Cistanche Shenqiwan이 제2형 당뇨병을 앓고 있는 Zucker 당뇨병 지방 쥐의 신장 손상, GRP78 및 Autophagy 관련 요인에 미치는 영향

일반 식염수 양. 쥐에게 4주 동안 지속적으로 투여하였다. 쥐의 일반적인 상태를 정기적으로 관찰했습니다. 공복 혈당(FBG) 및 24-시간 소변 마이크로알부민(24시간 U-mAb) 수치를 측정했습니다. 신장 조직을 염색하고 형태를 관찰하였다. 투과전자현미경으로 초미세구조를 관찰하였다. 쥐의 신장 조직에서 GRP78, Beclin-1, LC3의 mRNA 수준을 real-time PCR로 조사하였고, 단백질 수준은 Western blotting으로 조사하였다. 결과 모델군과 비교하여 Shenqiwan 그룹의 쥐는

향상된 모피 광택, 더 많은 체중 증가 및 더 많은 활동; FBG와 24시간 U-mAb 수준 모두 감소했습니다(P < 0.05). 그만큼신장모델 그룹의 쥐가 보여주었습니다.확장된 사구체 모세혈관, 불규칙하게 두꺼워진 기저막, 넓어진 간질 영역 및 분절성 경화증; 신장 세뇨관 위축 및 신장 간질 섬유 조직도 이 신장에서 관찰되었습니다. 이러한 병리학적 변화는 Shenqiwan 그룹에서 완화되었습니다. 모델 그룹과 비교하여 Shenqiwan 그룹에서 GRP78의 유전자 및 단백질 수준이 모두 감소했습니다(P < 0.05). Beclin-1의 단백질 수준

감소했다(P < {{0}}.05). LC3의 단백질 수준이 증가했습니다(P < 0.05). 결론 Shenqiwan은 ZDF 쥐의 신장 손상을 완화하고 소포체 스트레스를 줄이고 자가포식을 강화하여 당뇨병성 신장 질환의 진행을 지연시킬 수 있습니다.

 

키워드: Shenqiwan;제2형 당뇨병; 당뇨병성 신장병; 소포체 스트레스;자가포식; GRP78; Zucker 당뇨병 지방 쥐

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당뇨병성 신장병(DKD)는 다음의 중요한 미세혈관 합병증입니다.진성 당뇨병그리고 주요 원인말기 신장 질환[1]. DKD는 중요한당뇨병의 미세혈관 합병증그리고말기 신장질환의 주요 원인[1]. DKD 환자는 지속적인 단백뇨를 나타낼 수 있으며 지속적으로 감소합니다.사구체 여과율[2]. 그만큼DKD의 병인복잡하며 최근 연구에 따르면 신장의 소포체 스트레스(ERS)가 말기 신질환의 가장 흔한 원인인 것으로 나타났습니다. (소포체 스트레스(ERS)와 자가포식도 DKD와 밀접한 관련이 있으며 이들의 병인에 대한 연구는 DKD 치료에 중요할 수 있습니다. DKD는 한약의 갈증 장애 범주에서 "하소 소멸"과 더 유사합니다.
갈증과 과음, 배뇨의 전형적인 증상은 금괴요(金貴舌)에 기록되어 있으며,신장 치약주요 치료 공식으로 제안되었습니다. 금규요(金匮要略)는 갈증과 과도한 배뇨의 전형적인 증상을 기록하고 다음을 제안했습니다.신장 치약주요 처리 공식으로. TCM으로 DKD를 치료하면 실제로 신장 기능을 효과적으로 보호할 수 있으며 안전하고 신뢰할 수 있는 특성이 있습니다[5-6]. 한약으로 DKD를 치료하면 신장 기능을 효과적으로 보호할 수 있으며 안전하고 신뢰할 수 있는 특성이 있습니다[5-6]. 신장을 튼튼하게 하고 양기를 돕는 신장기환의 효능은 관련 연구에서 확인되었다[7]. 우리의 이전 연구 또한 우리의 이전 연구는 신장 제나라 알약이 당뇨병 쥐의 신장 조직의 구조와 기능에 좋은 보호 효과가 있음을 보여주었습니다 [8]. 본 연구에서는 Zucker diabetic fat rat (ZDF)의 신장조직손상, ERS, autophagy-associated factor에 대한 신장기환의 효과를 관찰하였다. 이 연구에서 우리는 ZDF 쥐의 신장 손상의 가능한 메커니즘을 조사했습니다.신장 조직 손상, 신장 치약에 의해 매개되는 ERS 및 autophagy 관련 요인.

