다낭성 신장 질환의 원인
Mar 10, 2022
자세한 정보:ali.ma@wecistanche.com
PKD1의 과발현은 다낭성 신장 질환을 유발합니다
Caroline Thivierge, Almira Kurbegovic, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté, Marie Trude
기저에 깔린 병인 기전상염색체 우성다낭성 신장 질환(ADPKD)는 아직 밝혀지지 않았습니다. Pkd1이(다낭성 신장 질환 1)유전자 haploinsufficiency 및 heterozygosity의 손실은 역설적으로 높은 수준의 Pkd1(다낭성 신장 질환 1) 발현이 ADPKD의 신장에서 검출되었습니다(상염색체 우성다낭성 신장 질환) 환자. Pkd1 여부를 확인하려면(다낭성 신장 질환 1)기능의 획득은 병인 과정일 수 있으며, Pkd1 세균 인공 염색체(Pkd{1}}BAC)는 상동 재조합에 의해 변형되어 성인 신장에 우선적으로 지속적인 Pkd1 발현을 표적으로 하고, 특히 과발현되는 여러 형질전환 계통이 생성되었습니다. 신장의 Pkdl 이식유전자는 Pkd1 내인성 수준보다 2-에서 15-접힙니다. 모든 형질전환 마우스는 세뇨관 및 사구체 비용과 신부전증을 재현 가능하게 발달시켰고 신부전으로 사망했습니다. 이 모델은 야생형 Pkd1의 과발현만으로도 인간 ADPKD와 유사한 낭형성을 유발하기에 충분함을 보여줍니다 (상염색체 우성다낭성 신장 질환). 우리의 결과는 또한 c-myc가 Pkd1의 생체 내 다운스트림 이펙터에서 중요하다는 것을 나타내는 모든 형질전환 라인의 마우스에서 현저하게 증가된 신장 c-myc 발현을 밝혀냈습니다.(다낭성 신장 질환 1)분자 Dathwavs, 이 연구는 귀중한 최초의 PKD를 생산했을 뿐만 아니라(다낭성 신장 질환)분자 병인 및 치료법을 평가하는 모델이지만 기능 획득이 ADPKD의 병인 메커니즘이 될 수 있다는 증거도 제공합니다. (상염색체 우성다낭성 신장 질환).
상염색체 우성다낭성 신장 질환(ADPKD)는 인간에서 가장 흔한 유전 질환 중 하나입니다. 그것은 네프론의 모든 부분에 영향을 미치는 다발성 신장 낭종의 점진적인 발달이 특징입니다. 다른 증상으로는 간과 췌장의 낭종 형성, 두개내 동맥류 및 심혈관 결함이 있습니다. ADPKD (상염색체 우성다낭성 신장 질환)일반적으로 중년 후반까지 말기 신장 질환으로 진행하여 신부전을 유발합니다.
ADPKD의 약 85% (상염색체 우성다낭성 신장 질환)사례는 PKD1의 돌연변이와 관련이 있습니다.(다낭성 신장 질환 1)유전자. 이 PKD1(다낭성 신장 질환 1)유전자는 크고 54kb에 걸쳐 있으며 46개의 엑손으로 구성되어 있습니다. 14.2-kb 전사체를 생성하고 4., 302-폴리시스틴이라는 아미노산 단백질-1(4, 9-11)을 인코딩합니다. 인간 PKD1 및 폴리시스틴{11}} 발현은 정상 및 ADPKD에서 분석되었습니다. (상염색체 우성다낭성 신장 질환)신장. 신장 발달 동안 폴리시스틴{0}}은 사구체 및 관상 상피 세포에서 쉽게 검출됩니다(참고 문헌 37 및 그 안의 참고 문헌에서 검토됨). 정상적인 성인에서 우리와 다른 사람들은 PKD1이(다낭성 신장 질환 1)RNA와 단백질은 집합세관과 원위세뇨관에서 중간 수준에서 낮은 수준으로 발현되는 반면, ADPKD에서는 수준이 증가합니다(~{0}}배). (상염색체 우성다낭성 신장 질환)신장(22, 39). 흥미롭게도 폴리시스틴-1 발현은 대부분의 신장 상피 낭종에서 발견되지만, 상당수의 낭종에서는 염색이 나타나지 않습니다(29). 신장 외에도 PKD1(다낭성 신장 질환 1)발현은 일반적으로 상피 및 비상피 세포 유형을 포함한 다른 성인 조직에서 널리 퍼져 있습니다(6,14,18,29,30, 39).
