SARS-CoV의 스파이크 단백질 및 기타 구조 단백질을 코딩하는 DNA 백신과의 공동 예방접종을 통한 생쥐의 시너지적 면역 및 보호-2

추상적인:중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS CoV-2)의 새로운 변종 출현으로 인해 전 세계적으로 감염이 반복적으로 발생하고 있습니다. 이러한 고도로 돌연변이된 변종은 원래 바이러스의 스파이크(S) 단백질만을 표적으로 삼도록 설계된 최신 코로나바이러스 질병 2019(COVID{3}}) 백신의 효과를 감소시킵니다. SARS-CoV-2의 S를 제외하고, 백신 표적 항원으로서 다른 구조 단백질(뉴클레오캡시드, N; 외피, E; 막, M)의 면역 보호 잠재력은 여전히 ​​불분명하며 조사할 가치가 있습니다. 본 연구에서는 4가지 SARS-CoV-2 구조 단백질(pS, pN, pE 및 pM)을 코딩하는 합성 DNA 백신을 개발했으며, 근육내 주사 및 전기천공법을 통해 마우스에 3회 용량을 투여했습니다. 특히, S와 N 단백질을 발현하는 두 가지 DNA 백신을 이용한 공동 면역은 더 높은 중화 항체를 유도했고 SARS-CoV{10}} 바이러스 부하를 줄이는 데 있어 생쥐에서 S 단백질만 단독으로 투여한 것보다 더 효과적이었습니다. 또한, pN 또는 pE + pM을 사용한 pS 공동 면역화는 3회 면역화 후 더 높은 S 단백질 특이적 세포 면역을 유도했으며, 공격 후 pS 단독에 비해 더 가벼운 조직병리학적 변화를 일으켰습니다. N/E/M 단백질을 포함하여 SARS-CoV-2의 보존된 구조 단백질의 역할은 mRNA 백신과 같은 백신 설계에 적용하기 위해 추가로 조사되어야 합니다.

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키워드: 코로나19-19; 사스 코로나바이러스 2}}; 공동 예방접종; DNA 백신; 스파이크 단백질; 구조 단백질

1. 소개

중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)는 코로나바이러스 질병 2019(COVID{4}})의 원인으로, 전 세계적으로 수백만 명의 감염과 사망을 초래했으며 인류 건강과 세계 경제를 위태롭게 했습니다. . 효과적인 치료 접근법은 아직까지 이용 가능하지 않지만 CAR-T 세포 치료법과 나노기술의 적용을 포함하여 빠르게 발전해 왔습니다[1,2]. 백신 접종은 대유행을 통제하는 효과적인 방법이며, 여러 백신이 다양한 규제 보건 기관에서 사용하도록 승인되었습니다[3,4]. 코로나바이러스 게놈은 비리온 조립과 숙주 면역 반응 억제를 담당하는 스파이크(S), 뉴클레오캡시드(N), 막(M), 외피(E) 단백질 등 4가지 주요 구조 단백질을 암호화합니다. ]. S 단백질은 두 개의 하위 단위, 즉 S1과 S2를 포함하는 1273개의 아미노산 잔기로 구성됩니다. 이는 바이러스 침입을 중재하며 코로나바이러스 백신 개발의 주요 목표입니다[6-11]. 그러나 SARS-CoV-2 S 단백질은 돌연변이 빈도가 높습니다. 당연히 RNA 바이러스인 SARS-CoV-2에서 돌연변이는 지속적이고 불가피합니다. 2020년 9월 이후 B.1.1.7(영국, 알파), B.1.351(남아프리카, 베타), P.1을 포함하여 5개의 SARS-CoV-2 우려되는 VOC(변종)가 나타났습니다. (브라질, 감마), B.1.617.2(인도, 델타) 및 B.1.1.529(남아프리카, Omicron)(Andreano 및 Rappuoli, 2021; Gupta, 2021). 그들은 모두 스파이크 단백질에 여러 가지 돌연변이를 가지고 있습니다[12]. 이러한 변종은 스파이크 단백질만을 표적으로 삼도록 설계된 현재의 코로나19{38}} 백신의 효과를 위협합니다.

