새끼 돼지의 세포 면역 및 혈액 특성에 대한 식이 휴믹 물질의 영향

추상적인: 본 연구의 목적은 식이 휴믹 물질이 새끼 돼지의 면역 반응과 혈액 프로필에 미치는 영향을 확인하는 것이었습니다. 총 24두의 교배 새끼 돼지(슬로바키아 화이트 × 랜드레이스, 35일령, 평균 체중 11.67kg)를 2개의 사료 그룹(실험; 5 g·kg−1) 또는 무(대조군; 0)에 할당했습니다. g·kg−1 ) 천연 휴믹 물질 보충. 본 연구에서는 실험군에서 CD4+CD8- 림프구(p < {{1{20}}}}.001)의 비율이 크게 증가하는 것을 관찰했습니다. 결과는 또한 식세포의 포식 능력과 식세포의 삼킴 능력이 증가하는 경향을 보여주었으며, 모니터링된 다른 림프구 하위 집단(CD3+, CD21+, CD4-D)의 수도 나타났습니다. 대조군과 비교한 실험군의 새끼 돼지의 8+, CD4+CD8+, CD4+CD25+). 휴믹물질의 보충은 대조군에 비해 혈청 알칼리성 인산분해효소를 증가시켰다(p<0.05). 모니터링된 다른 혈액 매개변수는 식이 요법에 의해 크게 영향을 받지 않았습니다. 새끼 돼지의 식단에 휴믹 물질을 포함시키는 것은 혈액학적 및 생화학적 변수에 부정적인 영향을 주지 않으면서 세포 면역을 자극하는 효과를 가질 수 있다는 결론이 나왔습니다.

키워드: 휴믹물질; 식균작용; 림프구; 혈액생화학; 혈액학; 새끼 돼지

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1. 소개

부식질(HS)은 토양에서 형성된 비영양성 천연 유기 생리 활성 화합물의 한 종류입니다[1]. 그들은 주요 기능이 토양에서 살아있는 유기체로 영양분을 전달하는 중요한 부식질 구성 요소입니다. HS는 특히 휴믹산(Humic acid), 풀빅산(Fulvic acid), 휴민(Humin)을 주요 성분으로 포함합니다[2]. 이러한 구성 요소는 식물 성장에 필수적이며[3] 식물이 영양분을 효율적으로 활용하도록 촉진할 수 있습니다[4]. 유럽 ​​연합에서 성장촉진제로 항생제 사용을 금지함에 따라, 동물 생산을 위한 대체 사료 첨가제에 대한 관심이 증가했습니다[5]. 지난 20년 동안 동물 영양에 H2S를 사용하는 것에 대한 관심이 증가했습니다[2,6]. 많은 저자들은 연구 중에 H2S를 사료에 첨가한 후 생산 매개변수의 개선을 관찰했습니다. 최근에는 돼지, 가금류, 토끼 등 단위동물의 사료에 첨가된 H2S가 성장을 촉진하는 것으로 나타났습니다[7-10]. 더욱이, HS는 수의학 실습에서 면역자극제, 지사제, 진통제, 항균제로 사용되어 왔습니다[11-13]. 동물의 식단에 부식질의 생물학적 활성 보충제를 첨가하면 대사 과정과 영양소의 소화율이 자극되고 일부 미네랄 성분의 흡수도 활성화되었습니다[14]. 다른 연구에서는 H2S가 분뇨에서 암모니아 배설을 줄이는 데 도움이 되고 혈액 림프구의 상대적 수를 향상시키는 것으로 나타났습니다. 위에서 언급한 변형은 동물의 면역력에 도움이 됩니다[2,8,15]. 그러나 H2S 제제의 출처와 유형이 다양하고 실제 H2S 효과를 측정하기 위한 단일 표준이 없기 때문에 생물학적 효과는 사양에 따라 달라집니다. 휴믹 물질(각각 0.8% 및 0.5% 농도)이 면역 상태에 미치는 영향에 대한 가금류 연구(육계 및 산란계)의 이전 결과 및 경험을 바탕으로 합니다. 그리고 면역반응에 대한 연구를 통해 우리는 새끼 돼지에서 이 효과를 검증하기로 결정했습니다. 우리는 식세포 활동과 B 세포 반응의 상당한 증가뿐만 아니라 CD4+:CD8+ 림프구 비율의 상당한 증가를 관찰했습니다[16,17]. 일반적으로 돼지의 사료첨가제로서의 보충은 가금류에 비해 잘 보고되지 않았으며, 돼지의 식단에서 H2S 보충이 면역 및 대사에 미치는 영향에 대한 과학적 연구는 여전히 상대적으로 제한적입니다. 따라서 본 연구는 예비 시험으로서 새끼 돼지 혈액의 생화학적, 혈액학적 변수뿐만 아니라 면역 지표에 대한 0.5% H2S 보충의 효과를 평가하기 위해 수행되었습니다.