200가지 이상의 다양한 PKD1(다낭성 신장 질환 1)돌연변이가 기술되었으며, 대부분은 결실-삽입, 프레임시프트 또는 넌센스 돌연변이입니다. 이것은 하나의 대립유전자의 비활성화와 일치하는 절단된 형태의 단백질을 초래할 것으로 예상됩니다.
그러나 상당한 비율은 유전자 전체에서 발견되고 종종 특정 가족에 고유한 잘못된 의미 또는 프레임 내 돌연변이입니다(33, 34). 이름에서 알 수 있듯이 ADPKD (상염색체 우성다낭성 신장 질환)우성이며 전송된 돌연변이 PKD1(다낭성 신장 질환 1)대립 유전자는 질병을 일으키기에 충분합니다. 그러나 ADPKD에서 신장 낭종의 국소적 성질은 (상염색체 우성다낭성 신장 질환)PKD1에 대한 돌연변이 메커니즘을 시사합니다.(다낭성 신장 질환 1)이형접합체의 손실 또는 두 번의 공격이 있을 수 있습니다. 이 메커니즘에 대한 지원은 PKD1의 감지에 의해 획득되었습니다.(다낭성 신장 질환 1)상당한 비율의 포낭(3, 21, 32)에서 세포의 클론 체세포 돌연변이. heterozygosity의 손실 메커니즘은 개별 가족에서 일반적으로 관찰되는 광범위하게 다양한 표현형을 설명할 수 있습니다.
마우스 Pkd1에 대한 연구(다낭성 신장 질환 1)유전자는 인간과 쥐 유전자 및 유전자 산물 사이의 밀접한 유사성 때문에 PKD1 기능에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 정상적인 발달에서 뮤린 Pkd1은 상실배 단계부터 높은 수준으로 발현되며 모든 신경 능선 세포 유도체에서 검출됩니다. 성인 뇌, 대동맥궁, 연골, 중간엽 응결을 포함합니다(16, 17). Pkd1 결실을 표적으로 하는 동형 접합 돌연변이 마우스는 자궁 내에서 사망하고 신장 및 췌장 낭종이 발생하는 것으로 보고되었습니다(2,19,24-26, 40). 마우스 모델을 생성하려는 이러한 이전의 시도는 불행히도 출생 후 생존 가능한 동물을 제공하지 못했습니다. 그럼에도 불구하고, 이들 동형접합 Pkd1 돌연변이 마우스에서 신장 낭종의 발생은 생식계열 돌연변이 및 정상 대립유전자의 체세포 불활성화를 포함하는 인간에서의 2-히트 돌연변이 메커니즘의 가설과 일치할 것이다. 그러나, Pkd1 표적화된 결실에 대해 이형접합인 마우스는 늦은 성인 발병에도 불구하고 간헐적으로 간 및 췌장 낭종을 동반한 PKD를 나타내어 반수체 부족 또는 유전자 용량 감소의 기전을 뒷받침한다. 더욱이, 이형접합체 또는 반수체부족증의 상실이 ADPKD의 유일한 기전이 아닐 수 있습니다. (상염색체 우성다낭성 신장 질환)병인. 실제로, 이러한 메커니즘은 PKD1의 지속적이거나 향상된 발현과 차이가 있습니다.(다낭성 신장 질환 1)비기능성 단백질이 생성되지 않는 한 대부분의 인간 신장 낭종에서 볼 수 있습니다. 지속적 또는 증가된 PKD1 발현의 이러한 발견은 기능의 획득 또는 과발현이 조작적일 수 있는지 여부에 대한 질문을 제기합니다. Pkd1 기능 획득 병인 기전을 조사하기 위해 우리는 Pkd1의 표적 발현을 위해 대장균에서 상동 재조합에 의해 후속적으로 변형된 쥐 Pkd1 박테리아 인공 염색체(Pkd{5}}BAC)를 분리하고 특성화했습니다.(다낭성 신장 질환 1)특히 신장에. 우리는 서로 다른 수준에서 Pkd1 이식유전자를 발현하는 3개의 형질전환 라인의 생산을 보고합니다. 모든 마우스는 인간 ADPKD와 많은 유사성을 재현 가능하게 표시했으며 신장 형태 및 기능적 변화의 빠른 진행으로 조기 발병을 일관되게 개발했으며 중년에 신부전으로 사망했습니다. 또한, 현재 연구는 Pkd1이 이 PKD 표현형을 매개할 수 있는 생체 내 메커니즘을 설명합니다. 이 마우스는 이종 PKD1의 단독 신장 과발현에 의해 생성된 PKD의 첫 번째 모델을 나타냅니다.(다낭성 신장 질환 1)유전자.
