선천성 심장병의 신경보호 현황 1부

추상적인:

세포질에 이소성 DNA가 존재하면 염증과 세포 사멸이 유도됩니다. 핵 DNA가 세포질로 누출되는 것은 주로 순환형 GMP-AMP 합성효소(cGAS)에 의해 감지될 수 있다는 것이 널리 보고되었습니다.

DNA는 각 사람의 유전 정보를 지정하는 분자이며 우리의 모든 세포에서 발견됩니다. 최근 연구에 따르면 DNA는 특정 경로를 통해 세포질로 누출되어 기억에 영향을 줄 수 있습니다.

이 현상은 노인과 인지 장애가 있는 사람들에게 흔히 나타납니다. DNA가 세포질로 누출되면 세포 내 정상적인 기능을 방해하고 기억 상실 및 인지 장애의 위험을 증가시킵니다.

그러나 우리는 이것에 대해 우울하거나 절망감을 느낄 필요가 없습니다. 건강한 뇌를 유지하는 데 도움이 되는 기억력과 인지 능력을 향상시키는 방법에는 여러 가지가 있습니다.

첫째, 건강한 생활방식을 유지해야 합니다. 여기에는 균형 잡힌 식사, 충분한 수면, 적당한 운동, 스트레스 감소가 포함됩니다. 이러한 관행은 뇌 건강을 촉진하여 DNA 누출을 방지하고 기억력을 향상시킵니다.

둘째, 인지훈련이 필요하다. 여기에는 수학 게임, 독서, 새로운 기술 학습 등이 포함될 수 있습니다. 이러한 활동은 뇌를 자극하고 신경 발생을 촉진하여 DNA 누출을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다.

마지막으로, 긍정적인 태도를 유지하십시오. 정서적 불안정과 과도한 스트레스는 DNA 누출을 촉진하는 뇌 화학의 변화를 일으킬 수 있습니다. 그러므로 우리는 인생의 어려움에 긍정적으로 대처하고 낙관적인 태도를 유지하는 법을 배워야 합니다.

요약하면, 세포질로의 DNA 누출이 기억에 영향을 미칠 수 있지만 올바른 생활 방식을 채택하고 인지 훈련에 참여하며 긍정적인 사고 방식을 유지함으로써 뇌 건강을 개선하고 DNA 누출을 방지하며 궁극적으로 기억력을 향상시킬 수 있습니다. 기억력과 인지능력. 기억력 향상이 필요함을 알 수 있는데, 시스탄체 데저티콜라는 기억력 향상이라는 독특한 효능이 많은 중국 전통 약재이기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. Cistanche Deserticola의 효능은 탄닌산, 다당류, 플라보노이드 배당체 등 포함된 다양한 활성 성분에서 비롯됩니다. 이러한 성분은 다양한 경로를 통해 뇌 건강을 촉진할 수 있습니다.

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기억력을 향상시키는 10가지 방법을 알아보세요

우리는 최근 리소좀 분해를 피한 미토콘드리아 유래 세포질 이중 가닥 DNA(dsDNA)가 배양된 세포와 생체 내에서 상당한 세포 독성을 유도한다고 보고했습니다. 세포질 미토콘드리아 DNA는 다양한 질병 및 장애에 관여하는 것으로 추정되며, 이를 확인하는 논문이 점점 더 많이 발표되고 있습니다. 반면, 세포질 내 미토콘드리아 DNA를 평가하는 현재 방법은 정량적이지 않을 수 있습니다.

여기서는 이소성 미토콘드리아 DNA 세포를 평가하는 방법을 자세히 소개합니다. 이 방법은 기초 연구뿐만 아니라 노화, 파킨슨병, 알츠하이머병, 심부전, 자가면역 질환, 암 및 기타 질환에 대한 연구에도 유용합니다.

키워드: 이소성 DNA; 미토콘드리아 DNA; 미토콘드리아 전사 인자 A(TFAM), 파킨슨병.

1. 소개

DNA에는 생존과 유전에 관한 중요한 정보가 담겨 있으며, 산화제, 돌연변이 유발물질 등 다양한 스트레스 요인으로부터 보호해야 합니다. 진핵세포에는 호기호흡을 통해 많은 활성산소종과 함께 에너지를 생산하는 미토콘드리아가 포함되어 있다.

따라서 진핵세포에서 DNA는 각각 핵막 또는 미토콘드리아 막 내부에 포장된 핵 또는 미토콘드리아에 존재합니다. 그러나 DNA는 바이러스 감염 또는 비바이러스 감염과 같은 특정 조건 하에서 세포질에 존재할 수 있습니다 [1- 4].

