연령 관련 신경퇴행성 질환의 전임상 연구 진행 경로: 설치류 및 HiPSC 유래 모델에 대한 관점 3부
Jul 09, 2024
유사한 바이러스 벡터 접근법이 PD의 다양한 모델에서 평가되었으며, 가장 초기에는 AAV2/2 또는 LV를 사용했습니다.123-126성체 쥐 뇌에 주입된 이러한 벡터는 질병에 대한 인간 a-syn의 WT, A30P 또는 A53T 돌연변이를 전달하는 데 사용되었습니다. 유도.
바이러스는 종종 신체적 불편함과 질병을 유발하기 때문에 바이러스와 기억의 관계는 많은 사람들에게 부정적으로 보일 수 있습니다. 그러나 바이러스는 기억력 향상에도 긍정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 주로 바이러스 공격이 면역 체계의 활동을 촉진할 수 있기 때문입니다.
연구에 따르면 바이러스 공격은 신체의 면역체계가 반응하도록 하여 바이러스에 대한 신체의 저항력을 향상시킬 수 있는 것으로 나타났습니다. 이러한 면역 체계 반응에는 생산되는 백혈구 및 기타 면역 세포의 수 증가와 항체 생산이 포함됩니다. 이러한 반응은 신체가 바이러스 침입에 저항하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 면역 체계의 기능을 강화하고 신체의 전반적인 건강을 개선하는 데도 도움이 됩니다.
바이러스 공격은 또한 뇌의 면역 세포를 활성화시킵니다. 이러한 면역세포는 뇌에서 노폐물과 부패한 세포를 제거하고, 신경계의 기능을 향상시키며, 정보 전달과 기억 처리를 촉진할 수 있습니다. 연구에 따르면 특정 바이러스에 감염된 사람들은 기억 작업을 처리할 때 더 나은 수행을 할 수 있는 것으로 나타났습니다.
또한 일부 연구에서는 특정 바이러스가 신체를 자극하여 뉴런의 성장과 발달을 촉진하는 물질인 뇌유래 신경영양인자(BDNF)를 생성할 수 있다는 사실을 발견했습니다. 이 물질은 뇌 기능에 긍정적인 영향을 미치며 신체적 회복과 기억력 향상을 촉진할 수 있습니다.
물론 바이러스와의 전쟁에서 우리는 올바른 접근 방식과 전략을 채택하고, 좋은 위생 습관을 유지하며, 충분한 수면과 운동을 통해 면역 체계가 최상의 상태를 유지해야 합니다. 간단히 말해서, 바이러스는 우리에게 신체적 불편함을 유발할 수 있지만 면역 체계의 활동을 촉진하고 우리의 건강과 기억에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다는 증거가 늘어나고 있습니다. 우리가 기억력을 향상시켜야 함을 알 수 있는데, 시스탄체는 기억력과 학습에 매우 중요한 아세틸콜린과 성장인자의 수치를 높이는 등 신경전달물질의 균형도 조절할 수 있기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 또한 Cistanche는 혈류를 개선하고 산소 전달을 촉진하여 뇌가 충분한 영양과 에너지를 얻을 수 있도록 하여 뇌 활력과 지구력을 향상시킬 수 있습니다.
저자들은 시간이 지남에 따라 점진적으로 진화하는 분자 및 세포 병리와 nigralDA 변성을 동반한 흑색질 DA 뉴런에서 a-syn의 효율적인 발현을 입증했습니다.
그럼에도 불구하고, 이 연구에 사용된 1세대 rAAV2/2 벡터는 진행성 신경 손실을 나타냈지만, 티로신-수산화효소 양성 뉴런의 신경변성과 시간 경과는 상당히 가변적이었습니다(25%~80% 및 6주~1년). , 각각).123,124
대조적으로, WT-, A30P- 또는 A53T-돌연변이 a-syn을 코딩하는 LV는 보다 지연되고 보다 일관된 방식으로(각각 25%-40% 및 5개월) 쥐의 신경 세포 손실을 유도할 수 있었습니다.126 두 연구 모두에서 입증되었습니다. 나머지 DA 뉴런의 신경 돌기 길이의 점진적인 손실과 부풀어 오른 주변 세포.
또한 a-syn의 대규모 세포질 축적이 세포체와 신경돌기 모두에서 발견되었습니다. 이러한 결과는 최근 두 바이러스 플랫폼을 모두 활용한 여러 연구에서 재현되었습니다.127-131
LV는 다양한 마우스 PD 모델에도 활용되었습니다. 예를 들어, Lauwers와 동료들은 마우스의 선조체, 편도체 또는 SN에 a-syn의 WT 또는 A30P 돌연변이를 운반하는 LV를 주입하면 PD와 관련된 신경퇴행성 변화를 시간 의존적 방식으로 유도할 수 있으며 α-독립적 신경염 확대를 포함한다는 것을 보여주었습니다. 및 세포질 함유물.