재료 및 방법
Pkd1을 포함하는 BAC 클론의 분리(다낭성 신장 질환 1)현장. 박테리아 숙주 균주 E. coli DH10B(RecA; RecBC)의 Pkd1-BAC 클론을 129Sv 마우스 pBelo11BAC 라이브러리(Research Genetics)에서 분리했습니다. BAC 슈퍼 풀 스크리닝은 5개 영역, 5-CTG ATGAGTTCTGGCCATGGATG-3(정방향 Pkd1 엑손 1) 및 5-CTGCCA GCCAATGCCATAGTCAC{10}}(역방향 Pkd1 엑손 1); 및 3개 지역, 5-TCG GCCCTAGCGTCTGCAGCC{15}}(앞으로 Pkd1 엑손 39) 및 5-TCCAGTCC CACCTACAGCCAAC-3(역 Pkd1 엑손 40). 두 증폭 모두에 대한 하나의 양성 클론이 확인되고 표준 겔 및 펄스 필드 겔 전기영동(PFGE)에 이어 서던 블로팅에서 분석되었습니다. 서던 블롯 분석을 위해 7개의 마우스 Pkd1 프로브가 설계되었습니다: 게놈 엑손 1(516bp; 뉴클레오티드 [nt] 1 ~ 516; NCBI 수탁 번호 U70209), 게놈 엑손 2-3(220bp), 게놈 엑손 {{ 31}} (8,479 bp), cDNA 엑손 15-20 (1,724 bp; nt 6455 ~ 8179), cDNA 엑손 25-34 (1,315 bp; nt 9415 ~ 10730), cDNA 엑손 36-45 ( 1,655 bp; nt 10963 ~ 12618) 및 게놈 엑손 45-46(1,640 bp)(16). 이 뮤린 Pkd{53}}BAC의 BAC 삽입 말단을 포함한 여러 영역도 시퀀싱되었으며 인간 PKD1 유전자 및 인접 영역과 상동인 것으로 확인되었습니다.
결과
SBPkdl의 생산(다낭성 신장 질환 1) 상동 재조합에 의한 rAc-BAC. 기능의 Pkd1 이득만으로도 ADPKD를 생성하기에 충분한지 여부를 결정하기 위해 (상염색체 우성다낭성 신장 질환)표현형, 우리는 먼저 BAC 벡터 129/Sv 라이브러리에서 전체 Pkdl 유전자를 포함하는 게놈 클론을 분리했습니다. 이 라이브러리는 5'말단의 엑손 1과 3'말단의 엑손 39~40에 걸쳐 있는 Pkd1 유전자에 대한 두 세트의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 스크리닝되었습니다(그림 1). 전체 인접한 Tsc2 유전자 본체를 포함하는 Pkd1 유전자에 대한 양성 BAC 클론이 확인되었습니다. Pkd1 삽입체는 게놈 구조가 내인성 Pkd1의 구조와 일치하도록 자세히 특성화되었습니다.(다낭성 신장 질환 1)삽입물이 파생된 129/Sv 마우스 균주 및 C57BL/6J 근친교배 균주의 유전자. 4개의 제한 효소 분해와 전체 Pkdl 유전자를 덮는 7개의 프로브가 있는 서던 블롯 분석에 의한 이러한 근친교배 균주의 BAC 및 Pkd1 유전자좌의 게놈 지도는 재배열의 증거 없이 동일하게 보였다(그림 1). 이 BAC에는 Pkd1의 업스트림 시퀀스의-37kb 및 다운스트림 시퀀스의-39kb를 포함하는 ~121-kb 삽입물이 포함되어 있습니다.(다낭성 신장 질환 1)전기영동 및 시퀀싱에 의해 결정된 유전자.
이 Pkd{0}}BAC 클론은 E.coli에서 두 개의 연속적인 상동 재조합 이벤트에 의해 수정되었습니다. Pkd1(다낭성 신장 질환 1)유전자는 뉴클레오티드(G에서 A로)를 치환하여 엑손 10에서 태그를 지정하여 cDNA 지도의 위치 2355에 새로운 EcoRI 사이트를 생성했습니다. 이 침묵 점 돌연변이는 Pkd1을 구별하기 위해 생성되었습니다.(다낭성 신장 질환 1)내인성 기원의 BAC 유전자 및 전사체. 또한, 우리는 이전에 확인된 SBM(c-Myc에 연결됨) 또는 SBF에서 c-에 연결된 SBF에서 이전에 확인된 "SB" 신장 상피 특이적 요소를 이용하여 Pkd1-BAC 유전자의 5' 조절 요소를 대체했습니다. fos)construct-trans-gene은 신장으로의 발현을 제한합니다(36,38)(그림 2a).