일부 비감염성 조건(예: 노화 또는 다양한 노화 관련 장애 또는 암)에서도 DNA가 핵이나 미토콘드리아에서 세포질로 누출될 수 있습니다[5-7].

세포질의 DNA는 염증을 일으키고 세포에 독성을 나타낼 수 있습니다. 핵 DNA가 세포질로 누출되면 염증, 세포독성 및 노화 관련 분비 표현형(SASP)이 주로 인터페론 유전자(STING) 경로의 순환 GMP-AMP 합성효소(cGAS) 자극제를 통해 유발된다는 것이 널리 보고되었습니다. 5,6].

우리는 최근 리소좀 분해에서 벗어나는 미토콘드리아 기원의 세포질 이중 가닥 DNA(dsDNA)가 파킨슨병의 세포 모델에서 세포독성과 신경변성을 유도하는 것으로 나타났다고 보고했습니다. 그러한 이소성 DNA의 존재 또는 증가는 종종 DNA 누출 자체의 증가가 아니라 대표적인 현미경 이미지 및 정황 증거에 의해 표시되었습니다.

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이 이소성 DNA에 대한 평가는 기초연구뿐만 아니라 노화 및 파킨슨병, 알츠하이머병, 근위축성측삭경화증, 심부전, 자가면역질환, 당뇨병, 비알코올성 지방간염(NASH) 및 암. cGAS-STING 경로는 노화뿐만 아니라 이러한 질병의 발병에도 중요한 것으로 보고되었습니다[8-17].

아마도 미토콘드리아 주변의 산화 환경과 미토콘드리아 DNA에 대한 효율적인 DNA 복구 시스템의 부족으로 인해 미토콘드리아 DNA는 핵 DNA보다 돌연변이나 손상에 훨씬 더 취약합니다[18,19].

핵 DNA와 달리 미토콘드리아 DNA는 단일 세포에 여러 복사본으로 존재하며 필요에 따라 합성됩니다. 따라서 미토콘드리아 DNA는 노화 또는 노화 관련 질환, 미토콘드리아 기능 장애와 같은 악성 조건에서 세포질로 누출될 가능성이 훨씬 더 클 수 있습니다. , 또는 암.

이러한 세포질 미토콘드리아 DNA의 검출 및 측정은 다양한 질병 및 노화의 발병기전을 이해하는 데 중요할 수 있으며 바이오마커 및 치료 표적이 될 수 있습니다.

우리는 세포질로 누출되는 이소성 미토콘드리아 DNA를 평가하는 반정량적 방법을 개발했으며, 여기서는 그 방법을 자세히 설명합니다. 이 논문은 미토콘드리아 DNA 누출에 대한 객관적인 평가를 가능하게 하며 다양한 질병 병리학 연구에 유용합니다.

2. 재료 및 방법

2.1. 세포주, siRNA 처리 및 정량적 PCR(qPCR) 분석

HeLa 세포는 여성 환자의 자궁경부암 세포에서 유래되었습니다(ATCC,CCL-2). HeLa 세포는 10% FBS(Biowest, Nuaillé, France)와 페니실린-스트렙토마이신 용액이 보충된 Dulbecco's Modified EagleMedium(DMEM)(Nacalai Tesque, 일본 교토)에서 5% CO2 하에서 37℃에서 배양되었습니다( 100 단위/mL페니실린 G 및 100μg/mL 스트렙토마이신 황산염, Wako, 오사카, 일본).

형질감염 하루 전에 HeLa 세포를 600개 세포/μL의 밀도로 플레이팅했습니다. 관심 유전자의 발현은 Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent(ThermoFisher Scientific)에서 Stealth RNAi siRNA(미토콘드리아 전사 인자 A, TFAM: HSS144251, glucocerebrosidase, GBA: HSS178140, Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 HeLa 세포에서 침묵되었습니다. 제조업체의 지침(최종 RNA 농도는 10nM)입니다.

siRNA 녹다운 3일 후, 제조업체의 지침(Thermo Fisher Scientific)에 따라 TRIzolreagent를 사용하여 전체 세포 RNA를 분리했습니다. cDNA템플릿은 올리고(dT)20 프라이머가 포함된 ProtoScript II First StrandcDNA 합성 키트(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)를 사용하여 정제된 RNA로부터 합성되었습니다. qPCR은 TB Green Premix Ex Taq II(Takara Bio, Kusatsu)를 사용하여 수행되었습니다. , Japan)을 사용하여 Thermal Cycler Dice Real Time System Lite(Takara Bio)에서 분석했습니다. 본 연구에 사용된 PCR 프라이머는 GBA 순방향(TGCTGCTCTCAACATCCTTGCC), GBA 역방향(TAGGTGCGGATGGAGAAGTCAC), TFAM 순방향(GGCAAGTTGTCCAAAGAAACC), TFAM 역방향(GCATCTGGGTTCTGAGCTTTA), Glyceraldehyde{1}}Phosphate Dehydrogenase(GAPDH) 순방향(CAGCCTCAAGATCATCAGCA) 및 GAPDH이다. 역방향(TGTGGTCATGAGTCCTTCCA).