또한, 이 연구에서는 A30P-a-syn의 흑색질 과발현으로 인해 10~12개월에 약 25%의 세포 손실이 발생한다는 사실이 입증되었습니다.125 LV를 사용하여 쥐의 SN에 A30P, E57K 및 E35K를 전달한 결과 DA 뉴런에서도 비슷한 정도가 나타났습니다. WT(30%)에 비해 손실(약 50%)이 감소한 반면, 동일한 연구에 사용된 더 빠른 원섬유 형성 돌연변이 A53T는 DA 세포 수의 유의한 감소를 나타내지 않았습니다.
흥미롭게도, 마우스에서 관찰된 전반적인 신경병리학적 특징(즉, 발병 및 중증도)은 쥐에 비해 덜 심각한 것으로 나타났습니다. 그러나 이러한 차이는 주입된 바이러스의 바이러스 순도 또는 생산 역가 및/또는 기타 관련 기술 불일치의 인공물일 수 있습니다.
AD 및 PD 바이러스 벡터 모델에 대한 중요한 고려 사항
AAV2/1, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/8, AAVrh10, DJ 및 DJ8을 포함한 새로운 혈청형의 개발로 세포 표적이 확대되고 AAV 형질도입 효율이 향상되었습니다.
이러한 새로운 캡시드로 혈청형이 결정된 AAV는 쥐와 인간이 아닌 영장류에서 a-syn을 과발현하는 것으로 테스트되었습니다.132-137 AAV2/5 및 AAV2/6을 통해 전달된 S129Aform의 과발현은 신경변성 과정에서 지속적으로 향상된 독성을 나타냅니다.134,138
또한 이러한 실험에서는 과발현 도입유전자를 주의 깊게 투여하는 것이 중요하다는 점을 입증했습니다. 높은 역가로 전달된 형광 리포터만 포함하는 대조 벡터도 비특이적 독성 효과를 나타낼 수 있기 때문입니다.135
AAV를 기반으로 구조 실험을 설계할 때 이 주의 사항을 신중하게 고려해야 합니다. 예를 들어, SNCA를 표적으로 하는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 포함하는 치료용 AAV는 높은 수준의 독성을 초래하고 흑질선조체 DA 뉴런의 상당한 손실을 초래하는 것으로 나타났습니다. 이 연구는 동물 연구에서 AAV 적용의 한계를 더욱 강조했습니다.
그러나 쥐 모델에서 SNCA 수준의 강력한 감소로 인해 신경 독성이 발생했다는 점을 배제할 수 없으며, asa-syn은 DA 뉴런에서 중요한 생화학적 역할을 하며, 그 강력한 감소는 세포 생존력을 감소시킬 수 있습니다.139 종합적으로 볼 때, 이는 다음의 중요성을 강조합니다. 유전자 치료 접근법을 설계하기 위해 질병 관련 유전자의 발현을 미세 조정하는 도구를 개발합니다.
이와 관련하여, 최신 CRISPR-dCas9- 기반 시스템은 정확하고 미세 조정된 방식으로 유전자 발현을 조절하는 데 더 유리한 시스템을 제시할 수 있습니다.
이 라인을 따라 우리는 최근 SNCA 유전자 발현의 정확하고 미세 조정된 조절을 달성하기 위해 LV-CRISPR-Cas9 시스템을 개발했습니다. 이 연구는 후성유전체 편집을 통한 유전자 발현 조작(예: 과발현 반전)이 유전자 조절 장애로 인해 발생하는 PD140와 같은 신경 장애에 대한 귀중한 치료 전략이라는 개념 증명을 제공했습니다.
이와 같이, a-syn 단백질의 과발현을 위해 LV 및 AAV를 사용하는 바이러스 벡터 PD 모델은 DA 신경변성과 관련된 PD 병리를 나타내며, 새로운 AAV 혈청형의 사용은 AAV2/2에 비해 DA 뉴런에서 a-syn 발현을 향상시킵니다.
전반적으로, AAV와 LV는 모두 이식유전자 발현을 유도할 수 있고 DA 뉴런에 대해 높은 수준의 향성을 보여 유사한 수준의 신경변성을 초래합니다. 세포 PD 표현형의 느린 진행과 상대적으로 낮은 수준의 행동 장애를 피하려면 이러한 바이러스 시스템의 추가 개선이 필요할 것입니다.
