배경.심각한신장 손상(AKI)는 사망률 증가와 함께 비대상성 간경변증의 빈번한 합병증입니다. 혈청 크레아티닌과 같은 전통적인 바이오마커는 기능적 변화 없이 손상을 감지하는 데 민감하지 않습니다. 우리는 비뇨기 엑소좀이 유형을 구별하는 마커를 잠재적으로 가지고 있다고 가정합니다.신장 손상간경변 환자에서.

행동 양식.이것은 성인 간경변증 환자에 대한 전향적 단일 센터 관찰 연구입니다. 환자 그룹에는 건강한 정상 대조군, 정상인 대상성 간경변이 포함되었습니다.신장 기능, 정상인 비대상성 간경변증신장 기능, AKI를 동반한 대상성 간경변증. 데이터는 간 질환의 병인학, MELD 점수, 보상부전 이력, Child-Turcotte-Pugh 점수, AKI 이력 및 약물 노출을 포함한 전자 건강 기록에서 추출되었습니다. 동의 시 소변 샘플을 수집했습니다. 소변 엑소좀 단백질 함량을 분석하고 단백질 데이터를 면역블롯팅으로 검증했습니다. 통계 분석에는 투영 식별의 변수 중요도와 결합된 부분 최소 자승 판별 분석이 포함되었습니다.

결과.18명의 간경변 환자가 등록되었고 6명의 건강한 대조군이 우리의 바이오리포지토리에서 추출되었습니다. 소변 엑소좀이 분리되었고 1572개의 단백질이 확인되었습니다. Maltase-glucoamylase는 Western blotting으로 확인된 최고의 식별 단백질이었습니다.

결론. 간경변과 AKI가 있는 환자는 요로 엑소좀에서 신장 브러시 경계 이당류(MGAM)의 상향 조절이 있어 유형을 구별할 수 있습니다.신장 손상간경변증; 그러나 이것의 임상적 의미는 추가 검증이 필요합니다.

자세한 내용은 다음으로 문의하십시오.joanna.jia@wecistanche.com

급성 신장 손상에 의해 치료를 받다시스탄체

1. 소개

심각한신장 손상(AKI)는 입원한 간경변증 환자의 약 20%에서 발생합니다[1, 2]. 입원한 간경변증 환자의 AKI는 흔히 진행성이며 중증이며 사망률에 대한 독립적인 음성 예측인자입니다[3]. *간경변증에서 AKI의 가장 흔한 원인은 70%를 차지하는 혈역학적입니다. 급성 세뇨관 괴사(ATN)는 증례의 30%를 차지하며, 신후 원인은 1% 미만을 차지하는 드뭅니다. 간신증후군(HRS)은 식별할 수 없는 혈역학적입니다.신장 손상또는 질병이며 간경변증 환자의 약 20%에서 발생합니다[4, 5].

혈청 크레아티닌(Scr)은 평가에 가장 널리 사용되는 바이오마커입니다.신장 기능식별신장 손상. 그러나 SCR은 Hindawi Critical Care Research and Practice Volume 2019의 간경변 환자에서 차선책입니다. 간 생성 감소, 저장 감소로 인한 근육 소모, 분포 부피 증가, 단백질-칼로리 영양실조 등 다양한 이유가 있습니다. 평균 Scr 값은 일반 인구에 비해 간경변 환자에서 낮으므로 현재 AKI의 정의에 따라 AKI의 진단이 지연됩니다[6]. 또한 Scr은 다음의 바이오마커입니다.신장 기능민감한 부상 마커가 아닙니다. AKI의 검출을 개선하고 AKI의 병인을 구별하는 데 도움이 되는 새로운 신장 손상 바이오마커가 등장했습니다.신장 손상포함하는 바이오마커신장 손상분자{0}}(KIM{1}}), 호중구 젤라티나제 관련 리포칼린(NGAL), 인터루킨-18, 간 지방산 결합 단백질(L-FABP), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 -7(IGFBP-7) ​​및 금속단백분해효소의 조직 억제제-2(TIMP{10}})는신장 손상기능 변경 없이 [7]. 연구에 따르면 이러한 바이오마커는 AKI의 병인을 구별할 수 있습니다[8, 9]. AKI를 감지하고 구별하기 위한 개선된 바이오마커는 간경변증 환자의 중요한 미충족 임상 요구 사항을 나타냅니다.