이 새로운 SBPkd1TAc-BAC는 SB 요소의 바로 상류에 위치한 고유한 부위인 Notl과 Tsc2 유전자 본체 내의 ClaI로 분해되어 Tsc2 조절 요소와 유전자 본체의 5'절반을 절단하여 Tsc2 외인성 발현의 결여를 보장합니다 모든 조직에서 원핵생물의 BACvector 서열을 제거합니다(그림 1 및 2). 이 70-kb Notl-Cal 선형화 단편을 분리, 정제하고 난모세포 미세주입을 위해 정량화했습니다(36).
SBPkd1rAc 형질전환 마우스의 생산 및 분석. SBPkd1rAc 이식유전자의 여러 사본을 가지고 있는 4명의 형질전환 설립자는 일관되게 PKD를 개발했습니다.(다낭성 신장 질환). 서던 분석에 의해 결정된 4개의 SBPkdlrAc 창시자 마우스로부터, 3개의 SBPkd1rAG 형질전환 라인이 2-9개의 형질전환 유전자 카피로 확립되었다(도 2b). 이러한 계통에서 이식유전자 무결성의 특성화는 도 2b의 대표적인 예에 의해 나타난 바와 같이 5', 내부 및 3' 프로브로 모니터링되었습니다. 트랜스제닉 계통은 5'"SB" 프로브로 10.9kb의 밴드를 나타내었고 SBPkd1rAc 트랜스-유전자가 머리에서 꼬리 방향으로 통합되는 것과 일치하고 3'프로브에서 7.{14}}kb 밴드로 나타났습니다. (그림 2b). 또한 내부 프로브는 EcoRI 삽입 부위로 인해 트랜스진의 9.{17}}kb 내인성 Pkd1 밴드와 6.{20}}kb 및 2.{22}}kb 밴드를 감지했습니다. 엑손 10에서 (그림 2b). 이 마우스는 게놈 중첩 구조 분석을 기반으로 하는 이식유전자의 완전한 사본을 포함했습니다.
패키지1(다낭성 신장 질환 1)성체 SBPkdlrAc 형질전환 마우스에서 기능의 획득. SBPkdlrAG 이식유전자 및 Pkd1 유전자의 발현은 다양한 기관에서 조사되었다. 트랜스진 및/또는 내인성 유전자의 전사체 수준의 정량화는 노던 블롯 분석에 의해 수행되었습니다(그림 3a). 예상대로 이식유전자와 내인성 유전자 전사체의 길이는 비슷했습니다(14.2kb). 대조군 GAPDH 발현에 기초하여, 모든 SBPkd1TAG 마우스 계통의 신장은 유사한 연령의 성인 신장(n=3)에서 정상 Pkdl 수준과 비교하여 전사체 발현이 일관되게 증가했습니다. 다른 형질전환 계통에 대한 신장 이식유전자 및 내인성 발현은 대조군 신장 내인성 Pkd1 수준보다 2-에서 15-배의 범위를 나타냈다(그림 3a). 특히, 형질전환 세포주 39(n {{11} }) 더 높은 Pkd1을 나타냄(다낭성 신장 질환 1)라인 3(n=3) 및 41(n =4)보다 수준이 높습니다. 또한, Northern blot 분석에 의해 측정된 Pkd1 발현 수준은 엑손 1과 2의 프라이머를 사용하여 실시간 PCR로 얻은 것과 상관관계가 있었습니다(그림 3b).