체외 세포 배양 모델현재 체외 AD 및 PD 모델 개요: 한계 및 기회
지난 40년 동안 다양한 AD 및 PD 시험관 모델이 개발되어 상대적인 질병 병태생리학의 주요 측면 간의 상호작용을 조사하고 이후 전임상 치료 스크리닝에 활용되었습니다.
현재의 AD 및 PD 시험관 모델은 주로 미토콘드리아 기능 장애, 산화 스트레스, 세포 생존 및 세포내 및/또는 세포외 단백질 응집체의 존재와 같은 분자 및 세포 질병 특징을 요약하는 것을 목표로 합니다. 예를 들어, AD의 가장 두드러지고 널리 사용되는 세포 모델은 Ab4042응집체 또는 타우 과인산화 및 응집의 유도를 기반으로 합니다141,142(표 1).
마찬가지로, PD의 시험관 내 모델은 앞서 언급한 독소 유발 미토콘드리아 기능 장애(예: MPTP, 로테논, 파라콰트, 6-OHDA) 및 단백질 분해 장애(예: 탑시가르긴, 이오노마이신, 튜니카마이신), a-syn 과발현 및 발현을 기반으로 합니다. 돌연변이된 PD 가족 유전자(예: a-syn, Parkin, PINK1)92(표 2).
이러한 세포 배양 모델은 관련 신경생물학에 대한 이해를 진전시키는 데 매우 귀중한 반면, 아직 예방, 발병 지연 또는 질병 진행 지연을 목표로 하는 실행 가능한 DMT를 생성하지 못하여 관련성과 번역 타당성에 의문을 제기합니다.
이러한 모델의 몇 가지 명확한 한계는 현재의 전임상 관행을 개선하는 데 중요합니다.
예를 들어, 관련 질병 관련 유전자의 과발현 및 녹아웃/다운을 기반으로 한 모델은 단백질 수준의 정량적 변화와 유전자 발현의 변화를 유도하는 데 사용되는 방법(예: 바이러스 매개, 육종 기반, 구성적 또는 일시적 발현)에서 가변성이 있는 것으로 악명이 높습니다. 이는 모순되는 데이터와 추론으로 이어질 수 있습니다.92
질병 관련 표현형을 이끌어내는 데 일관성이 부족하기 때문에 잠재적인 DMT를 테스트하기 위해 이러한 모델을 사용하는 전임상 연구에 주의가 필요합니다. 더욱이, 전임상 NDD 모델에서 관찰된 세포 표현형 및 방법론의 가변성(예: 단백질 과발현 또는 녹다운의 배수 변화)은 현재 세포 모델에서 완전히 탐구될 수 없는 더 큰 유전적 이질성을 강력히 시사합니다.
이는 전체 NDD 사례 중 소수를 나타내는 가족 변이에도 불구하고 가족 코호트에서 확인된 유전적 변이를 기반으로 한 세포 모델의 유병률로 인해 더욱 복잡해집니다.109,143
밝혀지지 않은 유전적 원인으로 인해 전임상 모델에서 비멘델 유전학을 사용하여 산발적인 NDD 코호트 또는 질병 하위 유형을 정확하게 표현하는 것은 여전히 어렵고, 관련 질병 메커니즘을 밝히고 잠재적인 치료 목표를 식별하고 약물 개발에 중요한 장벽을 만듭니다.
이러한 과제를 감안하여 연구자들은 개선 영역을 식별하고 새로운 세포 배양 기술이 제공하는 기회를 평가하기 위해 이러한 모델을 평가해야 했습니다.
최근 몇 년 동안 우리는 이러한 모델을 기반으로 새로운 유전자 편집 기술을 통합하고 개선된 조직 배양 모델의 GWAS에서 얻은 중요한 유전 질환 연관성을 평가했습니다.144,145
hiPSC 기술의 통합 증가는 NDD in vitro 모델링 분야의 주요 진전을 나타내며 이전에는 불가능했던 기회를 제공하여 환자로부터 유래된 질병 관련 세포 유형을 활용하여 인간 게놈의 맥락에서 질병 병인을 탐색할 수 있게 되었습니다.
hiPSC에서 파생된 NDD 모델, 특히 AD 및 PD에 대한 모델의 장점과 한계의 전체 스펙트럼은 다음 섹션에서 자세히 살펴봅니다.
NDD의 hiPSC 유래 모델: 다재다능하고 유전적으로 "충실한"
세포 배양 기술의 현대적 발전은 NDD 연구에서 가장 흥미로운 혁신 중 하나이며 향상된 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 맞춤형 의학을 위한 기회를 제공합니다.