SARS-CoV-2의 N 단백질은 "끈 위의 구슬" 방식으로 핵심에 있는 140-아미노산 길이의 RNA 결합 도메인을 통해 바이러스 RNA에 결합합니다. 이는 코로나바이러스 사이에서 고도로 보존되어 SARS-CoV와 ~90%의 서열 동일성을 공유하며, 비리온 내부의 유일한 구조 단백질이기도 합니다[13]. 또한 바이러스 RNA를 리보핵산 캡시드 복합체에 포장하는 데 중요한 역할을 하며 바이러스 RNA 복제, 비리온 조립 및 숙주 세포로부터의 방출에 필요합니다[14]. 코로나바이러스 내 N 단백질의 높은 서열 유사성을 바탕으로 교차 보호 백신 표적으로 제안될 수 있습니다. 우리는 이전에 E와 M 단백질을 발현하는 두 가지 DNA 백신을 이용한 공동 면역화가 SARS-CoV-2에 대해 부분적인 보호를 제공한다는 사실을 발견했으며, 이 방법은 백신 개발 중에 고려해야 합니다[15]. WHO의 전망 문서에 따라 일반적으로 SARS-CoV-2 백신 후보에 대한 7가지 전략이 있으며, 이는 다시 세 가지 범주로 나눌 수 있습니다. 첫째, 비활성화된 바이러스 백신을 포함한 단백질 기반 백신, 바이러스 유사 백신 입자 및 단백질 하위 단위 백신; 둘째, 바이러스 벡터 백신, DNA 백신, mRNA 백신을 포함한 유전자 기반 백신; 셋째, 생약독화 바이러스 백신과 같은 단백질 기반 접근법과 유전자 기반 접근법의 조합입니다. 새로운 유전자 기반 백신 전략인 DNA 기술은 전임상 테스트 중에 여러 백신 후보와 전략을 신속하게 비교할 수 있습니다[16,17]. 이론적으로 거의 모든 바이러스 단백질은 잠재적인 면역원이자 백신 표적입니다. 그러나 우리가 아는 한, 합성 DNA 백신의 면역원성과 SARS-CoV{28}} S 단백질 및 기타 구조 단백질을 암호화하는 보호 가능성은 아직 체계적으로 보고되지 않았습니다. SARS-CoV-2 S, N, E 및 M1 단백질을 발현하는 4가지 DNA 백신을 마우스에서 면역원성 및 보호 효능에 대해 평가하여 다른 구조 단백질과 조합된 S의 면역학적 효과를 조사했습니다.

2. 재료 및 방법

2.1. 세포

Huh7.5 세포와 인간 배아 신장 293T 세포는 연구 기간 동안 5% CO2의 가습된 대기에서 37oC에서 배양되었습니다. 세포를 10% FBS(GEMINI Co., Shanghai, China) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, New York, NY, USA)이 보충된 DMEM 배지(HyClone, Logan, UT, USA)에서 배양하였다. 모든 세포주는 마이코플라스마 오염에 대해 음성으로 확인되었습니다.

2.2. SARS-CoV-2 S/N/E/M을 코딩하는 DNA 백신의 구축

N 말단 Kozak 서열(GCCACC)과 개시 코돈(ATG)을 포함하는 SARS-CoV-2 S/N 단백질 코딩 유전자는 포유류에 최적화된 코돈(GenScript Co., Nanjing)을 사용하여 합성되었습니다. , 중국). 그런 다음 EcoRI 및 XbaI 분해를 통해 발현 벡터 pcDNA3.1(+)에 클로닝하고 pS/pN(DNA 백신)으로 명명했습니다(그림 1A). pE/PM 단백질은 이전에 설명한 대로 구성되고 확인되었습니다[15]. 내독소가 없는 Maxiprep 키트(Qiagen, Beijing, China)를 사용하여 백신을 제조하고 Sanger DNA 서열 분석을 사용하여 서열을 확인했습니다. S/N 단백질의 발현은 웨스턴 블랏과 1:1000으로 희석된 항-S(Sino Biological, Beijing, China)/항-N 항체를 사용하여 확인되었습니다. 이러한 실험은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다[15,18].

그림 1. 재조합 DNA 기반 SARS-CoV-2 S/N 단백질 백신 구성체의 설계 및 발현. (A) SARS-CoV-2 스파이크(PS), 뉴클레오캡시드(pN), 외피(pE) 및/또는 막(PM) 단백질을 코딩하는 재조합 DNA 기반 백신의 개략도. (B) DNA 백신의 표적 단백질 발현은 pS/pN/pE/pM 플라스미드로 형질감염된 293T 세포의 웨스턴 블롯 분석을 통해 검증되었습니다.