엑소좀은 세포간 통신의 메커니즘으로 살아있는 세포에서 방출되는 나노소포입니다[10]. * 엑소좀의 단백질 함량은 병리학적 또는 스트레스 조건에서 현저하게 변형되는 것으로 나타났습니다[11-13]. 에서신장,엑소좀은 모든 세포 유형에서 소변으로 전달되며[14, 15], 비뇨기 엑소좀은 잠재적으로 대상의 생화학적 특징으로 간주될 수 있습니다. 소변 엑소좀은 일상적으로 분석되지 않기 때문에 간경변 환자에서 AKI의 단백질 바이오마커에 대한 인식되지 않은 추가 정보를 제공할 수 있습니다.

이 연구의 목적은 건강한 피험자와 비교하여 간경변 및 AKI 환자의 요로 엑소좀 단백질체학을 평가하는 것이었습니다. 우리는 정상 건강한 대조군과 비교하여 AKI를 경험하는 대상성 또는 비대상성 간경변증 환자에서 요 엑소좀 단백질 함량이 다르다는 가설을 세웠다. 또한, 우리는 차등 요로 엑소좀 단백질 함량이 다음의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 것이라고 가정했습니다.신장 손상간경변에.

2. 재료 및 방법

이것은 성인 간경변증 환자에 대한 전향적 단일 센터 관찰 연구입니다. 연구의 모든 환자는 2013년 7월 1일과 2014년 6월 1일 사이에 UC San Diego Health 시스템에서 모집되었으며 사전 동의를 받았습니다. 환자는 간경변 진단을 받았고 소변 샘플을 제공할 수 있는 경우 포함할 수 있었습니다. 간경변은 간 생검, 단면 영상화에 의해 또는 임상적으로(간학자에 의해 결정된 비대상성 사건의 식별을 통해) 결정되었습니다. 데이터는 인구 통계, 인체 측정, 활력 징후, 동반이환 의학적 문제, 간경변의 병인, 간경변의 합병증(복수, 정맥류, 간성 뇌병증 및 간세포 암종), AKI 또는만성 신장 질환, 등록 후 30일 이내의 약물 노출. 등록 후 30일 이내에 완전한 임상 데이터 및 실험실 검사를 받은 환자만이 이 연구에 포함될 자격이 있었습니다. 환자는 다음과 같이 그룹으로 분류되었습니다.

(1) 그룹 0: 정상적인 정상 대조군

(2) 그룹 1: AKI의 병력이 없고 정상인 대상성 간경변증(Child-Turcotte-Pugh class A, MELD 10)신장 기능

(3) 그룹 2: AKI의 병력이 없고 정상인 비대상성 간경변(Child-Turcotte-Pugh class B 또는 C)신장 기능

(4) 그룹 3: 비대상성 간경변(Child-Turcotte-Pugh class B 또는 C) 및 AKI

정상신장 기능추정된 GFR > 6{4}} ml/min/1.73 m2(MDRD 공식), 단백뇨 및 AKI 병력 없음으로 정의되었습니다. AKI는 AKIN 기준에 따라 정의되었습니다. Scr이 48시간 내에 0.3mg/dl 또는 기준선에서 Scr이 50% 증가했습니다[16]. AKI 환자는 AKI 에피소드 동안 혈액 및 소변 표본을 얻은 경우 입원 및 상담 중에 입원 환자 간 서비스에서 모집되었습니다. 건강한 대조군의 네 번째 그룹은 UC 샌디에이고 의과대학의 AKI 연구를 위한 UCSD 오브라이언 센터의 건강한 정상 생물 저장소에서 추출되었습니다. *이 작업은 샌디에이고 캘리포니아 대학교의 기관 검토 위원회의 승인을 받았습니다.

