후성유전 조절자 BRD4는 쥐 신장에서 카드뮴 유발 염증 반응에 관여합니다

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Zhongguo Gong et al

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요약

카드뮴(Cd)은 잠재적인 염증 유발제로 설명되어 왔으며, 증가하는 증거는 부적절한 염증이신장 손상. 따라서 Cd에 의한 염증반응에 대한 연구는 Cd에 의한 신독성의 기전을 밝히는 데 큰 의미가 있다. 브로모도메인 함유 4(BRD4)는 많은 염증성 질환의 발달에 관여하는 중요한 후성유전적 조절자이지만, Cd-triggered에서 조절 역할염증성답변은 아직 명확하지 않습니다. 여기에서 우리는 Sprague-Dawley 쥐(2 mg/kg BW, ip, 연속 5일)와 쥐에서 Cd를 사용한 치료를 발견했습니다.신장 세포line (NRK{0}}E, 0–10 μM, 12 h) JQ1(BRD4 억제제, 25 mg/kg BW, ip)에 의해 감소될 수 있는 염증성 사이토카인의 전사를 유도했습니다. , 생체 내에서 연속 3일, 0.5 μM, 시험관 내 12시간) 또는 BRD4 작은 간섭 RNA(siRNA, 시험관 내), 이는 BRD4가 Cd 유발 염증 반응에 참여함을 시사합니다. 다음으로, 우리 연구는 Cd 유발 염증 반응에서 BRD4의 역할을 명확히 했습니다. BRD4의 억제는 생체 내 및 시험관 내에서 Cd 촉진 NF-κB 핵 전위 및 활성화를 감소시켰다. Cd는 생체 내 및 시험관 내에서 RelA K310의 아세틸화 수준을 증가시키고 아세틸화된 NF-κB RelA에 대한 BRD4 결합을 향상시켰으며, 이는 BRD4를 억제함으로써 폐지되었습니다. 요약하면, 우리의 연구는 BRD4가 NF-κB 신호 전달 경로의 활성화를 매개하고 쥐에서 아세틸화된 NF-κB RelA에 대한 결합을 증가시킴으로써 염증성 사이토카인의 Cd 유발 전사에 관여한다는 것을 시사합니다.신장,따라서 BRD4는 Cd 유발 신장 질환에 대한 잠재적인 치료 표적이 될 수 있습니다.

키워드: BRD4카드뮴신장염사이토카인 NF-κB JQ1

1. 소개

카드뮴(Cd)은 독성이 높고 반감기가 긴 중금속 오염물질입니다. 산업 생산의 발전과 함께 환경 안보와 인간 건강에 대한 Cd 오염의 증가된 위협이 우려를 불러일으켰습니다(Wang et al., 2020; Horiguchi and Oguma, 2016). 체내에 흡수된 후 Cd는 다기관 손상을 유발하고신장주요 표적 기관이다(Fernando et al., 2020; Zhao et al., 2021). 이전에 우리는 자가포식 억제, 산화 스트레스 및 세포자멸사가 쥐에서 Cd로 인한 신독성에 상승적으로 기여한다는 것을 체계적으로 확인했습니다(Liu et al., 2017; Wang et al., 2017). 염증은 감염이나 부상에 대한 방어적 반응으로 작용하는 생리학적 반응이지만, Cd에 의해 유도된 통제되지 않고 부적절한 염증 반응은 방관자 정상 조직을 손상시키고 자가면역 질환을 촉진하는 등의 위해를 유발할 수 있다(Hossein-Khannazer et al., 2020; Zhang et al., 2020; 알., 2020). Cd가 유발하는 염증 반응은 심혈관 질환과 간 손상을 악화시켜 염증이 Cd 매개에서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다.신장병리학 적 과정 (Fagerberg et al., 2017; Almeer et al., 2019).