1 재료
1.1 실험동물
20 12-주된 SPF 수컷 ZDF 쥐(체질량 390-410 g, 4주 동안 5C08 고품질 설치류 먹이를 먹여 제2형 당뇨병 유도 완료) 및 712-주- 오래된 SPF 수컷 Zucker Lean(ZL) 쥐(체질량 350-380 g)는 Beijing Viton Lehua Laboratory Animal Technology Co.에서 구입했습니다. 모든 쥐는 중일 우호 병원 임상 의학 연구소의 장벽 환경에 수용되었습니다. , 허가 번호: SYXK (Beijing) 2016-0043, 플랫폼은 방벽 내부에 독립적인 환기 시스템을 제공하여 빛과 어둠이 12-h 번갈아 가며 실내 온도를 23-25도 유지했습니다. , 실내 상대 습도는 50%-60%입니다. 모든 쥐는 급식 기간 동안 자유롭게 물을 마시고 급식할 수 있었습니다.

1.2 윤리적 검토
동물 실험은 승인 번호 BUCM-4-2021102801-4034으로 베이징 중국 전통 의학 대학(BUCM) 학술 위원회의 실험 동물 윤리 소위원회의 승인을 받았습니다.
1.3 주요 약물 및 시약
석판 (Shu Di Huang, Shan Yu Fei, Shan Yao, Mudan Pi, Fu Ling,시탕슈, Ze Xie, Gunner's Fructus, Gui Zhi)의 달인신장 치알약은 Beijing Tong Ren Tang Co. 생리 식염수, 사양: 500mL, Shandong Hualu Pharmaceutical Co. Silver Staining Solution(Beijing Regen Biotechnology Co., Ltd., Lot No. DG0090), Magic SYBR 혼합물(Jiangsu Kangwei)에서 구입했습니다. Century Biotechnology Co., Ltd.), mRNA 역전사 키트(Thermo Fisher Scientific, Inc.), RNA TRIzol Reagent(RNA TRIzol Reagent), RNA TRIzol Reagent(RNA TRIzol Reagent). RNA TRIzol Reagent(Beijing Solabao Technology Co., Ltd.), Rat Urine Microalbumin ELISA Kit(Jiangsu Kote Biotechnology Co., Ltd., Lot No. KT8560-A), GRP78 BiP 항체, LC3B 항체 및 Beclin{ {5}} 항체(Abcam, 영국)(배치 번호: ab108613, ab192890, ab207612), 토끼 항-GAPDH 다클론 항체(Proteintech, 미국), 염소 항-토끼 IgG(H&L)-HRP(Beijing Baiao Yijie Technology Co. (주).

 

혈당 측정기, 혈당 검사지(Shanghai Roche Diagnostic Products Co. Ltd.), 저온 고속 원심 분리기(Eppendorf, Germany), 형광 정량 PCR 기기, 이중 수직 전기영동 기기 및 이동 전기영동 기기(Burroughs Life Medical Products) Co. (Leica, 독일), 투과 전자 현미경(Hitachi, 일본).

