제3형 선천 림프 세포 집단을 조절하는 수지상 세포 기반 백신의 잠재력

추상적인:

수지상 세포(DC) 백신은 DC와 면역체계의 다른 측면 간의 통신에 의존하는 일종의 면역요법입니다. DC는 선천성 면역 반응의 활성화와 적응 면역의 교육에 관여하는 강력한 항원 제시 세포이므로 면역 요법의 이상적인 표적이 됩니다. 선천성 림프구 세포(ILC)는 면역학 분야에서 비교적 최근에 확인되었으며 건강과 질병에 중요한 역할을 합니다. 여기에 설명된 연구에서는 DC 기반 백신 접종의 쥐 모델을 사용하여 3형 ILC(ILC3)와 DC 간의 통신을 조사했습니다. DC 백신 투여 후 ILC3 집단의 국소 및 전신 변화가 관찰되었으며, B16F10 흑색종 세포로 공격 시 폐의 ILC3 집단의 변화가 관찰되었습니다. DC와 ILC3 사이의 상호 작용은 건강, 질병 및 면역 요법 개발에 있어 이들의 통신이 가질 수 있는 잠재력을 결정하기 위해 추가로 조사되어야 합니다.

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키워드:

수지상 세포(DC); 3형 선천 림프 세포(ILC3); 타고난; 의사소통

1. 소개

선천성 림프 세포(ILC)는 조직 발달, 복구 및 항상성에 중요한 기능을 갖는 공통 림프 전구 세포에서 유래된 이종 백혈구 그룹입니다. ILC는 염증성 장 질환, 건선, 천식 및 다양한 자가면역 질환을 포함한 다양한 염증성 질환과 관련이 있습니다[1]. 이들은 일반적으로 전사 인자, 사이토카인 프로필 및 특정 표현형 마커의 발현을 기반으로 1형(ILC1), 2형(ILC2), 3형(ILC3)의 세 가지 주요 그룹으로 구분됩니다[2]. 자연 살해(NK) 세포는 유사성으로 인해 때때로 ILC1의 하위 집합으로 분류됩니다. 그러나 NK 세포는 ILC의 하위 유형으로 구별되는 전사 인자 발현 및 세포 용해 활성과 같은 ILC1과 구별되는 특징을 갖는 것으로 나타났습니다 [3]. 그러나 많은 사람들은 여전히 ​​NK 세포를 ILC1의 하위 집합으로 간주합니다[4]. 유사한 사이토카인 프로필, 전사 인자 및 면역학적 기능으로 인해 ILC(NK 세포, ILC1, ILC2 및 ILC3)는 세포독성 T 림프구인 Th1, Th2 및 Th17을 반영하는 적응 면역 체계 구성 요소의 선천적 대응물로 간주됩니다. 응답은 각각 [4]입니다. 그러나 T 세포와는 달리 항원 특이적 수용체가 부족합니다.

DC는 면역 반응과 내성 유도에 중요한 선천적 백혈구입니다. 그들은 병원체 및/또는 손상 관련 분자 패턴을 인식하는 패턴 인식 수용체를 가지고 있으며 가장 효율적인 항원 제시 세포입니다[6]. 항원 제시와 사이토카인 분비를 통해 DC는 순수 T 세포의 운명을 지시하고 염증 유발 반응이나 면역 억제를 유도할 수 있습니다. T 세포는 항원을 위험한 것으로 인식하여 공격하거나 위험하지 않은 것으로 인식하고 관용원성 표현형을 취하도록 교육받을 수 있습니다[6]. DC는 또한 선천성 면역의 활성화뿐만 아니라 적응성 면역의 교육에도 관여합니다. 직접적인 접촉이나 다양한 사이토카인 및 수용성 인자의 생성을 통해 DC는 다른 선천성 백혈구를 활성화하고 선천성 면역 반응을 촉진할 수 있습니다[7].

