선천성 심장병의 신경보호 현황 2부
Mar 08, 2024
그런 다음 ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 현미경 이미지를 이미지 계산했습니다. Hsp60의 신호에 "x"를 곱했습니다.
Hsp60은 인체에서 중요한 생물학적 역할을 하는 중요한 단백질 분자입니다. 최근 몇 년간의 연구에 따르면 Hsp60의 존재는 인간의 기억과 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났습니다.
Hsp60은 주로 단백질 접힘, 풀림, 안정화 및 분해에 관여하는 분자 샤페론 단백질입니다. 이러한 과정은 인체의 정상적인 신진대사와 세포 기능에 매우 중요합니다. 동시에 Hsp60은 항산화, 항염증, 면역조절 효과도 가지고 있어 인간의 건강과 면역 체계의 균형을 유지하는 데 큰 역할을 합니다.
연구에 따르면 Hsp60은 기억 형성 및 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 학습과 기억 과정에서 뇌 세포는 많은 수의 Hsp60 분자를 생성합니다. 이 분자는 외부 환경의 간섭과 손상으로부터 세포를 보호하여 학습과 기억의 원활한 진행을 보장할 수 있습니다. 또한 Hsp60은 뇌 세포의 신호 전달과 뉴런의 발달을 변화시켜 인간의 사고와 행동에 영향을 미칠 수 있으며 인지 및 스트레스 저항에도 긍정적인 영향을 미칩니다.
Hsp60의 역할이 인체에 긍정적인 영향을 미쳤지만, Hsp60의 과잉과 결핍 모두 인체 건강에 부정적인 영향을 미칠 수 있다는 점을 인식해야 합니다. 그러므로 우리는 인간 건강에서 Hsp60의 위치와 역할을 더 잘 이해하기 위해 인체의 다양한 생리학적, 병리학적 조건에서 Hsp60의 메커니즘을 적극적으로 탐구하고 연구해야 합니다. 기억력 향상이 필요하다는 것을 알 수 있는데, 시스탄체 데저티콜라에는 항산화, 항염증, 항노화 효과가 있어 뇌의 산화 및 염증 반응을 감소시켜 뇌를 보호할 수 있기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 신경계의 건강. 또한 Cistanche Deserticola는 신경 세포의 성장과 복구를 촉진하여 신경 네트워크의 연결성과 기능을 향상시킬 수 있습니다. 이러한 효과는 기억력, 학습 능력, 사고 속도를 향상시키는 데 도움이 될 수 있으며, 인지 기능 장애 및 신경퇴행성 질환의 발병을 예방할 수도 있습니다.
"x" 값은 다음과 같이 결정되었습니다: 대조군의 미토콘드리아 DNA 신호에서 "x" 접힌 Hsp60 신호를 빼면 미토콘드리아 DNA 값이 0 이하가 되었습니다. 히스톤 H2B의 신호에 "y"를 곱했습니다.
"y" 값은 다음과 같이 결정되었습니다. 대조군의 핵 DNA 신호에서 "y" 접힌 히스톤-H2B 신호를 빼면 핵 DNA 값이 0보다 작거나 같습니다. 곱셈을 통해 배경 신호가 높아지면 곱해진 이미지의 대비를 모든 샘플에서 동일한 조건으로 조정할 수 있습니다.
곱해진 Hsp60 및 히스톤 H2B의 조정된 이미지를 제외한 dsDNA 염색 이미지를 후속 분석에 사용했습니다. "Adjust-Threshold" 기능을 사용하여 이러한 이미지를 이진화했습니다. 우리는 2~20 µm2(원형도0.1–1.0) 크기 범위의 dsDNA 점점을 선택하고 "입자 분석-입자 분석" 기능을 사용하여 개수를 계산했습니다.
2.3. 전자현미경
형질감염 하루 전, HeLa 세포를 600개 세포/μL의 밀도로 플레이팅했습니다. 관심 유전자의 발현은 다음 지침에 따라 Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent(ThermoFisher Scientific)에서 Stealth RNAi siRNA(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 HeLa 세포에서 침묵되었습니다. 제조업체의 지침(최종 RNA 농도 10nM).
siRNA 녹다운 4일 후, 세포는 고정되었습니다. 세포 배양 샘플은 37oC에서 0.1 M 인산염 완충액(pH 7.4)에 2% PFA와 2% 글루타르알데히드로 고정된 후 4 ◦ C 냉장고에 30분 동안 보관하세요. 샘플을 0.1 M 인산 완충액의 2% 글루타르알데히드에 밤새 4°C에서 고정했습니다. 샘플을 0.1 M 인산염 완충액으로 30분 동안 3회 세척한 후 0.1 M 인산염 완충액에 용해된 2% 사산화오스뮴으로 4℃에서 1시간 동안 후고정시켰습니다.
시료를 탈수된 에탄올 용액으로 처리한 후 레진(Quetol-812, Nisshin EM Co., Tokyo, Japan)으로 옮기고 60oC에서 48시간 동안 중합시켰다. 중합된 수지를 초박절편기(Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)를 사용하여 다이아몬드 칼로 초박형 70-nm 섹션으로 절단한 다음 구리 그리드에 장착했습니다.
절편을 2% 우라닐 아세테이트로 실온에서 15분간 염색한 후 증류수로 세척한 후 납염색액(Sigma-Aldrich, Tokyo, Japan)으로 실온에서 3분간 2차 염색하였다.