후성유전학은 비-DNA 서열 변화를 기반으로 하는 유전자 발현의 유전 가능한 변형을 말하며, 이러한 변형의 가역성은 새로운 치료 표적의 발견을 가능하게 합니다(Vendetti and Rudin, 2013). 브로모도메인 및 말단외 도메인(BET) 패밀리에는 브로모도메인 함유 2(BRD2), BRD3, BRD4 및 브로모도메인 고환 특이적(BRDT)이 포함되며, 이는 2개의 브로모도메인과 히스톤 및 비-히스톤의 아세틸화 라이신에 결합하는 것을 특징으로 합니다. Lochrin et al., 2014; Chatterjee and Bohmann, 2018). BET 단백질은 많은 유전자의 전사 공동 활성제로 작용하여 다양한 병리학 모델에서 세포 주기, 염증 반응, 산화 스트레스 및 기타 생리학적 과정을 조절합니다(Jiao et al., 2020; Wang et al., 2019b). BRD4는 특히 잘 연구된 BET 단백질 패밀리의 구성원이며, 축적된 연구에 따르면 다양한 조절에 있어 새로운 후성유전적 표적으로 보고되었습니다.신장 질환, 만성 신염, 당뇨병성 신병증 및 실험적 신장 손상을 포함합니다(Zeng and Zhou, 2002; Morgado-Pascual et al., 2019). BRD4는 많은 질병에서 염증 반응을 조절하기 위해 핵 인자-κB(NF-κB) 의존적 전사 과정에 참여하는 것으로 확인되었습니다(Xu and Vakoc, 2014; Suarez-Alvarez et al., 2017). BRD4는 브로모도메인을 통해 라이신 310(RelA-K310ac)에서 아세틸화된 RelA(NF-κB 서브유닛, 단백질 코딩 유전자)에 의해 모집될 수 있으며, 따라서 사이클린 의존성 키나제 9(CDK9)를 활성화하고 RNA 폴리머라제 II를 인산화하여 NF-κB 표적 유전자의 전사(Hajmirza et al., 2018). 최근 연구에 따르면 BRD4 억제제는 염증성 질환에 대한 잠재적인 치료 옵션이 될 수 있습니다. 쥐의 척수 손상 모델에서 BRD4의 억제는 염증 반응을 약화시키고 미세아교세포의 기능적 회복을 촉진했습니다(Dey et al., 2019). 또한, BRD4의 억제는 편측성 요관 폐쇄, 항막 기저 GN 및 안지오텐신 II 주입의 쥐 모델에서 실험적 신장 염증을 폐지했습니다(Suarez-Alvarez et al., 2017).

Cd의 잠재적인 전염증 효과 및 염증에 대한 BRD4의 조절 효과의 관점에서, 우리는 BRD4가 Cd-유발 염증 반응에 관여한다는 가설을 세웠다. 예상대로 BRD4는 Cd에 노출된 쥐의 신장 모델에서 염증성 사이토카인의 전사 과정을 매개합니다. 우리의 연구는 Cd에 의해 유발된 염증 반응의 잠재적인 메커니즘을 밝히고 Cd에 의해 유발된 신독성 치료에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.

2. 재료 및 방법

2.1. 화학물질 및 항체

염화 카드뮴(CdCl2, 무수, 439800)은 Sigma-Aldrich(Carlsbad, CA, USA)에서 구입했습니다. ( 플러스 )-JQ1(HY-13030)은 MedChemExpress(Monmouth Junction, NJ, USA)에서 입수했습니다. Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, China, P0027)에서 핵 단백질 추출 키트를 구입했습니다. 효율적인 화학발광 키트(ECL, 32209) 및 비신코닌산 단백질 분석 시약(BCA, 23225)은 Thermo Fisher Scientific(Madison, WI, USA)에서 구입했습니다. NF-κB p65({11}}AP), IL{12}}({13}}AP), TNF-({15}}AP) 단백질에 대한 1차 항체가 사용되었습니다. Proteintech Group(중국 우한); -액틴(3700s), 히스톤 H3(His3, 4499), Sirtuin 1(Sirt1, 8469), 정상 토끼 IgG(IgG, 4394)는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)에서 구입했습니다. BRD4(ab128874), K(리신) 아세틸트랜스퍼라제 3(KAT3B/Ep300, ab14984), NF-κB RelA(아세틸 K310)(RelA-K310ac, ab19870), Alexa Fluor® 488-50결합 당나귀(Alexa Fluor® 488–conjugated donkey)를 구입했습니다. Abcam(영국 케임브리지) 출신. 두 번째 항체: Goat Anti-Mouse IgG(H plus L)(115-035-003) 및 Goat Anti-Rabbit IgG(H plus L)(111-035-003)는 Jackson ImmunoResearch(West Grove, PA, USA)에서 구입했습니다. ).