DC의 힘은 DC 백신과 같은 면역요법에 활용되어 왔습니다. DC 백신은 환자로부터 DC를 분리하거나 DC 전구체를 분리하고 DC를 유도하여 제조됩니다. 이러한 DC는 생체외에서 조작되며, 이는 면역원성 방식으로 DC의 성숙을 수반합니다. DC에는 또한 특정 항원이 탑재되어 있으며, 이는 백신이 [8]에 대한 면역원성 반응을 개발하는 것을 목표로 할 것입니다. DC 백신은 적응 면역 체계를 교육하여 항원 특이적 반응, 특히 항원 특이적 세포독성 T 세포를 유도하는 DC의 능력을 활용하는 면역치료 플랫폼입니다. 따라서 대부분의 DC 백신 연구는 적응 면역 체계를 교육하는 DC의 능력에 중점을 두었습니다. 그러나 최근 몇 년 동안 DC와 NK 세포 사이의 관계는 DC 백신 접종의 효능에 중요한 항종양 면역에 강력한 영향을 미치는 것으로 나타났습니다 [9-11]. 이는 DC와 다양한 선천적 백혈구 사이의 다른 관계를 탐구해야 할 중요한 필요성과 이러한 통신이 DC 백신의 효능에 미칠 수 있는 영향을 보여줍니다. NK 세포는 ILC 계열의 일부이고 ILC가 T 세포와 매우 유사하기 때문에 [5] 여기에 제시된 연구의 목적은 DC와 ILC 계열의 다른 구성원인 ILC3 사이의 잠재적인 관계를 조사하는 것이었습니다. 우리는 DC가 쥐의 골수 전구체 세포로부터 생체 외에서 생성되는 단핵구 유래 DC(moDC) 백신 플랫폼을 사용했습니다. MoDC 백신은 역사적으로 생산이 가장 쉬웠기 때문에 DC 백신의 가장 일반적인 형태입니다[12].

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ILC3는 장의 항상성, 세포외 박테리아에 대한 면역, 림프 조직의 발달에 중요한 기능을 가지고 있습니다. ILC3는 표면 마커의 발현과 사이토카인 생산이 다양한 그룹으로 세분화될 수 있습니다. 그러나 모든 ILC3는 ROR t를 표현합니다 [13]. ILC3의 한 하위 그룹은 기관 형성에 중요한 ILC{6}}림프 조직 유도 세포입니다[14]. ILC3는 또한 천연 세포독성 수용체(NCR) 발현을 기준으로 세분화될 수 있으며, 이는 마우스에서는 NKp46 발현[15,16]이고 인간에서는 NKp44[17,18]입니다. 따라서 기능적 능력과 표현형 특성에 차이가 있는 NCR+와 NCR-ILC3가 있습니다. 예를 들어, NCR+ ILC3는 IL-22을 생성하지만 IL-17을 생성하지 않는 반면, NCR- ILC3는 두 사이토카인을 모두 생성할 수 있다고 제안되었습니다[19]. 그러나 최근 Fiancette 등의 연구에서는 NCR+ ILC3가 적은 양의 IL-17을 생성할 수 있는 것으로 나타났습니다[20]. Rankinet al. NCR+ ILC3가 전사 인자 T-bet을 필요로 한다는 사실이 생쥐에서 입증되었습니다. 따라서 NCR+/- ILC3는 NKp46과 T-bet 발현을 기반으로 구별할 수 있습니다. 여기에 설명된 연구에서 쥐 ILC3는 lineage-CD45+DX5-ROR t +로 정의되었으며 NCR+ ILC3도 T-bet+NKp46+이고 NCR-ILC3는 T-bet-NKp46입니다. − (표 1 및 부록 A 그림 A1~A3).

표 1. 유세포 분석에 의해 정의된 ILC3 하위 집합.

