당뇨병성 신장 질환의 병원성 변이체를 식별하는 표적 차세대 시퀀싱

결과

연구 코호트

206명의 환자CKD, 97 포함NDKD환자와 109DKD유타 신장 연구(Utah Kidney Study)의 환자들은 맞춤형 유전자 패널을 사용하여 성공적으로 시퀀싱되었습니다. 본 연구에 포함된 NDKD 및 DKD 환자의 평균 연령은 각각 47.9세 및 62.0였습니다. NDKD 코호트 환자의 대다수(56.7%)는 사구체병증의 임상 진단을 받았고, 20.6%는 낭포성 신장 질환, 5.2%는 선천성 신장 질환, 4.1%는 세뇨관간질 질환을 앓았습니다. 이 환자의 약 13%는 다른 형태의 NDKD를 가지고 있었습니다. 이 연구에 포함된 모든 당뇨병 환자는 CKD 진단 이전에 당뇨병 진단을 받았고 EMR에서 당뇨병이 CKD의 주요 원인으로 나열되었습니다. 이 환자들 중 80.7%는 T2D 진단을 받았고 76.1%는 유타 신장 연구에 등록할 당시 인슐린 치료를 받고 있었습니다. NDKD 환자의 38%와 DKD 환자의 거의 34%가 신장 질환이 있는 직계 가족이 있다고 보고했습니다.

신장 질환 관련 유전자의 표적 NGS

표적 시퀀싱 패널을 사용하여 우리는 2{ {8}}이 연구에는 6명의 환자가 포함되었습니다. 이러한 변종 중 63개(5.0%)는 ACMG-AMP 가이드라인을 사용하여 병원성 또는 병원성 가능성이 있는 것으로 분류되었습니다. 나머지 변이체는 '의미를 알 수 없는 변이체'(VUS)(n=1,024; 81.3%) 또는 양성/양성 가능성이 있는 변이체(n=172; 13.7%)로 분류되었습니다.

NDKD 환자의 신장 질환 관련 유전자의 진단 변이체

전체적으로, 우리 연구에 포함된 97명의 NDKD 환자 중 35명(36%)에서 병원성 또는 병원성 변이가 확인되었습니다. 우리는 18명의 NDKD 환자(18.6%)에서 gnomAD 데이터베이스에 존재하지 않는 13개의 새로운 변이(76.5%)를 포함하여 17개의 진단 변이(즉, 환자의 임상 진단과 관련된 유전 패턴과 일치하는 병원성 또는 가능성이 있는 병원성 변이)를 확인했습니다. 우리 연구에서. 이러한 병원성 또는 병원성 가능성이 있는 단일 뉴클레오티드 및 삽입/결실 변이체는 7개의 유전자(CFH, COL4A3, COL4A5, GLA, PAX2, PDK1 및 PDK2)에서 검출되었습니다. PKD1과 PKD2는 후보 진단 변이체의 부담이 가장 큰 유전자였다.

진단율은 낭포성신장질환 환자에서 가장 높았다(9 of 20; 45.0%). 총 9명의 환자가 상염색체 우성 다낭성 신장 질환(ADPKD)의 원인으로 알려진 유전자인 PKD1 또는 PKD2에서 진단 변이체를 가지고 있었습니다. 식별된 PKD1/PKD2 변이체 중 8개는 인구 데이터에 없었습니다. 낭포성 신장 질환이 있는 5명의 추가 환자는 PKD1 또는 PKD2에서 전산 예측 도구를 사용하여 손상될 것으로 예측되는 새로운 VUS를 가졌습니다. 이러한 변이체는 임상적으로 중요한 것으로 분류하기 위한 엄격한 ACMG-AMP 기준을 충족하지 않지만 병원성을 지지하는 증거가 있습니다. 이 전산 지원과 함께 분리 분석 및 기능 분석을 포함한 이러한 변형에 대한 추가 검사는 이 연구에 포함된 낭포성 신장 질환 환자의 유전자 스크리닝의 진단 수율을 더욱 높일 수 있습니다.

또한, 우리는 사구체신염(G1/G1 유전자형) 및 고혈압성 신장병증(G1/G2 유전자형).