그리드는 투과전자현미경(JEM-1400Plus, JEOL Ltd)으로 관찰되었습니다.., Tokyo, Japan)의 가속 전압 80 kV(제브라피시 뇌) 또는 100 kV(셀)에서 CCD(전하결합소자) 카메라(EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.)를 사용하여 이미지를 기록했습니다. .
2.4. 면역전자현미경
금 디스크에 있는 샘플은 -175°C의 액체 프로판에서 동결되었습니다. 샘플을 냉동한 후 에탄올에 용해된 1% 탄닌산과 2% 증류수로 -80℃에서 24시간 동안 동결 대체했습니다.
그런 다음 샘플을 -20°C에서 4시간 동안 보관한 후 4°C에서 1시간 동안 배양했습니다. 다음으로 시료를 무수 에탄올에서 30분 동안 3회 탈수하였다. 매회, 에탄올과 수지의 50:50 혼합물(LR 백색: London Resin Co. Ltd., Berkshire, UK)을 4℃에서 1시간 동안 침투시켰다. 샘플을 새로운 100% 레진으로 옮기고 4℃에서 30분간 배양했으며 이 과정을 3회 반복했습니다.
샘플을 새로운 100% 수지로 옮기고 50o CO/N에서 중합했습니다. 중합된 수지를 초박절편기(Ultracut UCT; Leica)를 사용하여 다이아몬드 칼로 90 nm에서 초박형으로 절편하고 절편을 니켈 그리드 위에 배치했습니다. 그리드를 4°CO/N에서 1% BSA/PBS 내 항-dsDNA 항체(35I9 DNA)(1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB{10}})와 함께 배양한 후 각각 1분 동안 1% BSA/PBS.
이어서 이를 {{0}}nm 금 입자(염소 항-마우스 IgG 다중클론항체)에 접합된 2차 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 배양했습니다. PBS로 헹군 후, 그리드를 2% 글루타르알데히드 0.1M 카코딜레이트 완충액에 넣었습니다.
그 후, 그리드를 건조시킨 후 2% 우라닐 아세테이트로 15분 동안 염색하고 납 염색 용액(Sigma-Aldrich)으로 실온에서 3분간 염색했습니다. 그리드는 투과전자현미경(JEM-1400)을 통해 관찰되었습니다. 플러스; JEOLLtd.) 가속 전압 100kV에서. 디지털 이미지는 CCD 카메라(EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.)를 사용하여 획득했습니다.
3. 결과
3.1. TFAM 또는 GBA 감소는 이소성 미토콘드리아 DNA의 증가를 유도합니다
먼저, 우리는 TFAM 단백질이 siRNA에 의해 녹다운된 HeLa 세포에서 미토콘드리아 유래 세포질 DNA의 검출 예를 보여주었습니다(그림 1A). TFAM은 핵심 미토콘드리아 전사 인자이며 미토콘드리아 DNA 복제 및 복구에도 기능합니다[20] .
이 유전자의 서열 다형성은 파킨슨병과 관련이 있는 것으로 보고되었습니다[21,22]. TFAM 단백질 녹다운 3일 후, HeLa 세포의 세포질에서 많은 이중 가닥 DNA 점이 검출되었습니다.
히스톤은 세포질 내 핵 유래 DNA에 대한 양성 표지자이고, 세포질 내 미토콘드리아 DNA 및 미토콘드리아 유래 DNA에 대한 음성 표지자입니다[23]. 이 점들은 히스톤과 함께 위치하지 않았으며, 이는 이들이 핵 유래 DNA가 아님을 시사합니다. 더욱이, 이러한 세포질 이소성 DNA 점 중 일부는 미토콘드리아 기질의 마커인 Hsp60과 동일 위치에 위치하지 않았으며 이는 이들이 미토콘드리아 외부에 존재함을 나타냅니다(그림 1B, C).
전자현미경은 또한 이소성 DNA가 미토콘드리아에서 누출되었음을 보여주었습니다(그림 2A, B). 요약하면, TFAM 녹다운에 의한 세포질 내 이소성 DNA 도트의 증가는 미토콘드리아에서 누출되는 미토콘드리아 DNA 때문이었습니다. 둘째, GBA 단백질이 siRNA에 의해 녹다운된 HeLa 세포에서 미토콘드리아 유래 세포질 DNA를 검출하는 또 다른 예를 보여주었습니다. (그림 1A).
GBA는 고셔병의 원인 유전자이지만, GBA의 이형접합성 돌연변이도 파킨슨병의 위험인자이다[24]. GBA 단백질 녹다운 3일 후 HeLa 세포의 세포질에서 많은 이중 가닥 DNA 점이 검출되었습니다. 일부 DNA 점은 히스톤과 함께 위치하여 핵 유래 DNA임을 시사합니다.
다른 DNA 점은 히스톤과 함께 위치하지 않았으며, 이는 핵 유래 DNA가 아니라 미토콘드리아 유래 DNA임을 나타냅니다(그림 1D). 요약하면, GBA 녹다운에 의한 세포질 내 이소성 DNA 점의 증가는 적어도 부분적으로 미토콘드리아에서 누출되는 미토콘드리아 DNA로 인한 것입니다.
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