이 연구의 목적은 DC 백신과 ILC3 사이에 의사소통이 있는지, 그리고 이들 상호 작용이 DC 면역요법에서 가질 수 있는 잠재력을 밝히는 데 도움을 주는 것이었습니다. ILC3는 다양한 질병과 암에서 역할을 하는 것으로 입증되었으므로 다양한 면역치료 상황에서 잠재력을 가지고 있습니다. ILC3는 면역학 분야에서 상대적으로 새로운 것이며 결과적으로 질병 및 치료에 대한 ILC3의 영향은 제한적으로 연구되었습니다. ILC3는 외부 자극에 반응하여 ILC3의 활동과 종양의 진행 또는 억제를 촉진하는지 여부를 결정합니다[21,22]. Th17 세포와 유사하게, ILC3s는 전사 인자 ROR t를 가지며 IL-17 및 IL-22과 같은 Th17 반응 사이토카인을 생성합니다. IL-22은 장내 세균 감염을 제어하는 ​​데 중요합니다[16]. 그러나 박테리아 유발 대장암 모델에서는 대장 내 ILC에서 나오는 IL{14}}와 IL-22가 대장암 발병에 기여하는 것으로 나타났습니다[23]. 더욱이, ILC3는 유방암의 부정적인 결과와 상관관계가 있었습니다[24]. 반대로, NCR+ ILC3와 3차 림프구조(TLS) 사이의 연관성과 비소세포폐암에서 더 나은 임상 결과가 관찰되었습니다[18]. 또한 최근 연구에서는 대장암에서 ILC3를 조사했습니다. 이 연구에서는 일치하는 비악성 인접 조직과 비교하여 절제된 대장 종양의 환자 샘플에서 ILC1의 증가와 ILC3의 감소가 관찰되었습니다. RNA 염기서열분석과 전사 프로파일링을 통해 ILC3는 비악성 조직에 비해 대장암 내에서 가소성이 증가하고 기능적 능력이 다른 것으로 나타났습니다. 흥미롭게도, RNA 염기서열 분석은 종양에 침투하는 ILC3가 ILC1 표현형으로 전환하기 위해 상향 조절된 가소성을 가지고 있음을 시사했습니다. 연구에서는 ILC3와 T 세포의 상호작용이 I형 면역을 뒷받침하고 대장암에서는 이러한 상호작용이 제한되어 항종양 반응을 방해한다는 사실을 관찰했습니다. 이는 항종양 면역에서 ILC3의 중요한 기능을 지원합니다. 전반적으로, 이 논문은 ILC3가 면역학적 항상성과 대장암의 조절에 있어 중요한 역할을 한다는 것을 입증했습니다[25]. 따라서 ILC3는 건강과 질병에서 이중 역할을 하는 것으로 간주됩니다. 이는 암 진행을 촉진할 수 있지만[23,24,26] 항종양 반응에도 기여할 수 있습니다[18,25,27,28]. 이들의 표현형과 암에 대한 기여는 맥락에 따른 것으로 보이며, 이는 종양 진행을 지원하기보다는 항암 반응을 돕는 표현형을 얻기 위해 면역요법을 통해 ILC3를 조작할 가능성을 나타냅니다. 따라서 DC 기반 백신은 ILC 표현형 및 사이토카인 생산의 조작을 통해 종양 미세환경에 영향을 미칠 수 있는 방법을 나타내며, 이는 상황에 따라 면역 반응을 맞춤화할 수 있으며 암 연구에 도움이 될 수 있습니다.

특히 DC 백신 접종과 관련하여 DC와 ILC3 사이의 통신에 대한 연구가 제한되어 있기 때문에 여기에 설명된 연구에서는 마우스에 DC 기반 백신을 투여한 후 ILC3 집단의 변화를 조사했습니다. 이 논문에서는 DC 기반 백신과 ILC3 사이의 통신이 관찰되었으며, 이는 면역화 후 최소 10일 동안 ILC3 반응에 대한 백신의 지속적인 영향을 통해 나타났습니다.

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2. 결과

2.1. DC 백신 투여 후 국소 배액 림프절에서 NCR+ 및 NCR- ILC3의 수가 증가했습니다. 

생체외에서 쥐 골수 유래 세포로부터 DC를 구별하여 DC 백신을 제조했습니다. 이들 DC는 성숙을 촉진하여 면역원성 표현형을 획득하도록 자극되었습니다. 그런 다음 DC에 펩타이드가 로딩되었습니다. 이 연구는 두 개의 선천적 백혈구, DC 및 ILC3 사이의 통신 특성에 중점을 두기 때문에 백신 생산을 위해 선택된 펩타이드는 항원 특이적 T 세포가 교란 변수가 되는 것을 피하기 위해 의도적으로 생물학적 모델과 관련이 없습니다. 따라서 DC 백신에는 닭 난알부민 유래 펩타이드가 로딩되었습니다.

DC 백신 접종이 ILC3 집단에 영향을 미치는지 조사를 시작하기 위해 먼저 백신 접종 부위에 가까운 세포질에 차이가 있는지 평가했습니다. ILC3 수의 증가를 포함하여 DC 백신 접종 후 국소 배액 림프절에 변화가 있었습니다(그림 1). ILC3의 증가 동역학은 DC 백신 접종 후 ILC3가 점차적으로 증가한다는 것을 보여주었습니다(그림 1b,c). 국소 배액 림프절의 NCR+ 및 NCR- ILC3의 수를 평가했으며 두 하위 모집단 모두 DC 백신 투여 후 증가했습니다. NCR+ 및 NCR- ILC3 개체군은 모두 DC 백신 접종 후 3일에 최고조에 달했지만, NCR- ILC3는 면역 후 7일에 항상성 수치로 돌아갔고, NCR+ ILC3의 수는 가짜 치료 대조군 마우스에 비해 상당히 높게 유지되었습니다.

