. d, e 세포-세포 접합부(d) 또는 정점 막(e)에서 측정된 세포 강성을 나타내는 영률을 나타내는 막대 그래프입니다. 각 기호는 단일 셀의 평균 강성을 나타냅니다. d, e에 표시된 결과는 최소 3개 배양 접시의 최소 10 세포에서 생성되었습니다. 오차 막대, 평균 ± SD(*P 0.05 이하, **P 0.01 이하, ***P 0.001 이하, ****P 0.0001 이하, 짝이 없음 양측 t-검정). ns, 중요하지 않습니다.

우리는 또한 AFM에 대한 대체 실험 접근법으로 BioScope II 시스템을 사용하여 세포 강성을 결정했습니다. 이 경우 Matlab 소프트웨어로 계산된 Discher 및 동료 모델에 따라 힘 들여쓰기 곡선이 얻어졌습니다. LatA와 Bis-T-23 사이의 상호 작용에 대해 셀 강성과 관련된 유사한 경향이 기록되었습니다(보충 그림 2b, 2c). 또한 dynode는 세포 강성에 아무런 영향을 미치지 않는 반면 CytoD는 액틴 표현형 (보충 그림 1a)에 따라 세포 강성을 크게 감소 시켰습니다 (보충 그림 2d, e). 함께, 이 데이터는 액토미오신 피질의 상태, 세포 강성, 정점 막의 형태 및 세포 극성 사이의 상관관계를 확립합니다. 이러한 발견은 또한 액토미오신 피질에 미치는 영향을 통해 상피 세포 극성의 기계적 매개변수를 정의하는 데 있어 다이나민 올리고머화의 역할을 설득력 있게 입증합니다.

Dynamin은 액틴 필라멘트를 세포 극성의 기초가 되는 분지형 네트워크로 교차 연결합니다. 다이나민 올리고머화가 액토미오신 피질의 구조에 영향을 미치는 분자 메커니즘을 밝히기 위해 다음으로 재구성된 시스템에서 다이나민이 액틴 필라멘트에 미치는 영향을 조사했습니다. 현재 가설에 따르면 액틴 필라멘트의 길이는 교차 결합 모드를 정의합니다. 앞쪽 가장자리에 있는 네트워크 내의 피질 액틴 필라멘트의 평균 길이가 100~150nm 사이이기 때문에 우리는 F-액틴을 젤솔린(Gsn-액틴)으로 캡핑하여 생성된 더 짧은 필라멘트의 구성에 대한 다이나민의 효과를 조사했습니다(그림 2). 2a). Dyn2를 추가하면 대규모 분기형 네트워크가 형성되었습니다(그림 2b, c). 재조합 Dyn2(그림 2d)의 크기와 모양을 기반으로 네트워크는 여러 액틴 필라멘트와 상호 작용하는 Dyn2 이량체(Dyn2DIMER)와 사량체(Dyn2TETRA)에 의해 주로 형성되었습니다(그림 2e). Dyn2DIMER는 최대 두 개의 필라멘트에 결합되었으며, Dyn2TETRA는 최대 4개의 필라멘트를 묶었고, Dyn2RING은 최대 6개의 필라멘트를 묶었습니다. 이미지의 낮은 배율은 다이나민 의존 네트워크가 더 작고 더 큰 고리 모양의 패턴을 형성한다는 것을 보여주었습니다(그림 2c).

재구성된 시스템의 관찰과 세포에서의 다이나민의 역할을 연관시키기 위해 우리는 다음으로 단클론 항-Dyn2 항체와 금 결합 2차 항체를 사용하여 피질 액틴 네트워크에서 내인성 Dyn2의 위치를 ​​결정했습니다(보충 그림 3a-c). 재구성된 시스템에서 볼 수 있듯이 다이나민은 분기된 네트워크 내에서 고유한 수의 F-액틴과 연관되어 있습니다(그림 2f). 함께, 이러한 데이터는 F-액틴을 분기된 네트워크로 교차 연결하는 다이나민의 새로운 활동을 식별합니다.

다이나민의 가교 능력과 액토미오신 피질 및 정점 막의 형태에 대한 Bis-T-23의 보호 효과를 연관시키기 위해 다음으로 다이나민 매개에 대한 Bis-T-23의 효과를 조사했습니다. 재구성된 시스템의 네트워크(그림 3a). 다양한 필라멘트 밀도의 지형적 표현을 제공하는 등고선 플롯을 기반으로 Bis T-23는 전체 네트워크 밀도를 증가시켰습니다(그림 3a). 이는 다이나민에 결합된 F-액틴 수의 증가로 설명될 수 있습니다. 올리고머화의 증가. 또한, 다이나민은 긴 F-액틴보다 더 짧은 필라멘트를 더 강력하게 교차결합시켰으며(그림 3a-c), 이는 다이나민이 분지형 네트워크를 형성하는 능력이 올리고머화 상태와 액틴 필라멘트의 길이에 의해 정의된다는 것을 시사합니다. 액틴 필라멘트를 네트워크로 교차 연결하는 능력은 두 개의 다이나민 이소형에 의해 공유되었으며, Dyn2와 뉴런 특이적 다이나민-1(Dyn1)이 편재적으로 표현되었습니다(그림 3b, c).

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