2가지 방법
2.1 실험용 약물의 준비
달인신장기환"장티푸스 처방의 복용량과 비율에 관한 연구"[2015] 초판에서 고대와 현대의 한계량계 비율에 따라 금귀요[9]의 신장-기 환약의 복용량을 변환하여 준비했습니다. ], 실험에 필요한 달인의 용량은 다음과 같다.시탕슈10g, Shan Yao 12g, Mudan Pi 9g, Fu Ling 9g, Ze Xie 9g, Gunnera 3g 및 Gui Zhi 3g. 약물을 증류수에 2시간 동안 담갔다. 달인 것을 30분 동안 농축하고 멸균 거즈를 통해 여과하였다. 약재를 30분 동안 달인 후 나머지 약재를 넣고 1시간 동안 달인다. 용액의 온도를 상온으로 낮춘 후 농축하여 멸균 거즈로 여과하고 여액을 -20도에서 포장하여 보관한다. 약물은 1주일 이상 보관하지 않아야 하며 용액은 투여하기 전에 실온에 두어야 합니다.

2.2 동물 모델 설정 및 그룹화
ZDF 쥐를 4주 동안 5C08 고지방식이로 유도하였고, 혈당은 12주령에 꼬리 끝 채혈로 측정하였다. 신장기환군에 있는 쥐에게 신장기환의 물 달인을 제공하고, "실험 동물의 질병 모델"[10]의 공식에 따라 쥐당 8.12g/kg의 일일 투여량을 계산하고, 투여 농도를 0.812 g/mL이었고, 모델군과 대조군의 쥐에게 해당 부피의 식염수를 4주 동안 투여하였다.

2.3 쥐의 일반 상태 및 공복 혈당(FBG) 검사
쥐의 일반적인 상태를 매일 관찰하고 기록했으며 체중을 정기적으로 측정했습니다. 12주령과 16주령 말기에 쥐의 꼬리 끝에서 8시간 금식 후 혈액을 채취하여 FBG를 Roche 혈당 측정기와 테스트 스트립으로 측정하였다. 2.4 24-h 소변 마이크로알부민(24-h U-mAlb)은 생후 16주 말에 측정되었고 24-h U-mAlb 농도는 지침에 따라 측정되었습니다. 리사 키트.

2.5 신장 조직 표본 수집
생후 16주 말에 모든 쥐는 8시간 동안 금식하였다. 마취 후 복강을 열고 양측 신장을 노출시킨 후 복막을 온전하게 적출하여 벗겨냈다. 신장 피질을 분리하고 부분적으로 3μm 파라핀 절편을 준비하기 위해 4% 파라포름알데히드에 고정했습니다. 부분적으로 1mm3 조직 블록으로 자르고 초박 절편을 준비하기 위해 2.5% 글루타르알데히드에 고정했습니다. 나머지 신장 조직은 Realtime PCR 및 Western blotting 분석을 위해 -80도에 보관했습니다.

 

2.6 신장 조직의 형태학적 관찰 적용
PAS 염색법, Masson 염색법, hexaammonium silver-hematoxylin-eosin 염색법을 이용하여 관찰하였다.신장 조직병리학적 변화광학 현미경으로 이미지를 획득합니다. 투과전자현미경을 적용하여 신장 조직의 미세구조 변화를 관찰하고 이미지를 수집하였다.

 

2.7 실시간 PCR 분석
겨울 왕국신장 조직얼음에 분쇄하고 TRIzol 시약을 첨가하여 total RNA를 추출한 후 반경 9.5 cm, 4도에서 원심분리하였다. 상층액을 12 000r/min에서 10분 동안 원심분리하여 추출한 다음, 클로로포름으로 15분 동안 원심분리하였다. 상층액을 다시 상온에서 10분 동안 15분 동안 원심분리하고 상층액을 75% 에탄올로 세척하였다. mRNA 수준에서의 발현. Primer Premier 5.0 소프트웨어를 사용하여 프라이머를 설계하고 Shanghai Bioengineering Co. Ltd.에서 합성했습니다. 프라이머 서열은 다음과 같습니다.