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2. 재료 및 방법

2.1. 실험적 설계

실험은 "과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 유럽 지침"[18]에 따라 수행되었습니다. 동물들은 슬로바키아 코시체에 있는 수의과 대학의 동물 영양 및 축산학과의 인증된 마구간에서 요구되는 동물원위생 조건 하에 사육되었습니다. 실험기간 동안 축사의 평균온도는 20.2 ± 1.5 ◦C, 상대습도는 68.5 ± 4.8%였다. 이 임상시험은 코시체 소재 수의과 약학대학 윤리위원회의 승인을 받았습니다(프로토콜 번호 EKV/2022-11). 총 24마리의 교배종(슬로바키아 화이트 x 랜드레이스) 35-일령 새끼 돼지를 두 그룹으로 나누었습니다(n= 12; 두 그룹 모두 수컷 50%, 암컷 50%). 실험 시작 전, 대조군의 초기 평균 동물 체중(BW)은 11.68 ± 1.35 kg, 실험군에서는 11.65 ± 1.34 kg으로 기록되었다. 다음 실험 그룹이 연구에 포함되었습니다: 대조군과 실험 그룹, 실험 그룹의 식단에는 0.5% HS 보충제가 보충되었습니다. 실험은 4주 동안 진행됐다. 두 그룹 모두에 대해 동일한 식단이 실험에 사용되었습니다(표 1). 실험군에서는 보리를 희생하여 식단에 HS 보충제를 도입했습니다. 돼지에게 완전한 사료 혼합물을 하루에 두 번씩 먹였습니다. 실험 기간 동안 동물은 자유롭게 식수를 섭취할 수 있었습니다. 실험에서 완전한 사료 혼합물은 Šimeţcek et al.의 영양 요구 사항에 따라 구성되었습니다. [19]. 식이성 천연 HS 보충제(HUMAC® Natur AFM; 슬로바키아 코시체의 Humac, Ltd.)를 분쇄하고 화학적 처리 없이 Leonardite로 물리적으로 정제했습니다. EC 위원회 규정 152/2009[20]에 따라 전체 사료 혼합물의 건조물, 조단백질, 조섬유, 총 회분, 전분 및 총인을 분석했습니다. 식이성 칼슘 및 나트륨 함량은 원자흡광분광계(Unicam Solar 939, Camberley, Surrey, UK)의 화염법을 사용하여 분석하였다. 완전한 공급 혼합물의 대사 가능한 에너지 값은 Šimeűcek et al.에 따른 공식을 사용하여 계산되었습니다. [19].

2.2. 샘플링 및 측정

4주차 실험 마지막 날 오전에, 후속 분석을 위해 두 그룹의 모든 돼지로부터 개별적으로 안와동 천자에 의해 혈액 샘플을 채취했습니다. 원심분리(30분 동안 3000rpm)를 통해 혈청을 얻었고 분석할 때까지 -20oC에서 보관했습니다. 헤파린 처리된 혈액은 혈액학적 매개변수를 결정하고, 식세포 활성을 테스트하고, 림프구 하위 집단을 확인하는 데 사용되었습니다.