그림 1. DC 면역화 후 국소 배수 림프절에서 천연 세포독성 수용체(NCR)+ 및 NCR- 3형 선천 림프구 세포(ILC3s)의 수가 증가했습니다. 암컷 C57BL/6 마우스에 뒷발 주사를 통해 DC 백신을 접종했습니다. ILC3 집단에 대해 슬와 림프절을 검사했습니다. (a) 림프절의 총 세포 수를 결정했습니다. (b) NCR- ILC3 및 (c) 림프절 내 NCR+ ILC3 축적 및 (d) NCR- ILC3 및 (e) 림프절 내 CD{{1{17}}}} 세포의 비율 NCR+ ILC3. 각 막대는 4개의 슬와 림프절의 데이터를 나타냅니다. 인산염 완충 식염수(PBS)를 접종한 대조 마우스와 DC 백신을 접종한 마우스 사이의 유의한 차이를 확인하기 위해 각 시점에서 스튜던트 t-테스트를 ​​사용했습니다(p-값 * < 0).{{ 21}}5, ** < 0.005, *** < 0.0005, **** < 0.0001). 배수 슬와 림프절에서 (f) NCR- ILC3 및 (g) NCR+ ILC3의 평균 수를 보여주는 대표적인 도트 플롯. 그래프에는 표준 편차와 함께 평균이 표시됩니다.

2.2. DC 백신은 비장 ILC3의 총 수를 변경하지 않고 비장에서 ILC3 사이토카인 생산을 증가시켰습니다.

다음으로, 백혈구의 전신 변화를 평가하기 위한 본 연구실의 표준 시점인 DC 백신 접종 후 1주 후에 가장 큰 이차 림프 ​​기관인 비장을 평가하여 ILC3 집단의 전신 변화를 조사했습니다[29]. 비장의 NCR+ 또는 NCR- ILC3의 총 수에는 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다(그림 2).

그림 2. DC 예방접종 후 비장 ILC3의 수에는 변화가 없었습니다. 암컷 C57BL/6 마우스(n= 8 [PBS] 또는 10 [DC])에 뒷발 주사를 통해 DC 백신을 접종했습니다. 접종 후 1주일 후에 비장을 수확하여 ILC3 집단에 대해 검사했습니다. (a) NCR- ILC3 및 (b) NCR+ ILC3의 비장 총 수(및 NCR+ ILC3에 대한 T-bet의 기하 평균 형광 강도) 및 (c) NCR-인 비장 CD45+ 세포의 백분율 ILC3 및 (d) NCR+ ILC3를 유세포 분석을 통해 모니터링하고 정량화했습니다. 인산염 완충 식염수(PBS)를 접종한 대조 마우스와 DC를 접종한 마우스의 개체군 사이의 유의성을 결정하기 위해 스튜던트 t-테스트를 ​​사용했습니다. 수단은 크게 다르지 않았습니다. 비장(e) NCR- ILC3 및 NCR+ ILC3의 평균 수를 보여주는 대표적인 도트 플롯. 표준편차와 평균은 그래프 막대와 오차 막대로 표시됩니다.

ILC3 사이토카인 프로필은 환경적 요인에 의해 영향을 받을 수 있으므로, 비장에서 IL{2}} 및 IL{3}}의 ILC3 생산을 DC 백신 접종 1주 후에 측정했습니다. 대조군 마우스와 비교하여 DC 백신으로 처리된 마우스에서 IL{5}} 또는 IL-22 또는 두 사이토카인을 모두 생성하는 ILC3가 증가했습니다(그림 3).