형질전환 유전자 발현량의 정량은 Pkd1의 5' untranslated region(B,β-globin promoter)과 exon 2에 프라이머를 이용하여 3가지 형질전환주에서 real-time PCR 및 semiquantitative RT-PCR로 수행하였다.(다낭성 신장 질환 1)(그림 3b). 트랜스제닉 마우스에서의 SBPkdlrAc 발현을 내부 표준으로서 S16 리보솜 단백질 유전자 생성물과 비교하였다. 반정량적 RT-PCR 증폭에 사용된 조건은 선형 범위 내에 있었습니다. Real-Time PCR 및 반정량적 RT-PCR에 의한 형질전환 유전자 발현은 다른 장기에 비해 모든 형질전환 계통의 신장에서 일관되고 구체적으로 가장 높은 발현을 나타냈다(도 3b 및 c). 개별 샘플에 대한 신장 발현 수준은 사용된 모든 검출 기술로 재현 가능했습니다. 최고 수준의 Pkd1(다낭성 신장 질환 1)39 및 41 라인에 대해 이식유전자 신장 발현을 측정했습니다. Pkd1 증가 여부를 모니터링하기 위해(다낭성 신장 질환 1)발현이 이식유전자 또는 내인성 유전자로부터 기인하는 경우, 3개의 이식유전자 계통의 동일한 마우스 그룹을 실시간 PCR에 의해 신장 Pkd1 이식유전자 발현 및 신장 Pkd1 총(트랜스유전자 및 내인성) 발현에 대해 비교하였다. 흥미롭게도, 3행에 비해 39행 및 41행은 증가된 Pkd1 이식유전자 신장 발현이 Pkd1 총 신장 발현과 유사하거나 그 이상임을 나타내었고, 이는 이러한 유도된 발현을 구체적으로 담당하는 것으로 이식유전자를 가리킨다. 다양한 장기(심장, 폐, 뇌, 간, 췌장 및 비장 포함)에서 SBPkd1rAg 이식유전자는 비장과 폐에서 때때로 검출되는 매우 약한 발현을 보였고 다른 기관에서는 거의 또는 검출할 수 없는 발현을 보였다(그림 3b). Real-Time PCR에 의한 정량화는 신장 발현에 비해 신장 외 조직에서 도입 유전자 발현 수준이 10- 1,{13}}배 더 낮은 것으로 나타났습니다(그림 3c). SBPkdlrA 이식유전자의 "SB" 조절 요소는 우선적인 신장 발현을 부여하였고; 이 특정 기관 분포는 또한 c-myc(SBM) 및 c-fos(SBF)에 연결된 이식유전자에서 사용될 때 결정되었습니다(36, 38).
Pkd1의 다운스트림 이펙터인 C-myc(다낭성 신장 질환 1)SBPkdlrAc 마우스의 신호 전달 경로. SBPkdlrAg 형질 전환 마우스의 세포 내 병인 기전에 대한 통찰력을 얻기 위해 우리는 인간 ADPKD에서 c-myc 탈조절에 대한 이전 관찰을 기반으로 c-myc 신장 발현 수준을 모니터링하려고 했습니다. (상염색체 우성다낭성 신장 질환)신장(22). 신장 분석은 3가지 형질전환 계통 3(n =4), 39(n =7) 및 41(n=4) 및 대조군에서 모두 수행되었습니다. (n=4). 도 3d에 나타낸 바와 같이, 유사한 연령의 대조군 마우스에 비해 SBPkd1TAG 마우스에서 유도된 내인성 c-myc의 실질적인 발현이 있다. 흥미롭게도 일부 SBPkd{12}c 신장에서 c-myc 발현 수준. 특히 39번째 줄은 신장 c-myc 발현에 의해 생산된 PKD SBM 형질전환 마우스 모델에서 관찰된 것과 유사한 수준에 도달했습니다.
PKD와 유사한 SBPkd1raG 마우스의 신장 기형(다낭성 신장 질환). To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size(Fig.4a and b). SBPkdl-AG kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n =25;n>각 라인에 대해 6개)가 여러 개의 세뇨관(T) 및 사구체 낭종(G)(그림 4d, f 및 g)으로 발달했습니다. 낭포는 피질 및 수질 영역의 세뇨관과 유두의 집합 세관에서 관찰되었습니다(그림 4d, f 및 g). 4d 및 e). 형질 전환 마우스는 낭성 및 비 낭성 세관과 빈번한 비대를 모두 포함하는 관상 상피 증식 (화살촉)을 표시했지만 심각도는 개별 마우스마다 다릅니다. 간질성 섬유증(F), 혈관주위 림프성 침윤물 및 단백성 캐스트(P)가 자주 관찰되었습니다(그림 4d 및 e).
증가된 Pkd1의 현지화 사이트를 보다 정확하게 정의하려면(다낭성 신장 질환 1)신장에서의 발현을 위해 우리는 이전에 사용된 exon 36-45 프로브를 사용하여 in situ hybridization을 수행했습니다(16). 혼성화 신호는 사구체 낭종뿐만 아니라 낭종 및 과형성 세뇨관 내벽 상피 세포에 특이적으로 국소화되었습니다. 또한, 일부 신호는 비낭성 또는 약간 확장된 세뇨관의 상피에서 보여 향후 낭성 변화를 겪을 예정인 세뇨관을 식별하는 것으로 보입니다(그림 4i 및 j).