유전적 진단에 기반한 NDKD 환자의 신장 질환 진단 재분류—4명의 NDKD 환자에서 신장 질환 관련 유전자 시퀀싱

(4.1%) 문서화된 임상 진단과 다른 유전적 진단과 일치하는 변이를 식별할 수 있었습니다. 이 환자들 중에서 우리는 신장 생검 후 항호중구 세포질 항체 관련(ANCA) 혈관염으로 진단된 환자에서 NPHP1의 큰 동형접합 결손을 확인했으며, 이는 이 질병을 가진 환자의 약 80%를 차지하며, 이 개인이 2개의 동시 질환을 가질 수 있음을 시사합니다. 신장 장애(즉, 가족성 소아 신결석증 및 ANCA 혈관염). 유사하게, PKD로 진단된 1명의 환자는 COL4A3(p.R1661C)에서 진단적 변이를 갖는 것으로 밝혀졌습니다. 이 동일한 변이는 모집단에서 드물지만(MAF=3.6×10-4), 우리 연구에서 2명의 추가 환자(선천성 신증후군 환자와 DKD로 진단받은 환자)에서 관찰되었으며 이전에 FSGS 및 상염색체 열성 알포트 증후군 환자에서 관찰되었습니다(MIM 104200). 이 환자들 각각에 대해 그들의 유전적 진단은 얇은 기저막 신병증(TBMN), FSGS 또는 Alport 증후군을 포함한 사구체 질환과 더 일치합니다.

마찬가지로 임상 진단을 받은 환자에서 GLA(p.A143T)의 희귀 변이체를 확인했습니다.

선천성 신장 질환; 이 변이는 이전에 파브리병 환자에서 병원성인 것으로 보고되었습니다(MIM 301500). 마지막으로, IgA 신병증으로 진단된 1명의 환자는 섬모 기능 장애 및 낭성 신장 질환에 기여하는 것으로 알려진 IFT122(p.R166W 및 p.R779X)에서 드문 복합 이형접합 변이체를 보유하는 것으로 밝혀졌습니다.

DKD 환자의 신장 질환 관련 유전자의 희귀 변이체—ACMG-AMP 가이드라인을 사용하여 동일한 신장 질환 관련 유전자의 변이를 분류한 결과, DKD 환자의 22.0퍼센트(24/109)에서 병원성 또는 병원성 가능성이 있는 변이가 확인되었습니다. 이 연구에 포함되었습니다(표 2B). 변형의 비율은 T1D와 T2D 환자 모두에서 유사했습니다(각각 19% 대 23%; p-값 > 0.05). 통계적으로 유의하지는 않지만, 병원성 또는 병원성 변이를 가지고 있는 것으로 밝혀진 DKD 환자의 거의 1/3(27.0%)이 신장 질환의 가족력을 ​​보고한 반면 알려진 신장 질환 가족력이 없는 DKD 환자의 19.4%만이 보고되었습니다. 총 29개의 병원성 또는 병원성 가능성이 있는 변이가 이 환자들의 23개 유전자에서 확인되었습니다. C5orf42(CPLANE1 및 JBTS17이라고도 함)는 이 환자들 중에서 병원성 또는 병원성 가능성이 있는 변이의 부담이 가장 컸습니다.3

흥미롭게도, 9명의 DKD 환자는 DYNC2H1, INPP5E, XPNPEP3, NEK8 및 C5orf42를 포함하여 알려진 ciliopathy 유전자에서 희귀한 병원성 또는 가능성이 있는 병원성 변이를 가지고 있는 것으로 밝혀졌습니다. 이들 유전자에서 확인된 변이체 중 6개는 스플라이스 부위에 영향을 미치거나 조기 정지 코돈을 도입하는 추정 기능 상실(loss-of-function, pLOF) 변이체(즉, 무의미한 변이체 또는 프레임이동 삽입/결실)입니다. 이 환자들 중 1명은 C5orf42(p.I165Yfs*17, 병원성 변이체 및 p.S123F, 병원성 증거를 뒷받침하는 변이체, 6가지 전산 예측 방법 중 최소 5가지에 의해 손상될 것으로 예측됨)에서 이중대립유전자 변이체를 가졌습니다. 이 환자는 이 유전자의 변이체를 손상시키는 복합 이형접합 보인자일 가능성이 높습니다.

