선천성 심장병의 신경보호 현황 3부
Mar 08, 2024
3.2. 이소성 미토콘드리아 DNA의 반정량적 평가
Hsp60 염색(미토콘드리아 기질) 및 히스톤-H2B 염색(핵 마커) 이미지를 dsDNA 염색 이미지에서 뺍니다. 그런 다음 이미지] 소프트웨어(국립 보건원)의 "AdjustThreshold" 기능을 사용하여 이미지를 이진화했습니다.
미토콘드리아는 세포에 필요한 에너지를 공급하기 위해 ATP를 합성하는 역할을 하는 세포 내 에너지 공장입니다. 미토콘드리아 기질은 미토콘드리아의 내부액체로서 다양한 효소와 이온을 함유하고 있으며 미토콘드리아의 다양한 생화학적 반응이 일어나는 핵심 부위이다. 기억은 인간의 가장 중요한 인지 능력 중 하나이다. 이 둘은 서로 관련이 없어 보일 수도 있지만 밀접한 관련이 있습니다.
연구에 따르면 미토콘드리아 기질과 기억 사이의 상호 작용이 밝혀졌습니다. 미토콘드리아 기질의 효소와 이온은 신경 세포의 에너지 대사와 이온 채널 상태를 조절하여 신경 세포의 흥분성에 직접적인 영향을 미쳐 기억에 영향을 줄 수 있습니다. 또한, 미토콘드리아 기질에는 다양한 신호 분자가 있는데, 이는 뉴런의 축색돌기와 시냅스를 통해 하류 뉴런으로 전달될 수 있으며, 이는 뉴런의 신호 전달 효율에 영향을 미쳐 기억의 형성과 강화에 영향을 줍니다.
동시에, 기억 활동은 미토콘드리아 기질의 상태에도 직접적인 영향을 미칩니다. 기억 활동은 뉴런의 에너지 소비를 증가시키고 미토콘드리아 기질의 산화환원 반응을 촉진하여 미토콘드리아의 대사 수준과 세포내 이온 균형에 영향을 미치고 뉴런의 흥분성과 신호 전달 효율에도 영향을 미칩니다.
따라서 좋은 미토콘드리아 건강을 유지하는 것은 좋은 기억 기능을 유지하는 데 중요합니다. 규칙적인 식사, 적당한 운동, 적절한 수면 등 좋은 생활습관을 유지함으로써 미토콘드리아 기질의 건강을 유지하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 또한, 미토콘드리아 기질 내에서 생화학적 반응과 신호 전달을 촉진하기 위한 적절한 약물 개입을 통해 기억 기능이 향상될 수도 있습니다.
일상생활에서 우리는 독서, 공부, 사고, 게임 등 다양한 방법으로 기억력을 발휘할 수 있습니다. 동시에 미토콘드리아 기질의 건강을 더 잘 유지하려면 건강을 유지하는 데도 주의를 기울여야 합니다. 나는 이러한 노력을 통해 우리가 반드시 더 나은 기억력을 갖게 될 것이며 삶과 일에서 다양한 어려움에 더 잘 대처할 수 있을 것이라고 믿습니다. 기억력 향상이 필요하다고 볼 수 있는데, Cistanche Deserticola는 아세틸콜린 수치와 성장인자 수치를 높이는 등 신경전달물질의 균형도 조절할 수 있기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 이 물질은 기억과 학습에 매우 중요합니다. 또한 Cistanche Deserticola는 혈류를 개선하고 산소 전달을 촉진하여 뇌에 충분한 영양분과 에너지를 공급하여 뇌 활력과 지구력을 향상시킬 수 있습니다.
"Analyze-Analyze Particles" 기능을 사용하여 2~20 um'(원형도 0.1-1.0) 크기 범위의 dsDNA puncta를 선택했습니다. 필요한 경우 최종 카운트를 위해 원본 이미지를 검사했습니다. 히스톤 H2B의 신호가 작다면. 그런 다음 뺄셈된 이미지는 도넛과 같은 구조를 보여주었습니다.
이는 핵 기원의 세포질 dsDNA를 나타내며 미토콘드리아 기원의 세포질 dsDNA 양에서 제거되어야 합니다. 크기 범위는 세포 유형이나 조직학적 표본의 출처에 따라 수정될 수 있습니다. 그림 1E는 이소성 미토콘드리아 DNA 계산의 예를 보여줍니다.
1B D를 사용하여 점을 찍습니다.
대안적으로, dsDNA 염색 이미지에서 Hsp60 염색 이미지를 뺍니다. 그런 다음 "Adjust-Threshold "Analyze-Analyze Particles" 기능을 사용하여 dsDNA 점점의 수를 계산했습니다. 이어서 히스톤-H2B 신호가 없는 dsDNA 점점을 직접 관찰하여 계산했습니다. 후자의 방법은 히스톤-H2B 이미지를 분석할 때 적합합니다. 낮은 신호 대 잡음비를 보여줍니다.
전체적으로, 이 방법은 세포질로 누출되는 이소성 미토콘드리아 DNA를 명확하게 보여줄 수 있으며 세포에서 이러한 이소성 미토콘드리아 DNA에 대한 객관적이고 통계적인 평가를 허용합니다.