2.1. 엑소좀 분리를 위한 소변 샘플링 및 처리

소변을 3{10}} ×g에서 30분 동안 원심분리했습니다. 상층액의 pH를 7로 조정하고 분취한 후 -80℃에서 동결하였다. 폴리에틸렌 글리콜-(PEG-) 유도 침전을 사용하여 엑소좀을 제조하였다[17]. *e PEG 혼합 소변 샘플을 실온에서 2시간 동안 보관하고 10,000 xg에서 30분 동안 회전했습니다. *e 펠릿은 1mM EDTA-Na 염이 포함된 10mM Tris에 재현탁되었습니다. *이 단계를 2회 반복하여 불순물을 제거하였다. 엑소좀 단백질의 1차원 SDS PAGE는 교란을 방지하기 위해 겔 내 트립신 처리 전에 수행되었습니다[18].

2.2. 단백질 분석.

겔을 1mm × 1mm로 자르고 100 100mM 중탄산 암모늄 1μL를 사용하여 15분 동안 3회 탈색시킨 다음 100μL의 아세토니트릴(ACN)을 15분 동안 사용하여 탈색시켰다[19 ]. *e 상층액을 동결건조하고 생성된 펠렛을 200μL의 100mM 중탄산암모늄{11}}mM DTT로 환원시키고 56도에서 30분 동안 인큐베이션했습니다. 액체를 제거한 후 겔 조각을 100mM 중탄산암모늄{16}}mM 요오도아세트아미드 200μL에 첨가했습니다. * 암실에서 실온에서 20분간 배양하였다. *e 상층액을 제거하고 100mM 중탄산암모늄으로 15분 동안 세척했습니다. *en, 100 μL의 ACN을 첨가하여 겔 조각을 탈수시키고 용액을 동결건조시켰다. 그런 다음 50mM 중탄산 암모늄 용액의 얼음처럼 차가운 트립신(0.01μg/μL)을 첨가하여 소화 과정을 위한 겔 조각을 덮고 30분 동안 얼음 위에 둡니다. 재수화가 완료되면 새로운 50mM 중탄산암모늄을 추가하여 과량을 대체했습니다. 트립신을 넣고 37도에서 밤새 방치했습니다. 50㎕의 0.2% 포름산 및 5% ACN을 첨가하여 펩티드 추출을 2회 수행하고 실온에서 30분 동안 볼텍싱하였다. 상층액을 제거한 후 50 ㎕의 50% ACN{35}}.2% 포름산을 샘플에 첨가하고 실온에서 30분 동안 다시 와류시켰다. *is 상층액을 제거하고 첫 번째 추출의 이전 상층액과 합쳤습니다. 샘플은 QExactive 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific, San Jose', CA, USA) 전자분무 이온화 [17].

2.3. 데이터 관리.

SEQUEST 검색 엔진(Thermo Scientific Proteome Discoverer 소프트웨어, 버전 1.4)이 분석에 사용되었습니다. * NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 호모 사피엔스에 대한 트립신 펩티드 서열에 대한 단백질 데이터베이스를 실험 MS/MS 스펙트럼을 비교하는 데 사용했습니다. 펩타이드 서열과 관련 단백질을 확인하기 위해 우리는 이전에 발표된 기준을 사용했습니다[17]. 통계적 유의성을 평가하기 위해 별도의 표적 및 미끼 검색과 고전적인 점수 기반 거짓 발견률(FDR) 계산이 사용되었습니다. 마지막으로 SEQUESToutput 데이터를 필터링하여 단백질에 최종 점수를 할당했습니다. 1.5, 2.{7}}, 2.25 및 2.5의 최소 상관 점수(Xcorr) 값은 각각 단일, 이중, 삼중 및 사중극자 하전 이온에 대해 선택되었습니다. 이전에 발표된 매개변수는 높은 엄격성을 보장하기 위해 활용되었으며[20], 위양성 펩타이드 비율은 3% 미만이었습니다.

2.4. 통계 분석.