2.3. 예방접종과 도전

6주령의 암컷 BALB/c 마우스(프랑스 찰스 리버 연구소)를 국립 직업 보건 및 독극물 통제 연구소에서 21°C, 습도 조절 환경, 12시간 명암 주기로 사육했습니다. 한편, 음식과 물은 자유롭게 제공되었으며, 모든 동물 실험은 중국 질병통제예방센터(China CDC) 동물실험윤리위원회의 승인을 받았습니다. 연구는 관련 윤리 규정을 준수했습니다.

마우스를 무작위로 5개 그룹으로 나누어 pS/pN 단독으로 면역화하거나 0일, 21일 및 42일에 근육내 주사 및 전기천공법(35 mg/50)을 통해 pS + pN 또는 pS + pE + PM으로 공동 면역화했습니다. mL) (그림 2) [19,20]. 간단히 말하면, DNA 백신을 전경골근(TA) 근육에 주사하고 바늘이 있는 5mm 간격의 2바늘 배열 전극(ECM830; BTX)을 사용하여 즉시 전기 펄스를 가했습니다. 체액성 면역 반응 분석을 위해 마우스의 혈청을 수집하고, 마우스 비장을 처리하여 세포 면역 반응을 측정했습니다(그림 2).

그림 2. 예방접종 및 SARS-CoV-2 챌린지의 도식. 백신접종, 챌린지, 혈액/조직 샘플링의 시간 경과. BALB/C 마우스를 무작위로 그룹으로 나누었습니다.

SARS-CoV-2 챌린지 실험은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다[15,21]. 간단히 말하면, 마우스를 마취시킨 다음 총 부피 45μL의 2.5 x 108 PFU의 Ad5-hACE2를 비강 내로 형질도입했습니다. 형질도입 5일 후, 마우스를 마취한 후 총 부피 50 µL의 식염수 중 1 x 105 TCID50 SARS-CoV-2(Wuhan/IVDC HB-02/2019)를 비강 내로 감염시켰습니다. 완충기. 생쥐 모델에서 실시간 SARS-CoV-2를 사용한 모든 작업은 동물 생물안전성 레벨 3(ABSL{22}}) 실험실에서 수행되었습니다.

2.4. 효소 면역 분석법

효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다[15]. 간단히 말하면, 탄산완충액(0.1 M, pH 9.6)에 희석된 S(Sino Biological에서 구입)/N 단백질(Song에서 선물)을 96-웰 EIA/RIA 플레이트(Thermo)에 코팅했습니다. Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 4°C에서 밤새 보관합니다. 플레이트를 PBS에 용해된 10% 염소 혈청 200μL로 37℃에서 2시간 동안 차단한 후 PBST로 5회 세척했습니다. 그런 다음 PBS의 2% 염소 혈청에 연속적으로 희석된 혈청 샘플을 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 배양한 후 PBST로 5회 세척했습니다. HRP 결합 염소 항-마우스 IgG Ab(1:5000)를 37℃에서 1시간 동안 첨가했습니다. 총 100μL의 TMB 기질을 각 웰에 첨가하고 50μL의 2M H2SO4로 켄칭했습니다. SPECTR Ostar Nano (BIO-GENE, Hong Kong, China)를 사용하여 450 nm의 파장에서 흡광도를 읽었습니다.

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2.5. 슈도바이러스 감염 및 중화 실험

슈도바이러스 중화 분석은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다[21,22]. 조상 바이러스 S 단백질을 발현하는 플라스미드는 이전에 구축되었습니다[22]. Omicron 변종 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 유전자(GISAID: EPI_ISL_6590782.2)를 합성했습니다(중국 난징 소재 Vazyme Biotech Co., Ltd.로부터 선물) 이전에 설명한 대로 포유류에 최적화된 코돈을 사용하고 pcDNA3.1 벡터에 클로닝했습니다[22]. 간단히 말하면, 루시퍼라제 리포터를 발현하는 플라스미드와 S 단백질을 발현하는 플라스미드는 X-treme GENE HP DNA 형질감염 시약을 사용하여 HEK 293T 세포에 공동 형질감염되었습니다. 세포 배양은 형질감염 6시간 후에 새로워졌고, 슈도바이러스가 포함된 상층액은 48시간 후에 수확되어 -70℃에 보관되었습니다. 슈도바이러스 중화 분석에서, 동일한 혈청-바이러스 혼합물을 37 부피의 슈도바이러스 함유 상층액에서 배양한 다음 희석된 혈청에 첨가했습니다. ◦C에서 1시간 동안. 그런 다음 Huh7.5 세포 배양 배지를 100μL의 혈청-바이러스 혼합물로 교체하고 37℃에서 12시간 동안 배양했습니다. SARS-CoV-2 슈도바이러스만으로 배양된 세포를 병렬로 실행했습니다. 그런 다음 배지를 DMEM(2% FBS)으로 교체하고 37°C에서 48시간 동안 배양했습니다. 이후, Bright-Glo 반딧불이 루시퍼라제 키트(Promega)를 이용하여 루시퍼라제 신호를 측정하였다.