그림 3. DC 면역화 후 IL-17 및 IL-22을 생성하는 비장 ILC3가 증가했습니다. 암컷 C57BL/6 마우스(n=12-18)에 뒷발 주사를 통해 DC 백신을 접종했습니다. 대조군 마우스에는 인산염 완충 식염수(PBS)를 처리했습니다. 예방접종 1주일 후 비장을 채취하여 IL-17- 및 IL{{1{19}}}}생성 ILC를 검사했습니다. (a) IL-17, (b) IL-22 및 (c) IL-17 및 IL{{ 둘 다를 생성하는 계통 - CD127+DX5− 세포의 수 16}} 및 그에 상응하는 기하 평균 형광 강도를 세포내 사이토카인 염색 및 유동 세포측정법을 사용하여 결정하였다. 데이터는 양방향 ANOVA 테스트(p-값 * < 0.05, ** < 0.005)를 사용하여 분석되었습니다. (d) 대표적인 점 도표는 IL-17 및/또는 IL-22을 생성하는 비장 CD45+ 계통 -CD127+DX5- 세포의 평균 수를 보여줍니다. 그래프에는 표준 편차와 함께 평균이 표시됩니다.

2.3. B16F10 흑색종 세포를 사용한 DC 면역화 및 챌린지 후 ILC3 하위 모집단

ILC3는 전종양 유발 반응과 항종양 반응 모두에 기여함으로써 암 진행에서 이중 역할을 할 수 있습니다[22]. 따라서 암 상황에서 ILC3 반응에 대한 DC 백신 접종의 영향을 조사했습니다. 마우스에 DC 백신을 투여하고 일주일 후 B16F10 흑색종 세포를 정맥 주사하여 폐에 파종했습니다. 언급한 바와 같이, 선천성 면역의 구성요소만 평가되었으므로 백신에 의한 항원 특이적 교육은 우리 실험에서 평가되지 않았으므로 사용된 흑색종 모델은 오브알부민을 발현하지 않아 펩타이드가 DC에 로드되게 했습니다. 무관하다. 동역학 실험(그림 1)은 ILC3의 국소 반응이 3일 이내에 관찰될 수 있음을 보여주었습니다. 따라서, 시험처리 3일 후, ILC3 하위 집단의 수와 이들의 사이토카인 생산 능력을 비장과 폐에서 검사했습니다. 미경험 쥐의 비장에서 관찰된 것과 유사하게, 대조군과 DC 면역화군 사이의 비장 NCR+ 및 NCR- ILC3의 총 수에는 유의미한 차이가 없었습니다(그림 4). 그러나 순수 모델과 달리 비장에서는 IL-17 및/또는 IL-22 생산에 더 이상 변화가 없었습니다(그림 5).

그림 4. DC 백신 접종 및 B16F10 흑색종 세포 공격 후 비장 ILC3의 총 수에는 변화가 없었습니다. 암컷 C57BL/6 마우스(n=10)에 뒷발 주사를 통해 DC 백신을 접종하고 1주 후에 마우스에 꼬리 정맥 주사를 통해 3 x 105 B16F10 세포를 투여했습니다. 비장을 채취하여 B16F10 투여 3일 후 ILC3 집단의 축적을 검사했습니다. 비장 (a) NCR- ILC3 및 (b) NCR+ ILC3의 수(및 NCR+ ILC3에 대한 T-bet의 기하 평균 형광 강도) 및 (c) NCR-인 비장 CD45+ 세포의 백분율 ILC3 및 (d) NCR+ ILC3를 유세포 분석법으로 모니터링하고 정량화했습니다. 스튜던트 t-테스트를 ​​사용하여 인산염 완충 식염수(PBS)로 처리한 대조 마우스와 DC 접종 마우스의 개체군 간의 유의성을 결정했습니다. 수단은 크게 다르지 않았습니다. 대표적인 도트 플롯은 비장(e) NCR- ILC3 및 NCR+ ILC3의 평균 수를 보여줍니다. 평균과 표준편차는 막대 그래프와 오차 막대로 표시됩니다.

그림 5. DC 백신 접종 및 B16F10 흑색종 세포 공격 후 ILC를 생성하는 비장 IL-17 및/또는 IL-22-수에는 변화가 없었습니다. 암컷 C57BL/6 마우스(n=10)에 뒷발 주사를 통해 DC 백신을 접종하고 1주 후에 3 x 105개의 B16F10 세포를 정맥 내 투여했습니다. 3일 후, 비장을 수확하여 ILC3 사이토카인 생산을 검사했습니다. (a) IL-17, (b) IL-22 및 (c) IL-17 및 둘 다를 생성하는 계보 CD127+DX5- 세포의 수 IL-22 및 이에 상응하는 기하 평균 형광 강도는 세포내 사이토카인 염색 및 유세포 분석을 사용하여 결정되었습니다. 데이터는 양방향 ANOVA 테스트를 사용하여 분석되었으며 DC 백신 접종 마우스와 인산염 완충 식염수(PBS) 처리 대조군 사이에 유의미한 차이는 발견되지 않았습니다. (d) 대표적인 점 도표는 IL-17 및/또는 IL-22을 생성하는 비장 CD45+계통 CD127+DX5- 세포의 평균 수를 보여줍니다.