2.2. 동물과 실험

24마리의 Sprague-Dawley 쥐(수컷, 6주령, 110-120g)를 Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd(Jinan, Shandong, China)에서 구입했습니다. 쥐는 환경적으로 통제된 방(24 ± 5도, 12시간 명암 주기)에서 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 실험 절차는 동물 실험에 대한 유럽 공동체 위원회 지침 2010/63/EU에 적용되었으며 모든 절차는 Yangzhou University Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다. 순응 1주일 후, 쥐를 무작위로 4개의 그룹으로 나누었습니다. (1) 대조군: 해당 용매(생리식염수 또는 2-히드록시프로필{12}}시클로덱스트린 용액)를 복강 내 주사했습니다. (2) Cd군: CdCl2(2 mg/kg 체중, 생리식염수에 용해)를 연속 5일 동안 복강내 주사하여 Cd 중독 모델을 확립했습니다. (3) Cd + JQ1 그룹: Cd 중독 모델을 수립하기 위해 연속 5일 동안 CdCl2(2mg/kg 체중)를 복강 내 주사하고 JQ1(25mg/kg 체중, 2-하이드록시프로필{{ 25}}시클로덱스트린 용액) 6-8일에 복강 내 주사. (4) JQ1 그룹: 6-8일에 JQ1(25mg/kg 체중)을 복강 내 주사합니다. 쥐 혈청 및 신장 조직의 Cd 함량 통계는 Cd 노출 쥐 모델의 성공적인 확립을 반영하여 표 S1에 나열되었습니다.

치료 8일 후, 12시간의 금식 후 깊은 마취하에 경추 탈구로 쥐를 죽였습니다. 신장 조직을 절개하고 웨스턴 블롯 및 정량적 PCR(qPCR) 분석을 위해 각 신장의 1g 조직을 -80℃에서 신속하게 보관하였다. 조직의 나머지 양은 면역조직화학(IHC) 염색을 위해 4% 파라포름알데히드(PFA)에 신속하게 고정되었습니다.

2.3. 세포 배양 및 치료

쥐 신장 세포주(NRK{0}}E)는 중국 과학원 상하이 세포 은행에서 입수했습니다. NRK-52E 세포는 5% 소태아혈청(FBS, Gibco, 10437-028), 페니실린 및 스트렙토마이신(1 00 U/mL) 37도에서 5% CO2 및 95% 공기의 가습 조건에서 . CdCl2(초순수 용해) 및 JQ1(디메틸 설폭사이드 용해)은 4도 및 -20도에서 별도로 보관하고 작동 용액으로 희석하여 사용합니다. 실험 설계는 다음과 같습니다. (1) 세포를 12시간 동안 0, 2.5, 5, 10μM Cd로 처리하거나 0, 6, 12, 24시간 동안 5μM Cd로 처리하여 후속 분석을 수행했습니다. (2) 세포를 5μM Cd 및/또는 0.5μM JQ1로 12시간 동안 처리하여 후속 분석을 수행했습니다. (3) 세포를 siBRD4로 형질감염시키고/시키거나 추가 12시간 동안 5μM Cd로 처리하여 후속 분석을 수행하였다.

2.4. 작은 간섭 RNA 형질감염

제품 설명서에 따라 Lipofectamine RNAiMAX 형질감염 시약(Thermo Fisher Scientific, Cat# 13778150)을 사용하여 20nM BRD4 small interfering RNA(siBRD4, Invitrogen, CA, USA)를 NRK{3}}E 세포에 24시간 동안 형질감염시켰습니다. 다음 센스 siRNA가 사용되었습니다:

5'-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA-3'의 표적 서열을 갖는 siBRD4;

5'- UUCUCCGAACGUGUUCACGUTT-3'의 표적 서열을 갖는 siCt(siRNA 음성 대조군).