2.6. SARS-CoV-2 중화 분석

이 실험에는 SARS-CoV-2(Wuhan/IVDC-HB-02/2019)가 사용되었습니다. 간단히 말해서, 혈청을 1:10의 시작 희석에서 2배로 희석하고 동일한 부피(10~15pfu/웰)의 생 SARS-CoV-2와 혼합한 다음 37°C에서 1시간 동안 배양했습니다. 그 후 이들은 파종된 Vero 세포에 첨가되었습니다. 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 세포 변성 효과(CPE)가 관찰되었으며, 핵산 추출 및 실시간 형광 역전사 PCR(RT-PCR)을 위해 배양 상등액 100μL를 수집했습니다. 중앙값 중화 용량(ND50)은 Reed-Munch 방법을 사용하여 계산되었습니다[15].

2.7. IFN-ELISpot 분석

10개의 아미노산이 겹쳐진 연속적인 15-머로 전체 S/N/E/M 단백질에 걸쳐 있는 펩타이드 풀은 Scilight Biotechnology, LLC에 의해 합성되었습니다. 펩타이드 풀 내 정제된 각 펩타이드의 약 2.5mg이 바이알당 존재했습니다. 실험은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다[18]. 간단히 말하면, 96-웰 플레이트(BD ELISPOT Set, USA)를 항-IFN-포획 Ab로 코팅하고 4°C에서 밤새 배양했습니다. 플레이트를 3회 세척한 후 완전 배양 배지로 차단했습니다. 35일 및 120일째에 마우스를 안락사시킨 후 비장세포를 수확했습니다. 각 그룹의 신선한 단일 세포 현탁액을 웰당 5×106개씩 플레이팅하고 펩타이드를 첨가했습니다. 그런 다음 플레이트를 37℃, 5% CO2, 22시간 동안 배양한 후 ELISpot 플레이트 판독기(Biosys, So. Pasadena, CA, USA)를 사용하여 검출했습니다. 스팟 형성 단위(SFU)는 T 세포 분비 IFN-을 나타냅니다.

2.8. SARS-CoV-2 챌린지 이후 생쥐의 보호 평가

실험은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다[15,21]. 간략하게, 마우스를 안락사시킨 후 폐를 수확하였다. 조직의 절반은 핵산 추출, 실시간 형광 RT-PCR 및 TCID50에 사용되었습니다. 나머지 절반은 병리학적 평가를 위해 중국농업대학 수의과대학으로 보내졌다.

2.9. 통계 분석

Unpaired t-test, 양방향 ANOVA 테스트, Dunnett의 다중 비교 테스트는 GraphPad Prism 70 (GraphPad Software LLC)을 사용하여 수행되었습니다. p-값 < 0.05는 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었습니다(* p < 0.05; ** p < 0.01; * ** p < 0.001; **** p < 0.0001).

3. 결과

3.1. DNA 백신의 특성화

E 및 M 단백질 수준은 웨스턴 블랏을 사용하여 검출되었습니다. pS/pN/pE/pM 플라스미드로 형질감염된 HEK-293T 세포에서 SARS-CoV-2의 암호화된 S/N/E/M 단백질의 발현을 항바이러스제를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 통해 측정했습니다. -S/항-N 항체 및 항-6 x His 항체(세포 용해물 내). 밴드는 S(140-142 kDa), N(45 kDa), E(10 kDa) 및 M(22-25 kDa) 단백질의 예상 분자량에 근접했습니다(그림 1B).