꼬리 정맥을 통한 B16F10 세포의 정맥 주사는 폐로의 합성 흑색종 전이의 일반적인 마우스 모델입니다[30]. 따라서 ILC3 하위 집단의 수를 결정하고 이들의 사이토카인 생산을 평가하기 위해 폐도 검사되었습니다.

NCR+ ILC3의 수가 증가함에 따라 NCR- ILC3의 수가 감소했습니다(그림 6). 그러나 폐에서 ILC{4}}매개 사이토카인 생산에 대한 DC 백신접종의 효과는 관찰되지 않았습니다(그림 7).

그림 6. DC 면역화 및 B16F10 세포 공격 후 폐의 ILC3 하위 모집단에 수치 변화가 있었습니다. 암컷 C57BL/6 마우스(n=10)는 뒷발 주사를 통해 DC 백신을 투여받았고, 1주일 후에 3 × 105개 B16F10 세포를 정맥 투여했습니다. 시험처리 3일 후, (a) NCR- ILC3 및 (b) NCR+ ILC3의 수(및 NCR+ ILC3에 대한 T-bet의 기하 평균 형광 강도)와 CD의 백분율에 대해 유동 세포측정법을 사용하여 폐를 검사했습니다. (c) NCR- ILC3 및 (d) NCR+ ILC3인 {18}} 세포. 인산염 완충 식염수(PBS)로 처리한 대조 마우스와 DC 접종 마우스의 하위 집단 사이의 유의성을 결정하기 위해 스튜던트 t-테스트를 ​​사용했습니다(p-값 *<0.05, *** <0.0005, and **** < 0.0001). Representative dot plots showing the average number of pulmonary (e) NCR− ILC3s and NCR+ ILC3s. The graphs display the mean with the standard deviation.

그림 7.DC 백신 접종 및 B16F10 흑색종 세포 공격 후 폐에서 IL{1}} 및/또는 IL-22을 생성하는 ILC3의 수에는 변화가 없었습니다. 암컷 C57BL/6 마우스(n=10)에게 뒷발 주사를 통해 DC 백신을 접종하고 1주일 후에 3 x 105 B16F10 세포를 정맥 내 투여했습니다. 3일 후 폐를 채취하여 ILC{12}}매개 사이토카인 생산을 검사했습니다. 생산하는 계보−CD127+DX5− 세포의 수(a) IL-17, (b) IL-22 및 (c) IL{{0}} 및 IL-22 모두와 이에 상응하는 기하 평균 형광 강도를 세포내 사이토카인 염색 및 유세포 분석을 사용하여 결정했습니다. 데이터는 양방향 ANOVA 테스트(p-값 *** < 0.0005)를 사용하여 분석되었습니다. IL-22-생산, IL-17-생산, IL-22 및 IL-17 다중 사이토카인 생산 계통−CD{{의 총 수에는 큰 차이가 없었습니다. 12}}DX5− 세포. (d) IL-17 및/또는 IL-22을 생성하는 폐 CD45+ 계통−CD127+DX5− 세포의 평균 수를 보여주는 대표적인 점 도표. 표준편차와 평균은 그래프 막대와 오차 막대로 표시됩니다.