GraphPad Prism 소프트웨어 버전 9.3.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 사용하여 통계 분석을 수행했습니다. 양측 스튜던트 t-테스트는 두 그룹 간의 산술 평균을 비교하는 데 사용되었습니다. 데이터는 평균과 평균의 ± 표준 오차로 표시됩니다.

2.2. 이소성 미토콘드리아 DNA의 면역형광 검출 및 이미지 분석

형질감염 하루 전, HeLa 세포를 600개 세포/μL의 밀도로 플레이팅했습니다. 관심 유전자의 발현은 다음 지침에 따라 Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent(ThermoFisher Scientific)에서 Stealth RNAi siRNA(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 HeLa 세포에서 침묵되었습니다. 제조업체의 지침(최종 RNA 농도 10nM).

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siRNA 녹다운 3일 후, 세포에 면역형광 염색을 실시했습니다. 미토콘드리아 DNA 검출용, 항-dsDNA 항체(Abcam,Cambridge, UK, 클론 35I9, Cat# ab27156, RRID: AB_470907 또는 EMD Millipore, Billerica, MA, USA, 클론 AC-30-10 , Cat# CBL186, RRID: AB_11213573)는 Hoechst 33258, DAPI 또는 Picogreen보다 더 나은 신호 대 잡음비를 보여주었습니다. 여기에서 우리는 항dsDNA 항체(35I9 DNA)(Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB{15}}), 항히스톤-H2B 항체(Abcam, Cat# ab134211), 항열 항체의 세 가지 일차 항체를 결합했습니다. 충격 단백질-60(Hsp60)항체(Abcam, Cat# ab46798, RRID: AB_881444).

다른 항체를 선택하거나 히스톤으로 형광 태그를 지정하거나 Hsp60을 대안으로 사용할 수 있지만 각 조합에 대한 삼중 염색 조건을 최적화하는 것이 필요합니다.

세포를 인산염완충식염수(PBS)로 두 번 세척하고 얼음처럼 차가운 메탄올로 4°C에서 10분 동안 고정했습니다. 대안으로 4% 파라포름알데히드(PFA)를 고정에 사용할 수 있지만 배경 신호는 PFA 고정 샘플에서는 훨씬 더 큽니다. 고정 후, 세포를 Tween 20(PBST)이 포함된 인산염 완충 식염수로 각각 5분간 3회 세척했습니다. 세포는 0.2%(w/v) Triton X-100를 함유한 PBS로 10분 동안 투과화되었습니다.

PBST로 매번 5분 동안 3회 세척한 후, 세포를 PBST 중의 2% (w/v) 소 혈청 알부민(BSA)과 함께 30분 동안 배양하였다. 세포를 PBST O/N의 2%(w/v) BSA에 희석된 단일 일차 항체인 항-히스톤-H2B 항체(1/400, Abcam, Cat# ab134211)와 함께 4℃에서 배양했습니다. 매번 5분씩 PBST로 3회 세척한 후 세포를 Alexa Fluor 488-AffiniPure Donkey 항-Chicken IgY(IgG)(H+L)(1/200, Wako, Cat# {{17)과 함께 배양했습니다. }}) 실온(RT)에서 1시간 동안 PBST 내 2%(w/v) BSA로 희석되었습니다.

PBST로 매회 5분간 3회 세척한 후 세포를 1차 항체, 항-dsDNA 항체(35I9 DNA)(1/800, Abcam,Cat# ab27156, RRID: AB_470907) 및 항-dsDNA 항체(35I9 DNA)와 함께 배양했습니다. - PBST 중 2%(w/v) BSA에 희석된 Hsp60 항체(1/400, Abcam, Cat# ab46798,RRID: AB{13}})를 실온에서 1시간 동안 또는 실온에서 밤새(O/N) 적용했습니다. 4˚C.

매번 5분 동안 PBST로 3회 세척한 후, 세포를 고도로 교차 흡착된 Alexa Fluor 680-접합 Donkey 항-토끼 IgG(H+L)(1/200, Thermo Fisher Scientific, Cat# A10043)와 함께 배양했습니다. , RRID: AB_2534018) 및 2%(w/v)로 희석된 Donkeyanti-Mouse IgG H&L(Alexa Fluor® 594)(1/200, Abcam Cat# ab150108, RRID: AB{14}}) RT에서 1시간 동안 PBST의 BSA.

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