2.5. 웨스턴 블로팅

신장 조직 샘플과 NRK{0}}E 세포는 총 단백질을 추출하기 위해 프로테아제 억제제가 포함된 RIPA 완충액에서 용해되었습니다. 핵단백질은 미리 신선한 조직과 세포에서 준비하여 -80도에서 보관하였다. 단백질 샘플(샘플당 20-30ug)을 SDS-PAGE 전기영동으로 분리한 다음 폴리비닐리덴 플루오라이드 막(Millipore, ISEQ00010)으로 옮겼습니다. 막을 5% 탈지유로 90분 동안 차단하고 1차 항체 -actin(1:5000), NF-κB p65(1:1000), IL{17}}( 1:600), TNF-(1:600), BRD4(1:1000), Ep300(1:1000), Sirt1(1:1000), His3(1:1000), RelA-K310ac(1:1000). 그런 다음 막을 TBST로 세척하고 해당 이차 항체(1:10000)와 함께 실온(RT)에서 90분 동안 인큐베이션했습니다. 막을 전기화학발광(ECL, ThermoFisher Scientific)과 함께 배양하고 Chemidoc XRS(Bio-Rad, Marnes-La Coquette, France)에서 측정하고 ImageJ(NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 광학 밀도를 분석했습니다.

2.6. 면역형광(IF) 염색

NRK{{0}}웰 플레이트에 시드된 E 세포는 약 6{11}}% 합류로 성장했습니다. 세포를 5μM Cd 및/또는 0.5μM JQ1로 12시간 동안 처리한 다음 PFA(4%, 10분)로 고정하고 Triton X{10}}(0.1%, 15분)로 투과화하고 BSA로 차단했습니다. (2%, 90분) 실온에서 1차 항체(NF-κB p65, 1:50 희석)와 함께 4도에서 밤새 인큐베이션했습니다. PBS로 3회 세척한 후 2차 항체(1:500 dilution)로 90분간 배양하고 DAPI로 실온에서 5분간 배양한 후 공초점 현미경으로 세포를 관찰하였다. NF-κB 핵 전위는 3개의 독립적인 연구에서 분석되었습니다.

2.7. qPCR

RNAiso Plus 키트(Takara Bio, Shiga, Japan)를 사용하여 신장 조직 및 NRK{0}}E 세포의 총 RNA를 추출했습니다. 제조사 매뉴얼(Roche, Basel, Switzerland)에 따라 1 ug의 total RNA를 사용하여 1차 사슬 cDNA를 합성하였다. LightCycler® 96 Real-Time PCR System(Roche)을 사용하여 상대 mRNA 수준을 검출하기 위해 웰당 2μL 상보적 DNA(cDNA)를 취했습니다. 방정식 2-△△CT에 따라 상대 mRNA 수준을 계산합니다. 프라이머는 표 S2에 나열되어 있습니다. -액틴은 쥐 참조 유전자였습니다.

2.8. 공동 면역 침전(Co-IP)

신장 조직과 NRK{0}}E 세포는 새로 준비된 세포 용해 완충액(20mM HEPES–KOH pH 7.5, 150mmol/L NaCl, 2mmol/L EDTA, 1% Triton X{8} }) PMSF를 포함합니다. 단백질 G 비드(샘플당 100μL, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 샘플당 2ug BRD4, RelA-K310ac 또는 IgG 항체와 혼합하고 실온에서 10분 동안 회전했습니다. 그런 다음, 총 단백질 용해물을 비드-항체 복합체와 함께 4도에서 밤새 인큐베이션했습니다. 세포 용해 완충액으로 3회 세척한 후 면역 침전물을 1 x SDS PAGE 샘플 완충액으로 재현탁하여 샘플을 구성했습니다. 표적 단백질은 항-BRD4 및 항-RelA K310ac 1차 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅을 사용하여 검출하였다.

2.9. 통계 분석

모든 데이터는 최소 3번의 독립적인 실험에서 얻어졌으며 달리 언급되지 않는 한 평균 ± SEM으로 표시되었습니다. 실험 그룹은 SPSS 22.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던트 t-검정 또는 일원 분산 분석(ANOVA)에 의해 비교되었습니다. 유의성은 p < 0.05로="">