DKD 환자의 하위 집합에서 확인된 희귀 진단 NDKD 변이체—3명의 DKD 환자(2.8%)는 신장 질환의 근본적인 원인이 당뇨병의 결과가 아닐 수 있음을 암시하는 희귀 변이를 가지고 있는 것으로 밝혀졌습니다. T2D에 기인한 CKD 환자는 AQP2(p.N220T)에서 드문 진단 변이를 갖는 것으로 밝혀졌습니다. 심한 다뇨증을 특징으로 하는 상태인 신성 요붕증의 상염색체 우성 형태를 유발하는 유전자. 유사하게, 병원성 REN 변이체(p.R49X)가 T2D를 가진 두 번째 환자에서 확인되었습니다. REN의 병원성 변이는 상염색체 우성 세뇨관간질 신장 질환(ADTKD)과 관련이 있습니다. 이 두 환자 모두 당뇨병성 망막병증의 병력이 있기 때문에 DKD와 NDKD가 동시에 있을 수 있습니다. 마지막으로, 1명의 T2D 환자가 COL4A3(p.R1661C)에서 진단 변이를 가지고 있는 것으로 밝혀졌습니다. 위에서 언급한 바와 같이, 이 변이는 FSGS 및 상염색체 열성 알포트 증후군 환자에서 관찰되었습니다. AQP2 및 REN 변이가 있는 DKD 환자와 달리, 35년 이상의 당뇨병에도 불구하고 이 환자는 망막병증 또는 신경병증의 문서화된 증거가 없으므로 이 환자가 NDKD일 가능성이 더 높습니다.

NDKD 및 DKD 환자의 신장 질환 관련 유전자의 희귀 변이체의 유전적 부담—We performed gene-based burden association tests to compare the rate of rare variants between NDKD and DKD patients aggregated within each gene. As expected, the most significant enrichment of rare pathogenic or likely pathogenic variants was observed in PKD1 among NDKD patients. Similarly, although not statistically significant (p-value >0.05), NDKD 환자 중 PKD2에서 희귀한 병원성 또는 가능성이 있는 병원성 변이체의 강화도 관찰되었습니다. 반대로 DKD 환자에서는 C5orf42의 희귀 변이체가 과도하게 관찰되었습니다.

ACMG-AMP 가이드라인을 사용하여 VUS로 분류된 변이는 양성으로 배제할 수 없고 병원성 변이를 포함할 가능성이 높기 때문에 전산 예측 방법을 기반으로 병원성의 지지 증거가 있는 희귀 변이를 포함하도록 유전자 기반 부담 분석을 확장했습니다. 희귀 병원성 또는 가능성이 있는 병원성 변이체 분석에서 볼 수 있듯이 PKD1(p-value=0.01) 및 PKD2(p-value=0.04) 모두에서 희귀 변이체의 과도한 부담을 관찰했습니다. ) NDKD 환자에서. COL4A5의 희귀 변이체(p값=0.008)도 DKD 환자와 비교하여 NDKD가 상당히 풍부했습니다. 흥미롭게도, C5orf42(p-값= 0.04)의 희귀 변이를 가진 DKD 환자에서 볼 수 있는 연관성을 강화하는 것 외에도, 이 분석은 두 ACE(p-값 {{21 }}.008) 및 NEK8(p-값=0.04).

토론/결론

이 연구의 목표는 당뇨병이 있거나 없는 환자의 신장 질환의 분자적 기초를 이해하는 데 NGS의 유용성을 조사하는 것이었습니다. 유전자 검사는 ADPKD, 알포트 증후군 및 파브리병을 포함한 유전성 신장 질환이 있는 환자에게 보다 정확한 진단을 제공하는 데 도움이 되는 것으로 나타났지만,DKD, 그리고 DKD 진단을 받은 환자에서 의심하지 않는 신장 질환을 식별하는 데 유용성이 제한되었습니다. 이를 더 자세히 조사하기 위해 우리는 345개의 신장 질환 관련 유전자로 구성된 맞춤형 유전자 패널을 사용하여 97명의 NDKD 및 109명의 DKD 환자를 포함하여 총 206명의 CKD 환자에서 표적 NGS를 성공적으로 수행했습니다. 우리의 분석은 이 연구에 포함된 NDKD 환자의 약 19%의 임상 진단과 일치하는 진단 변이를 확인했습니다. NDKD 환자의 1/3이 ACMG-AMP 가이드라인에 따라 분류된 병원성 또는 병원성 가능성이 있는 변이를 가지고 있는 것으로 밝혀진 반면, 이 연구에 포함된 DKD 환자의 20% 이상이 유사하게 분류된 변이(즉, 병원성 또는 병원성 가능성이 있는 변이)를 가지고 있었습니다. ) 이러한 동일한 신장 질환 관련 유전자에서. 우리는 이 연구에 포함된 당뇨병 환자의 약 3%에서 NDKD를 암시하는 유전적 변이를 발견했습니다.