표준화된 스펙트럼 풍부 인자(NSAF)는 폴리펩타이드의 상대적 존재비를 계산하는 데 사용되었습니다[21]. 펩타이드 카운트의 로그 변환 및 스케일링은 통계 분석 전에 수행되었습니다. MetaboAnalyst 2.{2}} 웹 포털을 사용하여 스튜던트 t-검정, 부분 최소 자승 판별 분석(PLS-DA) 및 투영의 가변 중요도(VIP)를 사전 p < 0로="" 수행했습니다.="" 05="" [22].="" *총="" 농도에="" 대한="" 개별="" 단백질의="" 비율은="" 각="" 그룹에="" 대해="" 쌍을="" 이루는="" 스튜던트="" t-검정을="" 사용하여="" 평가되었습니다.="" pls-da와="" vip는="" 구별="" 단백질을="" 식별하는="" 데="" 사용되었습니다[23].="" 우리는="" western="" blotting을="" 사용하여="" 검증하기="" 위해="" fdr(false="" discover="" rate)이="" 10%="" 이하인="" 단백질을="">

2.5. 웨스턴 면역블롯팅 및 정량화.

MGAM에 대한 항체는 Proteintech Group, Inc.(미국 일리노이주 시카고)에서 구입했으며 각 피험자의 소변 엑소좀에서 100ug의 단백질을 분리하는 데 사용되었습니다. 분리 후, 단백질을 니트로셀룰로오스 종이로 옮기고, 차단하고, Tris-buffered saline으로 세척하기 전에 1차 항체와 밤새 배양하고, HRP-2차 항체 접합체와 1시간 동안 배양하고, 우리 연구실의 이전 간행물에 설명된 대로 현상하여 시각화했습니다. 24, 25]. ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 웨스턴 면역블롯 밴드를 정량화하고 [24] 플롯팅했습니다(GraphPad Prism, San Diego, CA, USA).

3. 결과

3.1. 간경변과 건강한 대조군의 임상적 특징.

완전한 임상 데이터가 있는 각 그룹의 6명의 환자를 분석하고 6명의 건강한 대조군과 비교했습니다. 간 질환의 인구 통계 및 병인은 표 1에 요약되어 있습니다. 연구 설계에 따라 예상한 대로 Child Turcotte-Pugh 및 MELD 점수는 환자 그룹 간에 크게 다릅니다.

3.2. 간경변 환자와 건강한 대조군의 소변 엑소좀 단백질체 분석.

총 4개 그룹 모두에서 1572개의 고유한 단백질이 확인되었습니다. 모든 그룹에 공통된 360 단백질이 있었습니다. 우리는 그룹 0(대조군)에 대해 83개의 고유한 엑소좀 단백질, 그룹 1에 대해 250개, 그룹 2에 대해 84개, 그룹 3에 대해 212개의 고유한 엑소좀 단백질을 발견했습니다(그림 1). 우리는 추가로 단백질에 대해 다변량 PLS-DA를 수행했는데, 이는 그림 2와 같이 건강한 대조군과 간경변 환자의 다른 하위 그룹 사이에 명확한 분리를 보여주었습니다.신장 손상(그룹 1 및 2) AKI가 있는 간경변 피험자(그룹 3)는 다른 간경변 피험자 및 건강한 대조군 피험자로부터 명확한 분리를 보인 반면 상당한 중첩을 보였습니다. 4개 그룹 간의 별도의 단백질 ANOVA는 126개 단백질이 유의하게 변경되었음을 보여주었고(p < 0.05),="" 그="" 중=""><10% (table="" 2).="" maltase-glucoamylase="" (mgam)="" was="" the="" top="" discriminant="" protein="" with="" a="" vip="" score="" of="" 4.35="" for="" the="" entire="" study="">

3.3. Maltase-Glucoamylase 단백질은 비대상성 간경변성 소변 엑소좀에서 증가합니다.

proteomic 데이터는 비대상성 간경변증 환자의 소변 엑소좀에서 MGAM 농도가 더 높은 것으로 나타났습니다.신장 손상(그룹 2 및 3). 이것은 VIP 점수가 4.35인 4개 그룹 모두에서 가장 식별 가능한 단일 단백질이었습니다(그림 3). 이 엑소좀의 확증적 웨스턴 블롯팅은 간경변증 환자에서만 검출 가능한 단백질을 보여주었다신장 손상(그룹 3) (그림 4).