3. 토론

여기에 설명된 연구에서는 DC 백신의 맥락에서 ILC3와 DC 간의 잠재적인 통신을 조사하려고 했습니다. DC 백신 접종 후 배액 림프절(그림 1)에서 NCR+ 및 NCR- ILC3 하위 집단의 수가 모두 증가했는데, 이는 DC 백신과 ILC3 하위 집단 사이에 발생하는 국소 통신을 암시합니다. 그러나 DC와 NCR+ ILC3 사이의 통신은 DC와 NCR- ILC3 사이에서 관찰된 것보다 NCR+ ILC3의 총 수에 더 오래 지속되는 영향을 미쳤습니다. 이는 DC가 NCR의 발현에 따라 ILC3와 고유한 상호작용을 가질 수 있음을 나타냅니다. DC 백신 접종 후 7일(그림 2), DC 백신 접종 후 10일 및 B16F10 흑색종 세포 공격 3일 후(그림 4) 비장에서 ILC3 하위 집단의 수에는 변화가 관찰되지 않았습니다. IL{19}} 및 IL{20}} 생산에 대해 ILC3를 분석하는 방법은 세포의 시험관 내 재자극으로 인해 번역 및 전사 반응을 모두 보여주기 때문에 한계가 있습니다. 그러나 우리는 모든 실험에 실험 대조군을 추가했는데, 이는 생체 내에서 수신된 신호에 반응하여 ILC3가 생성하는 것을 검출하기 위해 시험관 내 무자극 처리가 될 것입니다. 도 3d, 5d 및 7d에 도시된 바와 같이, 시험관 내 자극을 받지 않은 세포는 IL-17 및 IL-22을 생성했습니다. 또한, 비장 ILC3 세포 수는 변하지 않았지만(그림 2), ILC3 하위 집단에 의한 사이토카인 생산은 DC 백신 접종 후 7일 동안 달랐습니다(그림 3). 이는 DC 백신접종이 수치적으로 영향을 주지 않고 ILC3 반응의 기능에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다. 선천적 면역 체계의 구성 요소인 ILC3의 조직 안팎으로의 이동은 며칠 내에 발생할 수 있으므로 DC 백신 접종 후 7~10일 동안 치료에 따라 조절되는 수치 차이를 감지할 수 없습니다. 이에 대한 증거는 ILC3의 수가 3일 동안 증가한 후 감소하기 시작한 DC 백신 배수 림프절에서 관찰되었습니다(그림 1). 따라서, DC 예방접종 후 7일째에 항상성 수치로 돌아왔기 때문에 누락된 비장의 ILC3 하위 모집단에 수치 변화가 있었을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 연구는 단기적인 일시적 반응이 아닌 장기간 지속되는 반응에 초점을 맞추었기 때문에 이 방법을 더 이상 조사하지 않았습니다. 흥미롭게도 비장 ILC3 하위 집단의 수는 대조군과 다르지 않았지만 이들의 사이토카인 프로필은 변경되었습니다(그림 3). 비장 ILC3에서 IL-22 및 IL-17의 생산이 증가하여 DC 백신 접종이 ILC3에 전신 효과가 있음을 입증했습니다. 요약하면, DC 백신접종은 비장 ILC3의 양에는 영향을 미치지 않았지만 기능에는 영향을 미쳤습니다.

종양이 없는 쥐의 비장에서 DC 면역화 후 7일 동안 ILC3- 유래 사이토카인 생성에 대한 지속적인 효과가 있었지만, 비장 내 ILC3에 대한 이러한 영향은 B16F10 흑색종 세포를 정맥 투여한 후 3일 동안 감지할 수 없었습니다. 그림 5). DC 백신은 종양 공격 시 억제된 무종양 모델에서 ILC3 집단을 프라이밍하는 것으로 나타났습니다. ILC는 환경에 크게 영향을 받기 때문에 이는 백신의 DC와 ILC3 사이의 통신이 종양이 없는 모델로 제한되었음을 시사할 수 있습니다. 반대로, 이는 또한 B16F10이 모여서 백혈구 충원을 유도하는 미세 환경을 확립했을 수 있는 신체의 다른 위치로 프라이밍된 ILC3가 동원되기 때문일 수도 있습니다.

B16F10 세포 투여만 받은 DC 백신접종을 하지 않은 대조군 마우스와 비교하여 DC 백신접종 후 10일 및 B16F10 세포 공격 후 3일에 폐에서 관찰된 ILC3 하위 모집단의 변화가 있었습니다. 구체적으로 폐에서 NCR+ ILC3 수가 증가하고 NCR- ILC3가 감소했습니다(그림 6). T-bet은 Th1 반응과 관련된 전사 인자입니다[31]. 따라서 T-bet을 발현하는 NCR+ ILC3의 증가는 제1형 면역의 잠재적 촉진을 나타냅니다. 이는 일반적으로 제1형 면역 반응이 요구되는 암 상황에서 유익한 ILC3 반응이 될 수 있습니다.