병원성 변이체를 운반하는 것으로 밝혀진 여러 유전자DKDCUBN, PEX5, VDR 및 COL4A3을 포함한 환자는 이전에 당뇨병성 신증에 연루된 적이 있습니다. 근위 세뇨관 세포의 정단 브러시 경계에서 발현되는 유전자인 CUBN의 코딩 변이는 알부민뇨와 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다. 최근의 전체 게놈 연관 연구는 이 유전자에서 이전에 확인된 일반적인 변이와 독립적이며 당뇨병이 없는 환자에 비해 당뇨병 환자에서 3.5-배 더 강력한 효과를 갖는 CUBN의 희귀 코딩 변이를 확인했습니다. . 유사하게, Saito et al.의 다중 오믹스 시스템 생물학 분석. 과산화소체 생물 발생 마커인 PEX5가 과산화소체 기능 장애를 통해 당뇨병성 신장병증과 연관되고 과산화소체 관련 대사물의 하향 조절에 역할을 한다는 것을 발견했습니다. 더 최근에는 DKD에 대한 가장 큰 게놈 연관 연구의 일환으로 청소년 당뇨병 연구 재단(Juvenile Diabetes Research Foundation)의 당뇨병성 신장병 공동 연구 이니셔티브(Diabetic Nephropathy Collaborative Research Initiative)에서 DKD와 관련된 16개의 게놈 차원의 중요한 유전자좌를 확인했습니다. 흥미롭게도 이 연구의 상위 신호 중 2개는 알려진 신장 질환 관련 유전자(COL4A3 및 BMP7)에 있습니다. COL4A3은 사구체 기저막의 주요 구조적 구성 요소를 암호화하며 Alport 증후군, FSGS 및 TBMN을 비롯한 유전성 신병증과 관련이 있습니다. 희귀한 COL4A3 변이는 본 연구에 포함된 3명의 환자(1명의 DKD 및 2명의 NDKD 환자)에서 확인되었으며 이전에 생검으로 입증된 FSGS를 가진 가족에서 관찰되었으며, 이는 이 변이가 당뇨병 상태와 무관하게 신장 질환에 기여할 수 있음을 시사합니다.

고혈당증이 있는 경우 섬모 구조 또는 기능의 결함은 족세포 소실, 간질 염증 및 단백뇨를 포함하여 신장의 구조적 및 기능적 변화를 일으킵니다. 흥미롭게도, DKD 환자의 25%가 병원성 또는 가능성이 있는 병원성 변이에 대해 양성이었으며, 희귀 상염색체 열성 섬모병증과 관련된 유전자인 C5orf42에서 희귀한 pLOF 변이를 가지고 있는 것으로 밝혀진 3명의 환자를 포함하여 알려진 섬모병증 관련 유전자에 희귀 변이가 있는 것으로 밝혀졌습니다. 낭성 신장 질환을 특징으로 합니다. 유사하게 우리는 ESRD가 있는 DKD 환자 2명의 XPNPEP3에서 희귀하고 가능성이 있는 병원성 변이를 확인했습니다. XPNPEP3의 결함은 ESRD로 이어지는 낭포성 신장 질환인 신장결석증 유사 신병증을 유발합니다. 종합하면, 이러한 데이터는 당뇨병 병태생리학의 맥락에서 신장 질환 관련 유전자의 변이가 당뇨병 환자의 신장 질환 발병에 역할을 한다는 것을 시사합니다.

유전자 검사의 진단적 유용성을 조사한 이전 연구CKD전체 진단 수율이 약 10%인 것으로 나타났습니다. 그러나 당뇨병성 신증으로 임상 진단을 받은 환자의 경우에는 훨씬 낮았다(1.6%). 대조적으로, 우리는 연구에 포함된 DKD 환자의 22%가 유전자 패널에 포함된 신장 질환 관련 유전자에서 병원성 또는 병원성 가능성이 있음을 발견했습니다. 이러한 불일치의 원인은 불분명하지만 연구에서 변이가 있는 것으로 밝혀진 환자의 거의 70%가 ESRD를 가지고 있었으며 이러한 변이가 당뇨병 환자를 더 심각한 신장 질환에 걸리게 할 수 있음을 시사합니다.