표 1. 돼지용 사료 혼합물의 조성 및 화학적 조성(사료 기준)

2.2.1. 혈액학적 및 혈청 생화학적 매개변수

자동화된 혈액학 분석기(scil Vet ABC™ Hematology Analyser, Germany)를 사용하여 전체 혈구 계산을 수행했습니다. 본 연구에서 평가된 변수는 적혈구 용적률(HCT), 헤모글로빈 농도(Hb), 적혈구 수(RBC), 평균 적혈구 부피(MCV) 및 총 백혈구 수(WBC)였습니다. 혈청 생화학적 매개변수 - 총 단백질, 알부민, 포도당, 요소, 트리글리세리드, 콜레스테롤, 크레아티닌, 아스파르테이트 아미노전이효소(AST), 알칼리성 포스파타제(ALP) 및 인은 완전 자동 무작위 접근 벤치탑 분석기(Ellipse, Italy)를 사용하여 측정되었습니다. 혈청 내 칼슘 농도는 불꽃 원자 흡수 분광계(Unicam Solar 939, Camberley, Surrey, UK)를 사용하여 측정했습니다.

2.2.2. 지질 과산화의 바이오마커

혈청 내 지질 과산화 생성물(말론디알데히드 수준, MDA)의 농도는 Costa 등이 기술한 분광광도계 변형 방법에 따라 티오바르비투르산 반응성 물질(TBAR)로 측정되었습니다. [21]. 간단히 말하면, 혈청 샘플을 트리클로로아세트산(15%; Merck, Darmstadt, Germany), 티오바르비투르산(0.38%; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 염산(0.25 N; Mikrochem, Pezinok, Slovakia)을 넣고 끓는 물욕에서 30분간 가열했습니다. 얼음물에 식힌 후 원심분리한 후 상층액의 흡광도를 535 nm에서 측정하였다. TBAR의 농도는 1,1,3,3-테트라메톡시 프로판(말론디알데히드-비스(디메틸 아세탈); Acros Organics(벨기에 겔))을 사용하여 작성한 표준 곡선으로부터 결정되었습니다. 결과는 MDA nmol/혈청 mL로 표시되었습니다.

시스탄체 식물의 면역 체계 증가

2.2.3. 식세포 활동 테스트 및 림프구 하위 집단의 식별

상업용 Phagotest® 분석(Celonic, 뮌헨, 독일)을 사용하여 식균 활성 및 식세포의 삼킴 능력을 결정했습니다. 테스트를 수행할 때 제조업체의 지침을 따랐습니다. 직접 면역염색 분석을 적용하여 림프구의 선택된 하위 집단을 확인했습니다. 결합된 마우스 항-돼지 단클론 항체의 두 가지 조합: CD3e/CD21 및 CD4/CD8a/CD25를 표 2에 제공된 사양에 따라 사용했습니다. 50 μL 양의 헤파린 처리된 혈액을 암실에서 15분 동안 단클론 항체와 함께 배양했습니다. 실험실 온도에서. 인큐베이션 후, 1 mL의 BD FACS 용해 용액을 튜브에 첨가했습니다. 튜브를 실험실 온도의 암실에서 추가로 20분 동안 배양한 후 원심분리했습니다(5분 동안 300xg). 그런 다음 세포 펠렛을 세척하고 1 mL 인산염 완충 식염수(PBS; MP Biomedicals, Illkirch-Graffenstaden, France)로 300 x g에서 5분 동안 두 번 원심분리했습니다. 마지막으로, 후속 세포 계측 분석을 위해 세포를 200 μL의 PBS에 재현탁했습니다.

표 2. 사용된 마우스 항돼지 단일클론 항체의 사양 및 양.

BD FACS DivaTM 소프트웨어를 사용하여 6색 BD FACSCantoTM 유세포 분석기(Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA, USA)에서 식세포 활성 분석 및 림프구 하위 집단의 식별을 수행했습니다. 분석된 세포의 위치는 FSC 대 SSC 도트 플롯으로 게이팅되었습니다. 식세포 활성 분석을 위해 과립구, 단핵구 및 두 세포 집단을 각각 함께 사용했습니다. 적색 형광 히스토그램(FL-2)의 낮은 DNA 함량을 기반으로 박테리아 응집체를 추가 분석에서 제외했습니다. 활성 식세포의 백분율과 평균 형광 강도는 녹색 형광 히스토그램(FL-1)에서 결정되었습니다. 림프구 하위 집단을 식별하기 위해 게이트 림프구(그림 1a,b)를 사용했습니다. CD3+ 림프구는 T 림프구와 CD21+ B 림프구를 나타냅니다(그림 1c). CD4+CD8- 하위 모집단은 T 보조 림프구로, CD4-CD8+는 세포독성 림프구로, CD4+CD8+는 T 보조 림프구로 평가되었습니다. 이중 양성 T 림프구(그림 1d) 및 조절 T 림프구인 CD4+CD25+(그림 1e). 림프구의 비율은 백분율로 표시됩니다.