3.2. pS 및/또는 pN DNA에 의해 유도되는 강력하고 지속적인 항-S 및/또는 항-N IgG 생산

백신 혈청은 35, 56, 96 및 120일에 BALB/c 마우스로부터 수집되었습니다(그림 2). 항 S/항-N IgG 수준은 ELISA를 사용하여 검출되었습니다. pS 또는 pN에 의해 ​​유도된 S- 또는 N-특이적 IgG 반응의 크기는 첫 번째 및 두 번째 추가 추가 후 혈청에서 증가했습니다. 항-S 및 항-N IgG 역가는 다른 그룹에 비해 pS + pN 그룹에서 더 높았습니다. 그러나 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았습니다(그림 3A, B). 강력한 E/M 단백질 특이적 항체 반응은 검출되지 않았으며 이는 이전 연구 결과와 일치합니다(데이터는 표시되지 않음)[15].

그림 3. BALB/c 마우스에서 SARS-CoV-2에 대한 B세포 반응. (A) SARS-CoV-2 S(A) 및 N 단백질(B)에 대한 혈청 IgG 결합 종점 역가. (C) 중화 역가는 SARS-CoV-2 유사형 바이러스 시스템을 기반으로 결정되었습니다. (D) 항SARS-CoV-2 중화 역가는 SARS-CoV-2 바이러스를 사용하여 결정되었습니다. (E) SARS-CoV-2 Omicron 유사형 바이러스 시스템을 기반으로 한 중화 분석. 모의(파란색), pS(빨간색), pS + pN(녹색), pS + pE + pM(분홍색) 및 pN(주황색) 그룹의 혈청에 대한 억제 비율이 표시됩니다. 오차 막대는 SEM을 나타내며, p-값은 양방향 ANOVA와 Sidak의 사후 분석을 사용하여 계산되었습니다. 여기서 * p < 0.05

3.3. pS 및 pN 백신과의 공동 면역화로 유도된 높은 수준의 중화 항체

연속적으로 희석된 혈청 샘플의 중화 역가는 위형화된 SARS-CoV-2 바이러스를 사용하여 결정되었습니다. 가장 높은 수준의 중화 항체(nAbs)가 pS + pN 그룹에서 관찰되었으며, 상호 EC50 기하 평균 역가는 2988(35일) 및 3578(56일)에 도달했습니다(그림 3C). 살아있는 바이러스 미세중화(MN) 분석을 사용하여 유사한 결과가 관찰되었으며, 여기서 pS + pN 그룹의 nAb 수준은 56일과 96일에 S 그룹의 nAb 수준보다 더 높았습니다(p < 0.05; 그림 3D). 더욱이, 56일차(두 번째 부스트)에 pS + pN 그룹의 nAbs 수준은 35일차에 비해 상당히 높았습니다(p< 0.05, 그림 3D).

SARS-CoV-2 Omicron 변종에 대한 각 백신 요법의 중화 활성은 유사형 플랫폼과 혈청 샘플을 사용하여 추가로 결정되었습니다. 35일과 56일에 Omicron 바이러스에 대한 중화 프로필은 조상 바이러스에 대한 프로필과 유사했으며(그림 3E), 이는 PS + pN 처리가 교차 중화 효능을 가지고 있음을 시사합니다.

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3.4. DNA 백신접종에 의해 유도된 T 세포 반응

이전에 설명한 대로 SARS-CoV-2 S/N/E/M 항원에 대한 T 세포 반응은 이전에 설명한 대로 IFN-ELISpot을 사용하여 추정했습니다[15]. 예상한 대로, PS + pN 및 pS + pE + pM 요법은 모두 35일차(p < 0)보다 12일차0에 S 단백질에 특이적인 IFN + T 세포 수준을 상당히 더 높게 유도했습니다. 05; 그림 4A). 더욱이, 120일(두 번째 추가)에 N 단백질에 특이적인 IFN + T 세포의 수는 pS + pN 그룹에서 35일에 비해 상당히 높았습니다(p < 0.05; 그림 4B). 마지막으로, 120일차(두 번째 추가)에 M 단백질에 특이적인 IFN + T 세포의 수는 두 그룹 모두에서 35일차에 비해 상당히 높았습니다(p< 0.05; 그림 4D).

그림 4. BALB/c 마우스의 SARS-CoV-2 개별 구조 단백질에 대한 T 세포 반응. (A) T 세포 반응은 SARS-CoV-2 S에 걸쳐 중첩된 펩타이드 풀을 사용하여 20시간 동안 자극된 비장 세포에서 IFN-ELISpot을 사용하여 측정되었습니다., (B) N, (C) E, 및 (D) M 단백질. 막대는 평균 ± SD를 나타냅니다. 통계 분석은 양방향 ANOVA와 Sidak의 사후 테스트를 사용하여 수행되었습니다. 여기서 * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.01, **** p < 0.0001.