3. 결과

3.1. Cd는 생체 내 및 시험관 내에서 염증성 사이토카인의 발현을 유도합니다.

환경 오염 물질인 Cd는 일련의 생물학적 과정을 조절하여 신장 손상을 유발하는 것으로 입증되었습니다(Wang et al., 2019c). 본 연구에서는 Cd에 의한 신독성에 염증이 관여하는지 알아보기 위해 Cd 노출 후 염증성 사이토카인의 전사 수준 변화를 조사하였다. 데이터에 따르면 Cd 노출은 NRK{4}}E 세포(그림 1A-B)와 쥐의 신장 조직(그림 1C)에서 인터루킨(IL)-1과 종양 괴사 인자(TNF)-단백질 수준을 유의하게 증가시켰습니다. -디). 한편, 그림 1E-F에서 볼 수 있듯이 Cd 노출은 염증성 사이토카인(IL{11}}, IL{12}}, TNF- 및 (Monocyte chemoattractant protein-1) MCP)의 전사 수준을 향상시켰습니다. -1) 생체 내 및 시험관 내. 이러한 발견은 Cd가 쥐의 신장에서 염증성 사이토카인의 발현을 유도함을 시사한다.

3.2. BRD4는 염증성 사이토카인의 Cd 유도 전사 과정에 참여합니다

BRD4는 많은 질병에서 염증 과정을 조절하기 위해 아세틸화 히스톤 또는 비-히스톤에 결합하는 새로 기술된 후성 유전적 조절인자입니다. 여기에서 BRD4 억제제 JQ1과 BRD{4}}siRNA를 사용하여 Cd 유발 염증 반응에 대한 BRD4의 역할을 조사했습니다. 데이터에 따르면 Cd 상승된 IL{8}} 및 TNF-단백질 수준은 생체 내 및 시험관 내 JQ1 처리(그림 2A-D) 및 시험관 내 BRD4 녹다운(그림 S1A-B)에 의해 하향 조절되었습니다. 한편, JQ1 처리는 NRK-52E 세포에서 IL{18}}, IL{19}}, TNF- 및 MCP{21}}의 Cd 강화 전사 수준을 유의하게 억제했습니다(그림 2E). 및 래트 신장 조직(도 2F). 또한 BRD4 녹다운은 NRK{27}}E 세포에서 Cd 증가된 염증성 사이토카인 전사 수준을 유의하게 감소시켰습니다(그림 S1C). 종합적으로, 이러한 발견은 BRD4가 쥐의 신장에서 Cd에 의해 유발되는 염증 반응의 중요한 조절자임을 시사합니다.

3.3. BRD4 발현 수준은 Cd 노출 후에도 변하지 않습니다.

다음으로, Cd 노출 후 BRD4의 발현 수준의 변화를 검출하였다. NRK{1}}E 세포에 농도 구배에서 Cd를 처리하고, 생체 내 및 시험관 내에서 신장에서 BRD4 발현에 대한 Cd의 영향을 설명하기 위해 5일 동안 쥐에게 Cd를 복강 내 주사했습니다. 결과는 BRD4 단백질 수준이 Cd에 노출된 NRK{6}}E 세포(그림 3A-B)와 쥐의 신장 조직(그림 3C-D) 모두에서 변경되지 않았음을 보여주었습니다. 또한 BRD4 mRNA 수준은 Cd 노출 후 변경되지 않았습니다(그림 3E-F). 이러한 결과는 BRD4가 Cd-유발 염증 반응을 매개하고 발현 수준의 변화에 ​​의존하지 않는다는 것을 나타낸다.

3.4. BRD4는 Cd 촉진 NF-κB 핵 전위를 조절합니다

우리 연구에서 Cd 유발 염증 반응에서 BRD4의 역할을 탐구했습니다. NF-κB 신호전달 경로 변경은 염증성 사이토카인의 전사와 밀접한 관련이 있습니다(Chi et al., 2021). 우리의 연구는 BRD4가 Cd-조절 핵 전위 및 NF-κB의 활성화에 관여한다는 것을 발견했습니다. 먼저, NF-κB의 세포내 위치를 IF 염색 및 IHC 염색에 의해 결정하였다. 그림 4A와 D의 데이터는 JQ1이 NRK{12}}E 세포와 쥐의 신장 조직에서 Cd로 촉진된 NF-κB 핵 전위를 억제함을 보여줍니다. 한편, 웨스턴 블롯 결과는 JQ1이 생체 내(도 4B-C) 및 시험관 내(도 4E-F)에서 NF-κB의 Cd 증가 핵 단백질 수준을 유의하게 감소시켰음을 보여주었다. 유사하게, BRD4 녹다운은 또한 NRK{28}}E 세포에서 Cd로 촉진된 NF-κB 핵 전좌를 유의하게 억제하고(그림 S2A) NF-κB의 Cd 증가 핵 단백질 수준을 감소시켰습니다(그림 S2B-C). 종합하면, BRD4의 억제는 Cd에 의해 촉진된 NF-κB 핵 전위를 감소시킬 수 있으며, 이는 BRD4가 Cd 노출 후 신장에서 NF-κB 신호 전달 경로의 활성화를 매개한다는 것을 시사합니다.