신장 조직학적 분석은 또한 출생 시(n =8), 출생 후 10일(P10)(n =3), P20(n =5), P35(n { {7}}) 및 P45(n=3)는 같은 연령 그룹의 음성 한배 새끼(n 2 ~ 4)와 비교합니다. 흥미롭게도, 모든 신생아 형질전환 마우스는 대조군 음성 한배 새끼에 비해 관형 및 사구체 팽창을 나타냈으며(그림 4k 및 1), 이는 SBM 마우스 및 ADPKD에서 관찰된 바와 같이 자궁에서 신장 기형이 시작되었음을 나타냅니다. (상염색체 우성다낭성 신장 질환)환자. 세뇨관 및 사구체 확장은 나이가 들수록 크기와 수가 증가했습니다. P35까지, 형질전환 마우스는 더 심각한 증식과 사구체 경화증의 증거를 나타냈다. SBPkd1TAG 마우스에서 변경된 신장 생리 기능. 모든 형질전환 마우스의 신장 생리학적 기능은 PKD와 유사한 특징을 나타냄(다낭성 신장 질환), 형질전환되지 않은 한배 새끼는 이 질병에 걸리지 않았습니다. 출생 후 몇 개월 이내에 영향을 받은 동물은 만성 신부전증에 걸렸습니다. 이 동물들은 혈청 및 소변 수준, 혈액 요소 질소(BUN) 및 크레아티닌, 소변 삼투압 농도, 소변 단백질 및 이온 배설을 측정하여 신장 기능 매개변수에 대해 모니터링했습니다(표 1). 대조군과 비교하여 3가지 계통의 모든 마우스는 ADPKD에서 공통적으로 발견되는 농축 결함을 나타내었고 결과적으로 소변 BUN, 크레아티닌, 단백질 및 철 농도가 감소했습니다. 각 계통의 형질전환 SBPkd1TAG 창시자 및 자손(n 6)은 SDS-PAGE에 의해 소변 샘플의 단백뇨에 대해 정성적으로 모니터링되었습니다(그림 5). 2개월 이상 된 마우스는 나이가 들면서 진행되는 비선택적 단백뇨를 나타냈다. 또한, 혈청 BUN 및 혈청 크레아티닌 수치가 증가하여 신부전을 나타냈다(표 2). 만성 신부전증은 일반적으로 혈액학적 매개변수의 변경으로 이어지기 때문에 3~14개월령의 SBPkd1TAG 형질전환 마우스에서 이를 검사했습니다(표 2). 이 형질전환 마우스는 적혈구 수가 현저히 감소했고 헤모글로빈과 헤마토크릿이 정상 수준의 절반에 도달하여 빈혈이 나타났습니다. 망상적혈구의 백분율과 같은 다른 적혈구 매개변수는 예상대로 신장 결손에 의해 유도되었을 때 영향을 받지 않았습니다. 이 동물들은 5.{12}}5.{12}}.8개월령(n 42)에서 트랜스제닉 계통 39, 이후 14.{17}}.1개월(n 20) 및 11세에 신부전으로 일관되게 사망했습니다. .7 6.5개월(n 7), 각각 3행과 41행.
무화과. 1. 쥐 Pkd{1}}BAC의 도식적 표현 및 상세한 제한 지도 분석.
Pkd1의 게놈 DNA 소화 패턴(다낭성 신장 질환 1)-BAC는 Pkd1의 BAC와 비교되었습니다.(다낭성 신장 질환 1)129Sv 및 C57Bl/6J 근친 교배 마우스 계통에서 유전자좌. 대부분의 뮤린 Pkd1 유전자를 포함하는 7개의 프로브가 생성되었습니다.
(a) 엑손 1, (b) 엑손 2-3, (c) 엑손 7-15, (d) 엑손 15-20, (e) 엑손 25-34, (f) 엑손 36-45 및 (g) 엑손 45-46, 게놈 Pkd1에서 a~g로 라벨링됨(다낭성 신장 질환 1)표현 및 개별 오점.
Pkd{0}}BAC 및 뮤린 Pkd1의 게놈 DNA에 대한 제한 다이제스트(BamHI, EcoRI, HindIII 및 KpnI) 후 서던 블롯 분석(다낭성 신장 질환 1)유전자좌는 7개의 프로브 모두에서 동일한 패턴을 보여주었습니다. M, HindIII 마커; 129, 129/Sv; C57, C57Bl/6J.