4. 토론
우리 연구에서 우리는 세포질 미토콘드리아 DNA의 계산을 가능하게 하는 방법을 개발했습니다. 면역형광법을 사용하여 세포질 미토콘드리아 DNA를 검출하는 방법이 보고되었으나 대부분의 경우 세포질 미토콘드리아 DNA를 평가하기 위한 정량적 방법은 아니었습니다[15,25]. 또 다른 연구에서는 순환하는 미토콘드리아 DNA를 정량하기 위해 액적 PCR을 수행했습니다[9].
최근에는 Sato et al. [26,27] Lamin B1(LMNB1) 항체를 핵 구조 마커로 사용하고 시토크롬 C 산화효소 소단위 4(COX4)를 미토콘드리아 구조 마커로 사용하여 면역형광현미경으로 세포질 DNA를 평가하는 탁월한 프로토콜을 발표했습니다. 이 프로토콜은 핵 기원의 세포질 dsDNA를 정량화하는 데 매우 유용한 것 같습니다.
그러나 내부 및 외부 마커를 모두 포함하여 COX4 또는 기타 미토콘드리아 막 마커를 시도했을 때 미토콘드리아와 세포질을 정확하게 구별하는 것이 매우 어려웠습니다.
예를 들어, 미토콘드리아 막 마커를 사용하여 원형 신호를 관찰하고 내부의 dsDNA 신호를 관찰하면 이 dsDNA는 원형 미토콘드리아 내부의 미토콘드리아 DNA(정상) 또는 도넛형 미토콘드리아 외부의 세포질 미토콘드리아 DNA(이소성)를 나타낼 수 있습니다. 따라서 우리는 Hsp60을 미토콘드리아 기질을 표지하는 마커로 사용하여 세포질의 이소성 미토콘드리아 DNA를 평가했습니다.
최근 리뷰[23]에 기술된 바와 같이, 핵 기원의 세포질dsDNA에는 다양한 유형이 있으며, 이들 중 대부분은 히스톤 마커에 대해 양성입니다. 삼중염색에 사용되는 항체 조합의 한계로 인해 히스톤 마커로 히스톤 H2Ba를 사용하였습니다.
그러나 이러한 제한이 해결된다면 H2AX는 핵 기원의 세포질 dsDNA에 대한 더 나은 마커가 될 수 있습니다. 히스톤-H2B 음성 세포질 dsDNA는 본 연구에 사용된 대조 HeLa 세포에서는 거의 관찰되지 않았지만, 다른 세포주나 조건을 사용하는 경우 핵 기원의 dsDNA가 존재할 수 있습니다.
최근 논문에서 사용된 미토콘드리아 DNA의 in situ hybridization은 정성적 평가에는 적합하지만 정량적 평가에는 in situ hybridization을 활용하기 어려울 수 있습니다 [8].
현장 하이브리드화는 표본을 고온에 노출시켜 표본의 일부 부분에 변형이나 소음이 발생할 수 있습니다. 반면, 본 논문에서 제시하는 면역세포화학적 방법은 배경잡음이 적은 신호를 얻을 수 있다. 최근 논문에서는 파킨슨병 모델로 사용된 인간 세포와 제브라피시에서 미토콘드리아 DNA가 세포질로 누출되어 독성을 나타내는 것을 보여주었다. 세포. 우리는 또한 파킨슨병 환자의 사후 뇌 조직에서 세포질 미토콘드리아 DNA의 양이 증가하는 것을 관찰했습니다[8].
이러한 증거는 미토콘드리아에서 누출된 이소성 미토콘드리아 DNA의 양이 증가하면 급성 및 만성 염증을 유발하여 파킨슨병 및 심부전을 비롯한 다양한 질병을 유발할 수 있음을 시사합니다. 따라서 세포질 DNA 분해의 상향 조절 또는 해당 센서의 억제는 이러한 질병에 대한 잠재적인 치료 표적이 될 수 있습니다[8,28].
이소성 미토콘드리아 DNA의 정량적 평가를 위해 본 논문에서 소개된 방법은 이 분야의 추가 연구를 위한 중요한 도구 역할을 합니다.
저자 기여: HM과 MTH는 가설을 공식화하고, 대부분의 실험을 설계하고, 실험을 수행하고, 데이터를 분석하고, 원고를 작성했습니다. NM에서는 배양세포에 관한 실험을 수행했습니다. 모든 저자는 출판된 원고 버전을 읽고 이에 동의했습니다.
자금: 이 연구는 AMED(보조금 번호 JP21gm6110028 및 JP19dm0107154(HM)), 다케다 과학 재단(HM), JSPS KAKENHI(보조금 번호 JP14516799(HM), JP 16690735(HM) 및 JP 17925674(HM)의 보조금으로 지원되었습니다. ), JST(Moonshot R&D; 승인 번호JPMJMS2024(HM)) 및 TBRF의 보조금(승인 번호 TBRF-RF 21-135(HM)).
데이터 가용성 설명: 이 원고에 설명된 데이터와 도구는 요청 시 제공됩니다.
감사의 말: 유익한 토론에 참여하고 지속적인 지원을 제공해 주신 Shinano Kobayashi에게 감사드립니다. 우리는 MH(TBRF-RF 21-135)에 외국 연구자들을 위한 TBRF 박사후 연구원을 제공한 도쿄 생화학 연구 재단(TBRF)에 감사드립니다.
이해 상충: 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
참고자료
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