3.5. Cd는 RelA K310 아세틸화 수준을 증가시킵니다.

연구에 따르면 BRD4가 브롬 도메인을 통해 아세틸화된 RelA K310에 결합하여 NF-κB 의존성 전사를 조절하는 것으로 확인되었습니다(Morgado-Pascual et al., 2019; Zhong et al., 2018). 따라서, RelA K310의 아세틸화 수준과 두 효소의 발현이 검출되었다. 데이터에 따르면 RelA-K310ac 및 아세틸라제 Ep300 단백질 수준은 Cd 농도가 증가함에 따라 지속적으로 감소한 반면, 탈아세틸라제 Sirt1 단백질 수준은 NRK{11}}E 세포(그림 5A-B)와 쥐의 신장 조직(그림 5A-B)에서 점차 증가했습니다. 5C-D). 또한, Ep300 및 Sirt1 mRNA 수준은 동일한 경향을 나타냈다(도 5E-F). 이러한 결과는 Cd가 RelA K310의 아세틸화 수준을 촉진하므로 BRD4가 신장에서 Cd에 의해 유발되는 염증성 사이토카인 전사에 관여할 수 있음을 시사합니다.

3.6. Cd는 전사 기능을 향상시키기 위해 RelA-K310ac에 대한 BRD4 결합을 증가시킵니다.

아세틸화 부위에 대한 결합은 BRD4의 전사 조절의 기초입니다(Huang et al., 2009). Cd가 RelA-K310ac에 대한 BRD4 결합을 증가시켜 BRD4 기능을 조절하는지 여부를 확인하기 위해 Co-IP를 통해 RelA-K310ac와 ​​BRD4 간의 상호작용을 검출했습니다. 그림 6A의 데이터는 Cd가 NRK{14}E 세포에서 RelA-K310ac와 ​​BRD4 사이의 상호작용을 유의하게 향상시켰으며, 이는 JQ1 처리 또는 BRD4 녹다운에 의해 완화되었음을 보여줍니다. 또한, 쥐의 신장 조직에서도 동일한 경향이 관찰되었다(Fig. 6B). 이러한 결과는 Cd가 BRD4와 RelA-K310ac의 결합을 향상시켜 NF-κB 의존성 전사를 촉진하고 이어서 Cd 유발 염증 반응에 기여함을 보여줍니다.

4. 토론

Cd는 독성이 높기 때문에 염증을 유발할 수 있는 것으로 보고되었지만 정확한 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았습니다(Arab-Nozari et al., 2020; Ghosh, 2018). 우리의 연구는 Cd가 쥐의 신장 세포에서 염증성 사이토카인 발현을 유도한다는 것을 확인했고, 염증을 포함한 일련의 세포 과정에서 중요한 기능을 하는 후성 유전학적 표적인 BRD4가 Cd에 의해 유발된 염증 반응에 기여한다는 것을 발견했습니다. 추가 실험은 BRD4가 Cd 촉진 NF-κB 신호 전달 경로 활성화에 관여한다는 것을 나타냅니다. 또한 Cd는 RelA K310의 아세틸화 수준을 증가시켜 아세틸화된 NF-κB RelA에 대한 BRD4 결합을 증가시켜 NF-κB 의존성 염증성 사이토카인 전사를 촉진합니다.