2.3. 통계 분석

결과는 통계 소프트웨어 GraphPad Prism 8을 사용하여 unpaired t-test를 통해 통계적으로 평가되었습니다.0. p < 0.05 값은 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었습니다. 본 실험에서 얻은 결과는 평균±표준오차(SEM)로 표현하였다.

그림 1. 게이팅 전략: (a) 기본 도트 플롯(FSC-A 대 SSC-A)에서 림프구(빨간색)의 위치 결정; (b) 분석에서 이중선 및 응집체를 제거하는 단계; (c) CD3+ 및 CD21+ 림프구 표현 분석; (d) CD4+ 및 CD8+ 림프구의 표현 분석; (e) CD4+ 양성 세포(녹색으로 게이트됨)의 히스토그램에서 CD4+CD25+ 림프구의 표현 결정.

3. 결과

3.1. 혈액학적 및 혈청 생화학적 매개변수

혈액학적 및 생화학적 혈액 프로필에 대한 HS의 영향은 표 3에 나와 있습니다. 적혈구, 백혈구, 헤모글로빈, 헤마토크릿, 평균 미립자 부피, 총 단백질, 알부민, 포도당, 요소, 트리글리세리드의 함량을 포함하여 결정된 혈액 매개변수 , 콜레스테롤, 크레아티닌, AST, Ca 및 P는 식이성 HS 처리에 영향을 받지 않았습니다. 그러나 HS를 이용한 식이보충은 ALP의 활성을 증가시켰다(p < 0.05).

표 3. 새끼 돼지의 일부 혈액학적 및 혈청 생화학적 매개변수에 대한 휴믹 물질의 영향

지질 과산화의 2차 생성물인 혈청 TBAR 수준(지질 과산화 측정에 사용되는 중요한 매개변수)은 HS 첨가에 의해 영향을 받지 않았습니다.

3.2. 세포 면역 반응

자돈의 사료에 HS를 첨가하는 것은 활성 식세포의 비율(표 4)과 식세포의 삼킴 능력(표 5)에 유의미한 영향을 미치지 않았습니다. 이러한 선천성 면역 반응 매개변수의 값은 대조군에 비해 실험군에서 더 높게 나타났습니다.

표 4. 활성 식세포의 백분율로 평가된 새끼 돼지의 혈액 내 식세포 활성에 대한 휴믹 물질의 영향 - 식세포 활성

표 5. 평균 형광 강도(MFI)로 표현된 식세포의 삼킴 능력에 대한 휴믹 물질의 영향.

그림 2. 계속

그림 2. 부식질이 림프구 비율에 미치는 영향: (a) CD3+; (b) CD21+; (c) CD4+CD8-; (d) CD4-CD8+; (e) CD4+CD8+; (f) CD4+CD{{10}}; 및 (g) 새끼 돼지의 혈액 내 CD4:CD8 림프구의 비율. 별표로 표시된 열은 대조군과 크게 다릅니다(*** p < 0.001).