최근까지 사후 뇌 검사는 인간의 신경 퇴행성 질환의 병리학적 과정에 대한 통찰력을 얻기 위한 최적의 인간 기반 생물학적 재료로 간주되었습니다.
그러나 환자별 뉴런 및 교세포 분석을 포함한 현대 줄기 세포 기술은 NDD의 병리학적 메커니즘을 조사하기 위한 새로운 길을 열었으며 AD 및 NDD와 같은 유전적 복잡성이 강화된 NDD의 분자 해부에서 점점 더 활용되고 있습니다. PD.
hiPSC의 생성을 통해 환자 피부 샘플에 대한 간단하고 비침습적인 생검을 통해 hiPSC를 생성하면 이전 세포 배양 방법으로는 불가능했던 방식으로 NDD의 기본이 되는 분자 경로와 질병 메커니즘을 밝힐 수 있습니다.
현재 가장 널리 퍼진 기증자 세포는 섬유아세포로, 이는 공개된 모든 재프로그래밍 실험의 80% 이상에서 활용됩니다.146 그러나 hiPSC는 배아 줄기 세포, 제대혈, 각막 상피 세포, 말초 혈액 단핵 세포와 같은 혈액 세포147-149(그림 1).
결과적으로, hiPSC 유래 모델은 기존 세포 질병 모델에 대한 다용도 대안을 나타내며 플라스미드, 벡터(예: 에피솜) 및 바이러스 형질도입(예: 에피솜)과 같은 다양한 재프로그래밍 도구를 사용하여 다능성으로 강제되는 환자 체세포 조직에서 얻습니다. , 아데노바이러스, 센다이 바이러스, 렌티바이러스 등의 방법은 Brouweret al.150 및 Malik 및 Rao151에서 종합적으로 검토되었습니다.
이러한 세포는 자가 재생되며 윤리적 고려와 사회적 우려가 수반되는 배아줄기세포(ESC)에 대한 대안을 제공합니다. 현재 NDD 환자 및 건강 연령 일치 대조군에서 유래된 hiPSC 계통을 수집 및 배포하여 샘플을 중앙 집중화하고 연구자가 쉽게 사용할 수 있도록 하는 여러 hiPSC 저장소가 있습니다(표 S2).
hiPSC의 주요 응용 분야 중 하나는 특정 세포 유형으로의 분화이며, 이는 결과적으로 신경 발달152 및 신경 퇴행 연구,144 체외 이식,153,154 질병 모델링, 표적 검증 및 약물 발견을 비롯한 다양한 생물학적 맥락에서 활용되었습니다.155
현재까지 일반 뉴런뿐만 아니라 흥분성, 콜린성, DA 및 억제성GABA성 뉴런을 포함한 특정 뉴런 세포 유형 집단을 생성하는 여러 세포 분화 프로토콜이 개발되었습니다. 다양한 특정 신경교 하위 집단 세포도 hiPSC에서 파생되었습니다. 성상교세포,159-161희소돌기아교세포,162,163 및 소교세포164-166를 포함합니다.
CRISPR-Cas9, ZFN(징크핑거 뉴클레아제) 및 TALENS(전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제)를 포함한 여러 가지 새로운 유전자 편집 기술은 hiPSC 유래 시스템에 추가 차원을 도입했습니다. 즉, 동일한 유전적 배경을 가진 동질유전자 모델을 생성하는 것입니다. 선택한 돌연변이에서만 다릅니다.167
세포 분화 프로토콜의 다양성은 기계론적 연구를 촉진했으며, 동종 계통의 가용성은 NDD에서 유전자 기능과 병원성 역할에 대한 유전적 분석을 뒷받침해 왔습니다. hiPSC 유래 모델은 주요 질병 관련 특징을 나타내기 때문에 이러한 조사에 적합합니다.
예를 들어, PS1 및 PS2 돌연변이(각각 A246E 및 N14II)168 및 APP 복제 돌연변이169를 보유하는 fAD 및 sAD 유래 hiPSC 신경 모델은 Ab 분비, 증가된 Ab42:Ab40 비율 및 과인산화된 타우 증가를 포함한 중요한 AD 생화학적 특징을 표시합니다.
Ab 관련 표현형을 생성하는 hiPSC 모델의 사용은 전통적인 이소성 발현 모델 또는 Ab 응집체의 보충 및/또는 유도가 필요한 모델과 비교할 때 AD 신경퇴행에서 Ab 발현의 역할을 탐색하는 보다 정확한 수단을 나타낸다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이는 Ab 침착물과 관련된 "자연적" 발생 병리학적 과정을 채택합니다.
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