논의
여기에서 우리는 쥐 Pkd{0}}BAC의 분리 및 특성을 보고합니다. 이 Pkd1(다낭성 신장 질환 1)유전자에 태그를 지정하고 조절 요소를 두 개의 연속적인 상동 재조합 이벤트에 의해 신장에 특이적으로 표적화하도록 대체했습니다. 이 새로운 SBPkd1TAG 유전자로 생산된 형질전환 마우스는 Pkd1 발현이 2-에서 15-배 증가했으며 PKD의 전형적인 초기 신장 형태학적 변경이 재현 가능하게 발달했습니다. 신장 기능 부전은 중년에 명백하며 생쥐는 신부전으로 조기에 사망합니다. 우리의 결과는 또한 이 표현형을 담당하는 Pkd1 과발현 메커니즘이 생체 내에서 c-myc의 활성화 신호에 의해 매개됨을 나타냅니다. 이 연구는 신장에서 뮤린 Pkd1 기능 증가가 PKD 신장 표현형을 생성하기에 충분함을 입증합니다. murine Pkd1 유전자는 인간처럼 복제되지 않기 때문에(27), 우리는 전체 Pkd1 유전자를 포함하는 BAC 클론을 직접 확인하고 분리했습니다. 129/Sv 뮤린 Pkd{11}}BAC의 완전한 특성화, 다른 두 가지 근친교배 마우스 균주와의 간접 비교를 통해 Pkd1 유전자좌의 무결성을 확인했습니다. Pkd{13}}BAC 삽입물에는 Pkd1 유전자의 업스트림 및 다운스트림 서열이 37~39kb 포함되어 있습니다. 우리의 분석은 이 BAC의 Pkd1 유전자가 추가 연구에 도움이 될 수 있는 진정한 뮤린 야생형 유전자좌임을 입증했습니다. ADPKD에서 낭종이 형성된다는 강력한 증거가 있지만 (상염색체 우성다낭성 신장 질환)정상 PKD1의 체세포 불활성화에 따른 이형접합성의 상실로 인해 발생할 수 있음(다낭성 신장 질환 1)대립 유전자(3, 21, 32), 낭포성 세뇨관 상피(22, 29)에서 폴리시스틴{3}} 발현이 지속되거나 심지어 증가한다는 암시적 증거도 있습니다. 후자의 관찰은 Pkd1 자체의 과발현이 방광 형성의 충분한 근접 원인인지에 대한 질문을 제기합니다. 인간 PKD1을 보유하는 형질전환 마우스에서(다낭성 신장 질환 1), TSC2, RAB 26, NTHL1 및 SLC9A3R2 유전자의 경우 소수의 마우스에서만 낭종이 발생했으며 30개 사본의 이식유전자에도 불구하고 성인기에 검출 가능한 이식유전자 발현은 없었습니다(31). 그러한 형질전환 마우스에서, 방광형성에서 Pkd1 과발현에 대한 명확한 역할을 확립하기가 어려웠다. 우리 모델은 인접 유전자가 없는 Pkd1 단독의 2~9개의 야생형 사본이 형질전환 마우스에 통합되었기 때문에 다릅니다. Pkd1 유전자가 제거된 수많은 마우스에 대해 설명된 바와 같이 Pkd1 유전자는 다양한 기관 또는 조직에서 필수적인 기능을 가지고 있기 때문에 Pkd1의 전신적 과발현은 추가적인 교란 효과를 초래할 수 있습니다. 결과적으로, 우리는 Pkd1을 신장에 구체적으로 표적화하는 접근 방식을 사용하여 Pkd1 기능 획득의 역할을 해결했습니다. 상동 재조합에 의해 우리는 먼저 Pkd1 상류 조절 영역을 "SB" 신장 제한 조절 요소로 대체하여 잠재적인 이차 피드백 루프 조절뿐만 아니라 성인기에 Pkd1에서 일반적으로 볼 수 있는 감소된 유전자 발현을 방지했습니다(36, 38). 둘째, 우리는 엑손 10에서 무음 점 돌연변이가 있는 쥐 Pkd1 이식유전자(Pkd1TAG)를 표시했지만 보존된 구조와 무결성을 가진 완전한 기능의 "야생형" 단백질이 생산되도록 하기 위해 에피토프 태그를 삽입하지 않았습니다. 이 변형된 BAC에서 SBPkd1TAG 단편을 Tsc2 유전자 및 BAC 벡터에서 정제하여 Tsc2 유전자에 의한 간섭을 방지하고 낭포성 표현형(8, 20, 28)을 유도할 수 있을 뿐만 아니라 원핵생물 서열(5).
4개의 서로 다른 SBPkd1TAG 형질전환 창시자 마우스와 3개의 독립적인 계통이 특정 신장 Pkd1을 사용하여 생산되었습니다.(다낭성 신장 질환 1)- 향상된 표현. 특히 놀라운 것은 이 형질전환 마우스에서 표현형의 완전한 침투입니다. SBPkd1TAG 창시자 및 마우스 계통은 ADPKD와 공통적으로 몇 가지 생리병리학적 특징을 공유했습니다. (상염색체 우성다낭성 신장 질환). 여기에는 상피 증식, 간질 섬유증 및 국소 간질 염증과 함께 피질, 수질 및 사구체의 낭종의 발달이 포함됩니다.