4. 토론

4.1. 세포 면역 반응

우리 연구의 주요 목적은 휴믹 물질(HS)이 몇 가지 다른 세포 면역 지표에 어떻게 영향을 미치는지 추적하는 것이었습니다. 활성 식세포의 비율과 이들의 삼킴 능력은 선천적 세포 면역에 대한 영향을 모니터링하기 위한 지표로 선택되었습니다. 이전 연구에서 육계의 사료({{0}}.8%)에 H2S를 첨가하면 식세포 활동과 평균 형광 강도가 크게 증가한 것으로 나타났습니다[16]. 추가적으로, ELnaggar와 El-Kelawy[22]는 식단에 부식산을 보충한 후 식세포 활동과 식세포 지수의 증가를 관찰했습니다(0.1, 0.2 및 0. 4%) 사코 닭. 산란계에서도 비슷한 결과가 나왔습니다[17]. 현재 연구에서 새끼 돼지의 식단에 HS를 보충하는 것은 식균 작용에 유의미한 영향을 미치지 않았습니다. 그러나 활성 식세포의 비율과 포식 능력은 대조군의 새끼 돼지보다 HS를 보충한 새끼 돼지에서 수치적으로 더 높았습니다. Sanmiguel과 Rondón [23]에 따르면, 식세포에 대한 HS의 효과는 시간에 따라 달라집니다. 그들은 산란계의 사료(0.1 및 0.2%)에 HS를 보충하면 적용 8일과 3일0에 식세포 지수가 증가한다는 것을 발견했습니다. Wang et al. [2]는 10% HS가 첨가된 사료를 먹은 돼지의 상대적 림프구 수가 더 높다는 사실을 발견했습니다. 0.15% 부식산염이 보충된 사료를 먹거나 식수에 20mg 부식산/체중 kg을 보충한 가금류에 대해서도 유사한 결과가 얻어졌습니다[25]. Cetin et al. [24], 산란계의 사료에 휴믹 화합물을 보충하면 림프구 수가 크게 증가하는데, 이는 IL-2의 생산 증가와 IL{{29}의 발현 증가에 기인할 수 있습니다. } 림프구 수용체. 휴믹 물질은 IL{30}}생성 세포의 활동을 향상시키는 것으로 보입니다. 그러나 다른 저자들은 부식산이 보충된 사료를 먹인 돼지[26]뿐만 아니라 식수[27]나 식단에 부식산을 공급한 닭[22]에서는 림프구 수에 어떤 유의미한 영향도 관찰하지 못했습니다. . 우리의 결과는 Mudro ¡nová et al.의 관찰과 유사합니다. 그들은 CD4 림프구의 비율이 대조군과 비교하여 HS 보충(0.8%)을 먹인 육계에서 유의하게 증가했음을 발견했습니다. 그들은 또한 CD{39}} 림프구(T 세포독성 림프구)의 상당한 감소를 확인했으며, 이로 인해 면역 자극의 지표로 사용되는 CD4:CD8 비율이 통계적으로 더 높아졌습니다. 반면, 산란계에 0.5% HS를 먹이면 B 림프구의 하위 집단을 나타내는 IgM+ 림프구의 비율이 크게 증가하고 전체 T 림프구를 나타내는 CD{45}} 림프구의 비율이 크게 감소합니다. T 헬퍼와 T 세포독성 림프구의 비율은 영향을 받지 않았습니다[17]. 우리의 결과와 다양한 연구에 따르면 HS는 사용된 부식산염의 구성과 양, 투여 방법, 동물 종, 그리고 ELnaggar와 El에 따르면 영향을 받을 수 있는 면역 자극 효과를 가질 수 있습니다. - Kelawy [22], 기후가 다른 세계 여러 지역에서 동물을 사육함으로써. HS의 면역조절은 이론적으로 휴민산염과 당류의 복합체 형성으로 구성될 수 있습니다. 이러한 복합체는 T 림프구와 NK 세포의 표면에 결합하여 사이토카인 생성을 포함한 기능에 영향을 미치며, 이는 면역 체계의 다른 세포에도 영향을 미칩니다[28].