3.5. pS/pN 또는 pS/pE/pM과의 공동 면역화로 유도되는 시너지 보호

그런 다음 조상 SARS-CoV-2 바이러스로 챌린지 후 면역화된 hACE2 마우스를 사용하여 DNA 백신의 보호 효능을 평가했습니다. 도전 이후, 모의 그룹의 쥐들은 점진적인 체중 감소를 보였습니다. 대조적으로, pS 또는 pS+로 면역화된 마우스는 감염 직후 약간의 체중 감소를 보인 후 회복되었습니다(그림 5A). pS, pS + pN 또는 pS + pE + pM으로 백신을 접종한 마우스에서는 살아있는 바이러스가 검출되지 않았습니다. 또한, pS + pN 백신접종은 pS 백신접종 단독으로 얻은 것에 비해 바이러스 RNA 사본 수를 크게 감소시켰습니다(p= 0.0228; 그림 5B). 더욱이, 폐 조직병리학에서는 모의 그룹과 pN 그룹 모두의 마우스가 염증, 흉막 함입, 폐포 붕괴, 높은 수준의 염증 세포 침윤 및 출혈 부위의 국소 패치를 나타냈다는 것을 입증했습니다. 이에 비해, pS + pN 또는 pS + pE + pM으로 처리된 마우스는 다른 그룹에 비해 더 가벼운 조직병리학적 변화와 더 낮은 챌린지 후 INHAND 점수를 나타냈습니다(그림 5C).

그림 5. 생 SARS-CoV-2 바이러스 공격 후 예방접종의 보호 효능. (A) 챌린지 후 3일 동안 마우스의 체중을 매일 측정했습니다(평균 ± 평균의 표준 오차(SEM), n{3}}). (B) TCID5{{1{12}}}} 분석 및 RNA 사본 수를 통해 결정된 시험처리 후 3일차 폐 균질액의 감염성 SARS-CoV-2 역가. 그룹 간의 통계적으로 유의미한 차이는 일원 분산 분석에 이어 Dunnett의 다중 비교 수정을 사용하여 결정되었습니다(* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 및 **** p < 0.0001). (C) H&E 염색을 이용한 폐 조직병리학적 분석.

4. 토론

이 연구에서 S 및 N 단백질을 발현하는 두 가지 DNA 백신을 사용한 공동 면역화는 높은 수준의 nAb를 유도했으며 생쥐에서 SARS-CoV-2 바이러스 부하를 줄이는 데 매우 효과적이었습니다. S 단백질을 발현하는 DNA 백신은 생쥐가 N/E 및 M 단백질과 공동 면역화되었을 때 3회 예방접종 후 S 단백질 특이적 세포 면역 수준의 증가를 유도하고 공격 후 조직병리학적 변화를 완화했습니다. 우리가 아는 한, 이는 SARS-CoV의 다른 구조 단백질을 코딩하는 DNA 백신과 공동 면역을 받은 S 단백질을 코딩하는 DNA 백신을 사용하는 생쥐에서 면역 및 보호의 상승적 강화를 보여주는 최초의 보고서입니다{{8 }}.

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N 항원 영역의 면역우세 B 세포 에피토프가 여러 연구에서 관찰되었습니다. N 기반 백신은 일반적으로 N 단백질이 바이러스 표면에 표시되지 않기 때문에 nAbs를 유도할 수 없습니다. 특히, S 및 N 단백질을 사용한 공동 면역화는 다른 그룹보다 조상 및 Omicron SARS-CoV-2 바이러스에 대해 더 높은 수준의 nAb를 유도했습니다. 증가된 nAb 반응은 더 나은 바이러스 제거 및 보호 효능과 관련이 있습니다. 우리의 결과는 pS + pN 치료가 pS 단독 치료보다 감염 후 SARS-CoV-2 바이러스 부하를 줄이는 데 더 효과적이라는 것을 보여주었습니다. 이전 연구에서는 M과 N 단백질을 동시에 발현하는 백신으로 예방접종을 한 햄스터가 심각한 체중 감소와 폐 병리로부터 보호되었으며 SARS-CoV-2 공격 후 구강인두와 폐의 바이러스 역가가 크게 감소했다고 보고했습니다. 이는 우리의 결과와 일치합니다 [23]. 불행히도, 바이러스 역가의 감소는 M 또는 N 단백질에 구체적으로 기인할 수 없으며 nAb 수준은 이 연구에서 평가되지 않았습니다. 한 SARS-CoV-2 mRNA 백신 연구에서는 S + N 공동 면역화가 S-특이적 CD8+ T 세포 반응의 증가와 항체 활성 중화를 유도하여 델타 바이러스에 대해 폐를 더 잘 보호한다고 보고했습니다. 이는 이 연구의 결과와 일치합니다[24]. 또 다른 연구에서는 돼지 TGEV-IMMUNE 세포가 시험관 내에서 S와 N 단백질의 조합으로 자극되었을 때 전염성 위장염 코로나바이러스의 N 단백질이 중화 항체의 합성을 촉진했다고 보고했으며, 이 효과는 다음과 같은 보조 T 림프구 반응으로 설명될 수 있습니다. N 단백질 [25].