염증은 외인성 화학물질에 대한 자연 방어 기전 중 하나인 반면, 통제되지 않고 부적절한 염증 반응은 정상 조직을 손상시키고 자가면역 질환을 유발할 수 있습니다(Jian et al., 2018). 염증의 Cd 증가 생물학적 마커는 종종 다양한 질병과 관련이 있습니다. 연구에 따르면 Cd 유도 염증은 죽상동맥경화증과 관련이 있습니다(Tinkov et al., 2018). 또한, Cd는 폐 및 고환 조직 손상에 기여하고 간독성을 유발하는 염증성 사이토카인의 발현을 촉진합니다(Koopsamy Naidoo et al., 2019; Arafa et al., 2014). 이러한 유해한 영향은 염증 반응이 Cd로 인한 신장 손상과 관련되어 있다는 우리의 결과와 일치합니다. Cd 유발 염증의 발생 메커니즘에 초점을 맞춘 연구가 증가하고 있습니다. 잘 연구된 BET 단백질 계열 구성원인 BRD4는 염증을 포함한 많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다. 여기에서 JQ1(BRD4의 억제제)과 siRNA는 BRD4의 기능적 활성을 조절하는 데 사용되었으며 BRD4의 억제가 쥐의 신장에서 염증성 사이토카인의 Cd에 의한 전사를 감소시키는 것으로 나타났습니다. . 일반적으로 BRD4 발현의 조절장애는 염증 반응의 발생에서 중요한 사건이라고 믿어집니다. 척수 손상, 병적 심장 비대 및 기타 염증 관련 질병에서 장애 BRD4 발현은 염증성 사이토카인의 발현에 기여했습니다(Zhu et al., 2020; Marazzi et al., 2018; Ren et al., 2019). 그러나 Cd는 현재 실험 조건에서 BRD4의 발현 수준에 영향을 미치지 않았으므로 BRD4가 다른 경로를 통해 Cd에 의해 유발된 염증 반응을 매개하는지 여부를 고려하게 되었습니다.

NF-κB는 염증 과정에서 중요한 조절 인자이며 많은 염증 매개체의 발현을 조절하는 역할을 합니다(Lawrence, 2009). BRD4가 NF-κB 신호 전달 경로의 조절에 관여한다는 연구 결과가 보고되었습니다. Huang et al. (2017)은 BRD4가 p38 및 JNK-MAPK 경로를 통해 IKK 매개 NF-κB 활성화를 조절한다고 제안했습니다. Wang et al. (2019a)는 BRD4 녹다운 또는 JQ1 처리가 미세아교세포에서 지질다당류(LPS) 활성화 NF-κB 신호 전달 경로를 차단한다는 것을 발견했습니다. Meng et al. (2014)는 JQ1 처리가 LPS 처리된 RAW 264.7 세포에서 NF-κB의 활성화를 억제함으로써 염증성 사이토카인의 발현을 차단한다는 것을 입증했습니다. 이러한 보고서는 BRD4가 많은 염증 모델에서 NF-κB의 활성화를 매개하는 반면 BRD4를 억제하는 것은 항염증에 대한 효과적인 치료적 접근임을 나타냅니다. 현재 연구에서 BRD4의 억제는 Cd에 노출된 쥐의 신장 조직과 NRK{27}}E 세포에서 NF-κB의 핵 전위를 차단하여 BRD4가 Cd에 의해 활성화된 NF-κB 신호 전달 경로를 매개함을 시사합니다.

일반적으로 NF-κB가 다양한 자극에 의해 활성화되고 핵으로 전위된 후 BRD4는 K310 부위에서 아세틸화된 NF-κB RelA에 결합하여 핵에서 안정성과 전사 활성을 증가시킵니다(Hajmirza et al., 2018). 따라서 RelA K310의 아세틸화 수준은 염증 반응에 대한 BRD4의 조절 기능에 영향을 미칩니다. 해마 뉴런에서 탈아세틸화효소 Sirt1은 RelA K310 탈아세틸화를 매개하여 BACE1 발현을 조절하여 뉴런 아밀로이드 생성에 기여했습니다(Flores-Leon et al., 2019). 교모세포종 세포에서 광역학 요법 스트레스는 데아세틸라제 Sirt1을 하향 조절하고 아세틸라제 Ep300을 활성화하여 RelA-K310ac 수준을 증가시키고 생존을 위한 산화질소 생성을 증가시켰습니다(Fahey et al., 2019). 우리의 연구는 Cd가 Ep300 발현을 증가시키고 Sirt1 발현을 감소시켜 RelA K310의 아세틸화 수준을 촉진한다는 것을 발견했으며, 이는 Cd가 RelA K310의 아세틸화 수준을 증가시켜 조절 기능 BRD4에 영향을 미친다는 것을 나타냅니다.