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4.2. 혈액학적 및 혈청 생화학적 매개변수

이 연구의 또 다른 목적은 HS가 보충된 자돈 사료의 선별된 혈액학적 및 생화학적 혈액 매개변수를 평가하는 것이었습니다. 현재 연구에서 ALP 활성을 제외하고는 식이성 HS 보충제를 섭취한 동물 실험군과 대조군 간에 단백질, 에너지, 미네랄 대사의 선택된 변수와 혈액학적 지수에서 유의미한 차이가 발견되지 않았습니다. Doubek et al.에 따르면 우리 연구의 생화학적 지표는 모든 새끼 돼지의 기준 범위 내에 있었습니다. [29] 및 Kraft와 Dürr [30]. 우리의 연구 결과는 Wang et al.의 이전 연구와 일치합니다. [2]는 비육돈의 혈액 변수에 대한 HS의 영향을 알아내기 위한 연구에서 실험 과정 동안 적혈구와 백혈구에 큰 변화가 없음을 발견했습니다. HS 함유 식단으로 치료한 후 Herzig et al. [31], 그리고 Šamudovská와 Demeterová [32]도 닭에서 ALP 활동이 유의미하게 증가하지 않는 것을 관찰했습니다. 조사 결과 실험군은 대조군보다 ALP 활성이 유의하게 높은 것으로 나타났습니다. 한편, 이들 값은 돼지 ALP 수준(2–17 kat·L −1 )[29,30]에 대한 참조 범위 내에 유지되었습니다. 반면 Jad'uttová et al. [33] 및 Rath et al. [34]는 HS를 먹인 후 닭의 ALP 활동이 크게 감소한 것을 발견했습니다. 이들 저자에 따르면 1.00% HS 사료 보충제를 투여한 육계의 혈중 ALP 수치가 감소했다고 합니다. Rath et al.에서는 ALP 활성 값이 감소했지만. [34] 연구는 대조군과 통계적으로 달랐으며, 선택 기관(근육, 신장, 심장 또는 간)에 대한 HS의 독성 효과를 반영하지 않았습니다. 식단을 통해 제공되는 HS의 양은 혈액 내 미네랄 농도에 영향을 미칠 수 있습니다. 자돈의 혈청 내 칼슘과 인 수치는 0.5% 농도의 HS 투여에 영향을 받지 않았습니다. 상당한 양의 카르복실산 측쇄에 의해 영향을 받는 H2S의 금속 킬레이트 능력은 미네랄 혈청 농도 감소의 원인이 될 수 있습니다 [34]. 본 연구에서는 실험군의 사료 혼합물에 H2S를 첨가해도 자돈의 혈액 내 칼슘과 인 농도가 기준치 이하로 감소하지 않았다. MDA는 산소 자유 라디칼에 의한 지질 과산화의 산물이며, 항산화 상태와 지질 과산화를 평가하는 지표로 사용될 수 있습니다[35]. MDA는 혈액 내 티오바르비투르산 반응 물질(TBAR)의 수준을 측정하여 산화 스트레스의 바이오마커로 결정되었습니다. 산화 스트레스의 감소는 MDA 수준의 감소를 특징으로 합니다. 이전 연구에서는 H2S가 항산화 특성을 갖고 있어 자유 라디칼이 일반적으로 유발하는 산화 스트레스와 관련된 다양한 장애로부터 보호할 수 있음을 보여주었습니다. 예를 들어, 왕 외. [15] 부식산 나트륨(2{30}}00mg·kg−1)의 식이 보충제가 이유자돈의 항산화 상태를 향상시킬 수 있음을 발견했습니다. 그들은 혈청 내 MDA 함량이 크게 감소하고 총 항산화 능력이 크게 증가하는 것을 관찰했습니다. 그러나 H2S는 다양한 구성을 가진 천연 물질이므로 투여량에 따라 효과가 달라질 수 있습니다. 현재 실험에서는 대조군과 비교하여 HS를 먹인 새끼 돼지의 혈청 MDA(TBAR) 수준에 변화가 관찰되지 않았습니다. 우리의 결과는 Zhang et al.과 일치합니다. 그들은 산란계의 사료(0.1, 0.3, 0.5%)에 부식산 나트륨을 첨가하는 것이 혈청 총 항산화 능력과 MDA 값에 영향을 미치지 않는다는 것을 발견했습니다.

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5. 결론

본 연구에서 얻은 결과를 바탕으로 0.5% 휴믹 물질을 함유한 식이 보충제가 새끼 돼지의 일부 면역 세포에 자극 효과를 가질 수 있다는 결론을 내릴 수 있습니다. 혈액 내 CD4+CD8- 림프구의 비율이 크게 증가했습니다. 휴믹물질의 보충은 혈청 ALP를 증가시켰습니다. 그러나 이들 값은 여전히 ​​기준 범위 내에 있었습니다. 결과는 이렇게 낮은 농도의 HS라도 새끼 돼지의 세포 면역에 긍정적인 영향을 미칠 수 있음을 보여주었습니다. 우리가 선택한 휴믹 물질의 농도는 세포 면역의 일부 지표에만 중요한 영향을 미치기 때문에 적절한 농도를 선택하고 이 범주의 동물에서 면역 자극 효과를 확인하기 위해서는 추가 연구가 필요할 것입니다.

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