N-항원 영역의 면역우세 CD4+/CD8+ T 세포 에피토프는 이전에 확인되었습니다. 여러 연구에서 SARS-CoV-2 N 단백질을 기반으로 한 백신이 세포 면역 반응을 효과적으로 유도하는 것으로 보고되었습니다. S+N 그룹은 3회 예방접종 후 S 단백질 특이적 세포 면역 수준이 증가한 것으로 나타났습니다. 한 SARS-CoV-2 mRNA 백신 연구에서는 조합 S + N이 S 단독에 비해 증가된 S 특이적 CD{12}} T 세포 반응을 유도했다고 보고했는데, 이는 우리의 결과와 일치합니다[24]. 또 다른 연구에서는 이중 항원 hAd5 S + N 프라임 백신 접종 단독 후 S 및 N 항원에 대한 T 세포 반응이 이전 SARS-CoV{20}} 감염 환자의 반응과 동일하고 T 세포의 인실리코 예측 모델에서 보고된 바 있습니다. 에피토프 HLA 결합은 hAd5 S+N 백신에 대한 T 세포 반응이 B.1.351 변이체에 대해 효능을 유지할 것임을 시사했습니다. 더욱이, 이전에 SARS-CoV-2-에 감염된 환자의 혈장은 hAd5 S-Fusion 단독보다 이중 항원 S-Fusion + N-ETSD 구조물을 발현하는 세포에 더 높은 결합 친화성을 나타냈으며, 이는 더 나아가 S+N 이중 항원 백신은 S 단일 항원 백신보다 우수하다[26].

살아있는 바이러스는 폐에서 검출되지 않았으며, pS, pS + pN 및 pS + pE + pM 그룹에서는 시험처리 후 체중 감소가 완화된 반면, pN 처리는 바이러스 역가를 효과적으로 감소시키지 못했습니다. 이러한 발견은 백신 표적으로서 S 단백질의 필수성과 유효성을 강조합니다. 특히, pS와 pN을 이용한 공동 면역화는 바이러스 제거에 있어서 pS나 pN보다 더 나은 효과를 나타냈습니다. pS + pE + pM 그룹은 폐의 조직병리학적 변화가 더 적음을 나타냈으며 이는 이전 연구 결과와 일치합니다[15]. S + N 그룹은 S/N 단독으로 면역화된 그룹에 비해 폐 내 바이러스 RNA 사본이 적고, 체중 감소가 감소했으며, SARS-CoV{11}} 공격 후 빠른 회복 시간을 보였으며 이는 다음과 일치했습니다. 이 연구의 결과. 그러나 어느 그룹에서도 중화항체 역가가 검출되지 않았는데, 이는 백신 품종과 실험동물의 차이로 설명될 수 있다[26]. SARS-CoV-2 아데노바이러스 벡터 백신 연구 중 하나는 S 백신이 N 백신과 공동 면역되었을 때 급성 뇌 보호만 제공했다고 보고했습니다[27]. 또 다른 연구에서는 S1/N/RdRp, N/RdRp 및 S1 단백질을 각각 발현하는 Tri:ChAd, Bi:ChAd 및 Mono:ChAd 백신을 개발하고 이를 B.1.351 동물 모델에서 테스트했습니다. Mono: ChAdlungs에서는 광범위한 육안적 병리가 관찰된 반면, Bi: ChAd 및 Tri: ChAd 폐에서는 이러한 병리가 거의 없는 것으로 나타났습니다[28].