특히, 우리의 결과는 JQ1 치료가 BRD4 녹다운보다 Cd 유발 염증 반응을 완화시키는 데 더 효과적임을 보여주었습니다. JQ1은 BRD4와 높은 결합 친화력을 가지며 염색체에 대한 BRD4 결합을 거의 완전히 차단할 수 있는 반면, siBRD4는 BRD4 단백질 발현을 방해하여 표적 부위에 대한 BRD4 결합을 감소시킬 수 있으며, 이는 BRD4가 Cd-유발 염증 반응을 매개한다는 것을 시사합니다. 아세틸화된 NF-κB RelA와의 결합. 최근 연구는 유사한 조절 메커니즘을 보여주었습니다. NF-κB 핵 전위 및 활성화 후 BRD4는 아세틸화된 RelA와 상호작용하여 NF-κB의 전사 활성화를 공동 활성화합니다(Huang et al., 2009). RelA-BRD4는 다양한 염증 자극 조건에서 NF-κB 표적 프로모터로 모집된 반면, JQ1 처리는 BRD4가 아세틸화된 NF-κB RelA에 결합하는 것을 방지하여 NF-κB의 전사 활성을 감소시킴으로써 작용했습니다(Zou et al., 2014). 우리의 결과는 BRD4의 억제가 쥐의 신장에서 BRD4와 RelA-K310ac 사이의 Cd 강화 상호작용을 차단한다는 것을 보여주었으며, 이는 BRD4를 억제하면 NF-κB의 Cd 유도 전사 활성을 억제한다는 위의 결과를 뒷받침하며, 이는 Cd가 아세틸화에 대한 BRD4 결합을 강화한다는 것을 나타냅니다. NF-κB RelA는 염증성 사이토카인의 전사를 증가시킵니다.

요약하면, 우리의 연구는 쥐의 신장에서 Cd에 의해 유발된 염증 반응에서 BRD4의 조절 메커니즘을 밝혔습니다. (1) BRD4는 Cd에 의해 유발된 NF-κB 핵 전위 및 활성화를 매개합니다. (2) Cd는 RelA K310 아세틸화 수준을 증가시키고 NF-κB 의존성 염증성 사이토카인 전사를 촉진하는 아세틸화된 NF-κB RelA에 대한 BRD4 결합을 향상시킵니다. 또한, BRD4의 억제는 Cd-상승된 염증성 사이토카인 수치를 유의하게 완화시켜, 표적화된 BRD4가 Cd-유도성 신염을 비롯한 염증성 질환을 치료하는 효과적인 수단으로 개발될 가능성이 있음을 시사한다.

CRediT 저작자 기여 진술서

Zhongguo Gong: 개념화, 방법론, 시각화, 형식 분석, 검증, 조사, 형식 분석, 데이터 큐레이션, 쓰기 – 원본 초안. 강 리우: 개념화, 방법론, 시각화, 데이터 큐레이션, 쓰기 – 원본 초안, 프로젝트 관리, 자금 조달. Wenjing Liu: 소프트웨어, 리소스, 방법론, 형식 분석. Hui Zou: 프로젝트 관리, 감독. Ruilong Song: 소프트웨어, 공식 분석, 감독. Hongyan Zhao: 소프트웨어, 형식 분석, 감독. Yan Yuan: 감독. Jianhong Gu: 감독. Jianchun Bian: 자금 조달, 감독. Jiaqiao Zhu: 쓰기 – 검토 및 편집, 감독. Zongping Liu: 쓰기 – 검토 및 편집, 감독,

프로젝트 관리, 자금 조달, 개념화.

경쟁 이익 선언

저자는 이 문서에 보고된 작업에 영향을 미칠 수 있는 경쟁적인 재정적 이해관계나 개인적 관계가 없음을 선언합니다.

승인

이 작업은 중국 국가 자연 과학 재단(No. 31872533, 31902329, 32072933), 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램(No. 2016YFD0501208), 강소 고등 교육 우선 학업 프로그램 개발 프로젝트의 지원을 받았습니다. 기관(PADP). 원고는 ELIXIGEN에서 자격을 갖춘 한 명 이상의 영어 원어민 편집자가 적절한 영어, 문법, 구두점, 철자 및 전반적인 스타일에 맞게 편집했습니다.

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