PKD 때문에(다낭성 신장 질환)표현형은 모든 다른 형질전환 창시자 마우스에서 일관되게 관찰되었으며 마우스 게놈으로의 이식유전자 통합은 무작위 현상이며, 표현형은 염색체 위치 효과로 인한 것이 아니라 증가된 Pkd1 발현에서만 발생합니다. 실제로, 모든 계통에서 Pkd1 이식유전자의 발현은 "SB" 요소에 의해 조절되는 다른 이식유전자에 대해 이전에 관찰된 바와 같이 신장이 제한된 것으로 입증되었다(36, 38). 더욱이, 이러한 증가된 Pkd1 발현은 간접적인 내인성 Pkd1 활성화에 의한 것이 아니라 이식유전자에 의해 야기되었다. 따라서 우리의 결과는 야생형 기능성 Pkd1의 기능 획득이 다중 신장 낭종을 생성할 수 있다는 분명한 증거를 제공합니다. 중요하게도, 이러한 SBPkd1TAG 마우스는 인간 PKD1 유전자의 마우스 오르토로그의 단독 과발현에 의해 생성된 첫 번째 마우스 모델을 구성합니다.
SBPkd1TAG 마우스는 Pkd1이(다낭성 신장 질환 1)과발현은 신장 방광 형성의 주요 병인 메커니즘입니다. 중요하게도, 신장에서 가장 높은 이식유전자 발현 수준은 표현형의 진행 및 중증도와 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 SBPkd1TAG 표현형의 발달에서 Pkd1 과발현이 생체 내에서 c-myc의 활성화를 신호할 가능성이 있음을 발견했습니다. 아마도 이 활성화는 단백질 분해 절단 및 핵 전위를 겪는 폴리시스틴-1 C-말단 꼬리를 통해 직접적일 수도 있습니다(7). 성체 마우스에서 c-myc의 향상된 신장 발현이 PKD를 유도하는 것으로 나타났기 때문에, Pkd1 신호전달 경로의 주요 다운스트림 이펙터로서 c-myc를 지지하는 것은 매우 일관적일 것입니다. 이 결과는 또한 모든 인간 ADPKD의 신장에서 c-myc 발현 증가에 대한 우리의 이전 연구 결과와 상관 관계가 있습니다. (상염색체 우성다낭성 신장 질환)분석(22). 종합하면, 이러한 결과는 c-myc가 Pkd1의 주요 매개체임을 나타냅니다.(다낭성 신장 질환 1)방광 형성. Pkd1 기능 획득 모델의 결과는 뮤린 Pkd1 반수체 부족 및 기능 상실과 함께 Pkd1 조절 장애가 방광 형성으로 이어질 수 있음을 나타냅니다(2, 19, 23-26, 31, 40).
심한 Pkd1(다낭성 신장 질환 1)Pkd1에 의해 유발된 마우스의 불균형(다낭성 신장 질환 1)절제 또는 형질전환 과발현은 신장 낭종의 조기 발병 및 빠른 진행을 일으키고 높은 비율의 세뇨관에 영향을 미칩니다. 대조적으로, haploinsufficiency와 같은 더 가벼운 Pkd1 불균형은 더 많은 초점 낭종으로 PKD의 더 느린 진행을 초래했습니다. 반대의 폴리시스틴{1}} 조절장애에 의한 유사한 표현형의 명백한 역설적 발달은 일반적인 결과, 즉 활성 폴리시스틴 다중단백질 복합체의 형성 또는 기능을 변경할 수 있는 상대적인 단백질 농도 불균형으로 설명될 수 있습니다. 종합하면, 우리의 결과와 다른 연구자의 결과는 ADPKD에서 낭종 형성의 메커니즘이 (상염색체 우성다낭성 신장 질환)기능의 획득, 기능 상실 및 유전자 투여 효과의 세 가지 병인 메커니즘에서 발생할 수 있습니다. 새로운 SBPkd1TAG 마우스는 PKD의 병태생리학에 대한 주요 통찰력을 제공할 수 있는 강력한 신장 낭형성 모델을 구성합니다(다낭성 신장 질환), 패키지1(다낭성 신장 질환 1)신호 전달 경로 및 상호 작용하는 파트너. 이 모델의 연구는 또한 Pkd1 다량체 복합체 내에서 정상적인 단백질 균형을 회복하기 위한 새로운 치료 전략의 개발로 이어질 수 있습니다.
참조
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