이전 연구의 데이터에 따라 본 연구는 다양한 형태의 NDKD 환자에서 질병의 근본적인 분자적 원인을 식별하는 유전자 검사의 효과를 강조합니다. 여러 NDKD 환자의 임상 진단을 확증하는 유전적 진단을 지정하는 것 외에도 환자의 하위 집합에서 진단의 재평가가 필요함을 시사하는 희귀 변종을 식별할 수 있었습니다. 이러한 환자들에게 유전자 분석은 인식되지 않은 임상 증상을 감지하는 데 도움이 되었을 수 있으며 치료 관리에 더 나은 정보를 제공했을 수 있습니다.

우리의 연구에는 인정해야 할 한계가 있습니다. 첫째, 우리 연구에는 206명의 환자만 포함되었습니다. 겸손한 표본 크기에도 불구하고 DKD에서 신장 질환 관련 유전자의 희귀 변이체 부담을 포괄적으로 조사한 것은 이번이 처음입니다. 우리는 DKD 환자의 22%가 이 유전자에 희귀한 변이를 가지고 있음을 발견했을 뿐만 아니라 일부의 경우 신장 질환이 당뇨병의 결과가 아닐 가능성이 있음을 암시하는 유전적 진단을 확인하여 유전적 스크리닝의 가치를 강조했습니다. 정확한 분자 진단을 밝히는 데 있습니다. 둘째, 표적 시퀀싱을 사용하여 코딩 변이와 구조적 재배열을 모두 감지할 수 있었지만, RNA 발현 및/또는 처리에 잠재적으로 영향을 미치는 비암호화 영역의 변이(예: 전사 억제, 엑손 건너뛰기 및 인트론 포함) , 평가되지 않았습니다. 맞춤형 포획 분석은 패널에 포함된 유전자의 코딩 영역 및 엑손-인트론 경계로 제한되었기 때문에 프로모터 영역 및 기타 비코딩 또는 조절 영역에 있는 변이를 포함하여 이러한 영역 외부의 모든 변이는 이를 사용하여 감지할 수 없습니다. 시험. 셋째, 특이성을 높이기 위해 변이 해석에 대한 ACMG-AMP 표준 및 지침을 준수했으며, 따라서 본 연구에서 식별된 많은 변이는 VUS로 표시되었으며 임상 표현형과 상관관계가 없었습니다. VUS가 양성으로 완전히 배제될 수 없기 때문에 이는 우리 연구의 민감도에 영향을 미쳤을 수 있습니다. 기능 연구의 지원과 결합된 전산 예측 알고리즘은 VUS의 병원성을 더 잘 이해하고 추가 연구를 위해 우선 순위를 지정하는 데 도움이 될 수 있습니다.

우리의 목표는 NGS 기술을 활용하여 당뇨병 환자의 신장 질환의 유전적 토대를 더 잘 이해하는 것이었습니다. 우리 연구에 포함된 대부분의 당뇨병 환자는 신장 질환 관련 유전자에 병원성/병원성 변이가 있는 것으로 밝혀지지 않았지만, 적지 않은 비율(20% 이상)이 그들의 질병에 기여하는 것으로 의심되는 변이를 가지고 있는 것으로 밝혀졌습니다. 우리의 연구 결과는 이전에 DKD와 연결되지 않은 유전자(예: 섬모병증 유전자)의 희귀 변이가 DKD 감수성에 기여할 수 있으며 DKD 환자의 유전자 스크리닝이 분자 진단을 제공하여 정밀 진단을 개선하고 예후를 도울 수 있음을 시사합니다. 그들의 장기 관리신장 질환.

보충 자료

보충 자료는 PubMed Central의 웹 버전을 참조하십시오.

감사의 말

저자는 국립 신장 재단(MGP)과 래리 H. 및 게일 밀러 가족 재단 당뇨병 이니셔티브(MGP)의 보조금 지원을 인정합니다.

자금 출처

이 연구는 유타 및 아이다호 국립 신장 재단(MGP)과 래리 H. 및 게일 밀러 가족 재단 당뇨병 이니셔티브(MGP)에서 부분적으로 자금을 지원 받았습니다.

참조

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추가 요청:david.deng@wecistanche.com