4. 토론

우리는 AKI를 사용하여 대상성 간경변, 비대상성 간경변 및 비대상성 간경변이 있는 환자의 요 엑소좀 함량에 대한 단백질체 분석을 수행하고 건강한 대조군과 비교했습니다. 간경변 환자의 요로 엑소좀 단백질체 분석은 다음의 몇 가지 잠재적으로 중요한 바이오마커를 확인했습니다.신장 손상, 가장 주목할만한 것은 이기능성 효소인 MGAM입니다. 간경변 및 AKI 환자의 요도 엑소좀에서 가장 높은 농도의 MGAM을 발견했습니다. 또한 MGAM은 간경변증 환자에서 증가했지만 AKI 환자에서만큼 증가하지는 않았습니다. MGAM은 건강한 대조군에는 없었으며, 이는 중대한 질병의 바이오마커로서의 잠재적 역할을 강조했습니다.

이 연구에는 몇 가지 다른 중요한 발견이 있습니다. 첫째, 우리가 아는 한, 이것은 잘 특성화된 간경변 환자에서 요 엑소좀 단백질 함량의 기술적 분석에 대한 첫 번째 보고서입니다. 둘째, 이것은 세뇨관 상피 이당효소의 증가를 보고한 최초의 연구입니다.간경변-신장 손상어형 변화표. 4개의 다른 그룹의 소변 엑소좀 단백질체 데이터는 간경변증 AKI 그룹에서 MGAM 상향 조절이 강력하고 일관됨을 보여주었습니다. Maltase는 신장 브러시 경계 막의 주요 이당류이지만[26, 27], 이 효소의 정확한 기능은 명확하게 밝혀지지 않았습니다. 그러나 당 수송에서 관련된 이당류, 수크라제-이소말타제 및 트레할라제의 가능한 역할이 가정되었습니다[28]. 10개의 포유류 종에서 MGAM과 관련된 이당류가 신장 브러시 경계에서 발견되었습니다[27]. Farquhar와 동료들은 말타아제가 근위 세뇨관의 미세융모에 존재하며, 아마도 포도당 재흡수 및 수송 기능을 한다는 것을 입증했습니다. 그리고 이 흡수 능력은 네프론의 원위 부분으로 갈수록 감소합니다[29]. MGAM은 간경변의 일반적인 원인인 비알코올성 지방간염(NASH)의 마우스 모델에서 엑소좀과 마이크로입자에 존재하는 것으로 나타났습니다. 간경변 환자는 Scr 감소에 기여하는 몇 가지 기본 조건을 가지고 있기 때문에 AKI의 검출은 문제가 있습니다. 또한 손상의 원인은 종종 알려져 있지 않으며 간신 증후군과 AKI의 다른 원인을 구별하는 것이 어렵습니다. 또한 AKI를 동반한 비대상성 간경변증의 병태생리는 혈역학적 변화나 만성 간부전의 급성인 경우 염증 매개체를 반영할 수 있기 때문에 불명확하다[31]. 우리는 간경변과 문맥압항진증이 초래하는 구조적, 기능적 변화를 추론했습니다.신장 기능간경화의 정도에 따라 심각도가 다릅니다. 이러한 보상성 간질환과 비대상성 간질환의 차이점은 다음과 같습니다.신장 손상의 다운스트림 제품을 연구하여 이해할 수 있습니다.신장, 소변과 같은. 소변 엑소좀의 네프론 세포 상태 특이적 화물을 감안할 때, 우리는 소변 엑소좀 분석이 간경변증에서 AKI의 분화와 관련된 핵심 정보를 보유하고 있다고 가정했습니다. 이 보고서는 이 가설을 테스트하기 위한 첫 번째 단계입니다.