더욱이, 백신을 접종하지 않은 동물은 폐 바이러스 부하가 높은 반면, Tri:ChAd 처리는 바이러스 부하를 3.5로그만큼 크게 감소시켰습니다. 이에 비해 Bi: ChAd 및 Mono: ChAd 백신은 모두 바이러스 부하를 약간만 감소시켰습니다. 이러한 결과는 S/N 이중 항원 백신의 변이에 대한 보호 효과가 S 단일 항원 백신의 보호 효과보다 우수할 수 있음을 시사하며 이는 우리의 결과와 일치합니다[28]. 몇몇 연구에서는 N 단백질로 면역된 쥐가 SARS-CoV 감염 후 심각한 폐 염증을 일으킨다고 보고했습니다[29-31]. 이전 연구에서도 마우스 간염 바이러스 N 단백질을 발현하는 아데노바이러스 벡터 백신으로 면역화하면 쥐를 치명적인 감염으로부터 보호하는 것으로 보고되었으며, 이는 N 단백질이 보호 효과를 생성할 수 있음을 입증합니다[32]. 더욱이, CRT/N DNA 백신으로 예방접종을 받은 그룹은 SARS-CoV N 단백질을 발현하는 백시니아 바이러스로 인해 공격 후 바이러스 역가가 크게 감소했습니다[33].

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S 단백질에 대한 한 연구에서는 DNA/단백질 결합 백신이 DNA/단백질 백신 단독보다 체액성 및 세포성 면역을 모두 더 잘 유도하는 것으로 나타났습니다[8]. S 단백질만을 표적으로 하는 백신은 새로운 변종으로 인해 발생하는 경증~중등도 코로나바이러스-19에 대한 보호 효과가 감소한 것으로 나타났습니다. N/E/M 단백질을 포함한 보존된 SARS-CoV-2 구조 단백질의 역할은 백신 설계 및 적용에서 주목할 가치가 있습니다. 왜냐하면 보존된 에피토프에 대한 백신 유도 T 세포 반응은 일반적으로 돌연변이의 영향을 받지 않기 때문입니다. . 한 연구에서는 SARS에서 회복된 환자(n=23)가 2003년 발병 후 17년이 지난 후에도 여전히 SARS-CoV N 단백질에 반응하는 오래 지속되는 기억 T 세포를 보유하고 있으며 이는 SARS CoV에 대해 강력한 교차 반응성을 나타냈다고 보고했습니다. {15}} N 단백질, 교차 보호 백신 표적으로 N 단백질의 사용을 추가로 검증합니다[34]. 이 연구에서는 pS/pN 동시 면역화가 더 높은 nAb 반응, 더 나은 바이러스 제거 및 개선된 세포 면역 반응과 관련이 있으며 pS 단독에 비해 SARS-CoV{20}} 공격 후 더 나은 보호를 제공할 수 있음을 보여주었습니다. 더욱이, SARS-CoV-2 변종은 많은 동물종을 감염시키는 것으로 나타났으며, 일부 야생 동물과 애완동물에서 인간 대 동물 전염이 관찰되었습니다[7]. 따라서 수의용 SARS-CoV-2 백신에 더 많은 관심이 필요합니다. 또한, 나노기술은 백신 최적화에 강력한 도구가 될 수 있으며 더 많은 관심을 받을 가치가 있습니다[2].

이 연구에는 몇 가지 한계가 있습니다. 첫째, 우리는 BALB/c 마우스에서만 DNA 백신 전략을 관찰했으며 향후 연구에서는 다른 동물 모델에서 이러한 백신 요법의 면역원성 효과를 평가해야 합니다. 둘째, S 및 N 단백질을 사용한 공동 면역화에 의해 유도된 증가된 nAb 및 S 특이적 CD8 T 세포 반응의 기본 분자 메커니즘을 완전히 이해하고 이 지식을 활용하여 코로나19를 최적화하려면 추가 연구가 필요합니다.-19 백신 디자인. 마지막으로, N 단백질 특이적 항체의 기능에 대해서는 추가 연구가 필요합니다.

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결론적으로, 이 연구는 SARS-CoV-2 S, N, E 및 M 단백질과의 공동 면역화의 면역 보호 잠재력을 평가했습니다. S 단백질만을 표적으로 하는 몇몇 백신은 새로운 변종 균주에 대한 보호 효과가 감소합니다. 우리의 결과는 현재 및 새로운 SARS-CoV-2 변종을 제어하고 잠재적인 코로나바이러스 전염병을 예방하기 위한 교차 반응성 코로나바이러스-19 백신을 개발하기 위한 토대를 마련할 것입니다.

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