이 연구 설계에는 몇 가지 제한 사항이 있었습니다. 첫째, 그룹당 분석 대상의 수가 적습니다. 더 큰 샘플 크기는 이러한 데이터의 견고성을 더욱 높일 수 있으며 추가 단백질은 허용 가능한 FDR의 임계값에 도달했을 수 있습니다.<10%. however,="" despite="" this="" small="" sample,="" these="" data="" demonstrating="" mgam="" as="" a="" unique="" exosomal="" protein="" in="" cirrhotic="" patients="" with="" aki="" is="" robust.="" second,="" we="" used="" 1d="" gel="" electrophoresis="" to="" resolve="" the="" exosome="" proteins="" prior="" to="" lc/ms-ms="" analysis="" that="" resulted="" in="" the="" identification="" of="" 1572="" proteins="" overall.="" if="" we="" had="" conducted="" direct="" exosome="" protein="" trypsinization="" instead="" of="" following="" this="" method,="" perhaps="" the="" number="" of="" identified="" proteins="" might="" have="" increased.="" in="" our="" experience,="" exosomes="" are="" packaged="" with="" nonfull="" length="" peptides="" from="" proteolytic="" action="" as="" well="" as="" endogenous="" peptides="" and="" may="" have="" con-founded="" the="" analysis.="" by="" following="" the="" gel="" electrophoresis="" method,="" we="" ensured="" that="" we="" only="" compared="" full-length="" protein="" differences="" between="">

요약하면, 우리는 단백질체 방법에 의해 AKI가 있거나 없는 건강한 대조군과 보상 및 비보상 간경변 환자에서 소변 엑소좀 단백질 차이를 특성화했습니다. Knepper 그룹의 연구에 따르면 많은 중요한 신장 단백질(예: 아쿠아포린, 폴리시스틴 및 포도신)이 소변 엑소좀에서 배출됩니다[32, 33]. 우리의 현재 보고서는 소변 엑소좀에서 확인된 기능적으로 중요한 신장 단백질 그룹에 MGAM을 추가합니다. 우리의 연구 결과는 MGAM이 간경변 환자에서 다른 유형의 AKI와 근위 세뇨관 손상을 구별할 수 있음을 시사합니다. 그러나 AKI가 있는 간경변 환자에서 MGAM 상향 조절의 임상적 중요성은 향후 연구에서 확립될 필요가 있습니다.

데이터 가용성

이 연구의 결과를 뒷받침하는 데 사용된 임상 및 단백질체 데이터는 환자의 개인 정보를 보호하기 위해 UCSD 기관 검토 위원회에서 제한합니다.*e 데이터는 Dr. Linda Awdishu(lawdishu@ucsd.edu)가 다음을 충족하는 연구원에게 제공됩니다. 기밀 데이터에 대한 액세스 기준.

이해 상충

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

NIH NIDDK UAB/UCSD 오브라이언 센터 보조금 DK0793337을 통해 지원되는 연구.

작가

린다 아디슈,^1,2 셜리 쓰노다,¹ 미셸 진주만,³ 샹텔 코코이 몬드라곤,²마지드 가세미안,⁴로버트 K. 나비오,⁵헤더 엠 패튼,³라빈드라 L. 메타,²바바야 비제이,⁶그리고 사티시 P.라마찬드라 라오 ^2,6,7

1UC San Diego Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, San Diego, USA

2오브라이언 센터 바이오마커 연구실급성 신장 손상연구, 신장-고혈압, UC 샌디에이고, 의과대학, 샌디에이고, 미국

3UC 샌디에이고, 미국 샌디에고 소화기내과 의과

4UC San Diego, 화학 및 생화학부, 생분자 및 단백질체학 분광기 시설, 샌디에이고, 미국

5UC 샌디에이고, 미국 샌디에고 의과대학 소아병리학과

6I-AIM 바이오마커 연구소, Re University of Trans-Disciplinary Health Sciences and Technology(TDU), Bangalore, India

7UC 샌디에이고, 미국 샌디에고 감염병과 의학부

서신은 Satish P. Ramachandra Rao에게 보내야 합니다. 2018년 10월 30일 접수; 2018년 12월 31일에 개정됨; 2019년 2월 19일 수락됨; 2019년 4월 16일 발행 학술 편집자: Antonio Artigas

저작권 © 2019 Linda Awdishu 외. 이것은 아래 배포된 오픈 액세스 기사입니다.,원본 저작물이 적절하게 인용된 경우 모든 매체에서 무제한 사용, 배포 및 복제를 허용합니다.

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