남성의 면역체계 강화를 위한 시스탄체의 효능

NCR+ ILC3는 NCR- ILC3의 하위 집합에서 파생될 수 있는 것으로 나타났습니다[16]. 따라서 NCR+ ILC3의 증가와 NCR- ILC3의 감소는 NCR- ILC3가 NCR+ ILC3로 전환되도록 유도하는 자극에 기인할 수 있습니다. ILC3가 NCR-에서 NCR+로 표현형 전환을 겪고 있다면 전환 도중이나 직후, 그리고 주변 환경과 새로운 표현형에 적응하는 동안 사이토카인을 생산하지 못했을 수도 있습니다. 따라서 표현형 전환이 일어나는 동안 사이토카인 생산이 중단되거나 지연되었을 수 있으며, 이는 ILC{12}}매개 IL-17 및/또는 IL-22 생산에 변화가 없는 이유를 설명할 수 있습니다. 폐(그림 7). 그러나 DC 백신접종이 이 시점에서 폐의 ILC3에 의한 사이토카인 생산에 단순히 영향을 미치지 않았을 수도 있습니다.

4. 재료 및 방법

윤리 승인

모든 쥐 연구는 Guelph 대학의 동물 관리 직원의 감독하에 동물 활용 프로토콜 #3807에 따라 수행되었습니다.

쥐

암컷 C57BL6 마우스는 Charles River Laboratories로부터 5~8주령에 받았습니다. 쥐를 Guelph 대학의 동물 격리실의 통제된 환경에 가두었고 실험 시작 전 1주일 동안 적응하도록 했습니다. 생쥐에게 먹이를 주고 물을 자유롭게 제공했습니다.

수지상 세포 배양

암컷 C57BL6 마우스의 대퇴골과 경골을 수확하고 뼈 끝을 잘라냈습니다. 주사기를 사용하여 경골과 대퇴골의 골수를 PBS로 페트리 접시로 씻어냈습니다. 골수를 단일 세포 현탁액에 재현탁하고 혈구계를 사용하여 계수했습니다. 그런 다음 세포를 2-메르캅토에탄올 [Gibco Ref# 21985-023], 1% 페니실린/스트렙토마이신 [HyClone Cat# SV30010] 및 10%가 함유된 배지(RPMI [HyClone Cat# SH30027.01])에 재현탁시켰습니다. 소 태아 혈청 [VWR Cat#97068-085]), mL당 1.25 × 106개 세포 농도, 20ng/mL 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)(Biolegend Cat#576308)가 보충됨 플라스크당 5mL씩 25cm2 배양 플라스크에 분주했습니다. 배양물을 5% CO2, 37oC의 가습 인큐베이터에 넣고 7일 동안 배양했습니다. 배양 2일차에 20ng/mL GM-CSF가 포함된 5mL의 신선한 배지를 추가했습니다. 5일째에 각 배양액 5mL를 원심분리하고 상층액을 제거했습니다. 세포를 20ng/mL GM-CSF가 포함된 5mL의 새로운 배지에 재현탁시키고 배양 플라스크에 다시 첨가했습니다. 배양물을 7일째에 수확하고 백신접종을 위해 준비했습니다.

수지상 세포 백신 접종 준비

수지상 세포(DC) 배양물을 50 mL 원뿔형 튜브로 옮기고 혈구계산기를 사용하여 계수했습니다. 세포를 Escherichia coli O55:B5(Sigma Cat#L2880)의 100ng/mL 지질다당류(LPS)와 1μg/mL의 닭 난알부민(OVA)257-264(SIIN)(PepScan Systems, Lelystad, 네덜란드)로 자극했습니다. 5% CO2, 37°C 인큐베이터에서 1시간 동안. 그런 다음 세포를 PBS로 3회 세척하고 30μL당 5 x 105개 세포의 농도로 재현탁했습니다. 백신은 PBS 30μL당 5×105개 세포의 용량으로 투여되었습니다.

조직 처리

림프절과 비장을 수확하여 행크스 완충 식염수(HBSS) 2mL가 담긴 페트리 접시에 넣었습니다. 3mL 주사기 마개의 뒷면을 사용하여 단일 세포 현탁액으로 압축했습니다. 단일 세포 현탁액을 70 µm 기공 크기의 세포 여과기를 사용하여 50 mL 원뿔형 튜브로 여과했습니다. 림프절은 혈구계산기를 사용하여 계산되었습니다. 비장을 원심분리하고 상층액을 제거한 후 세포를 ACK 용해 완충액(8.29 g NH4Cl [0.15 M], 1 g KHCO3 [10.0 mM], 37.2 mg Na2EDTA [0.1 mM])에 재현탁시켰습니다. Milli Q 물 1 mL)을 넣고 5분간 방치하여 적혈구를 용해시킵니다. 세포를 HBSS로 두 번 세척한 후 배지에 재현탁시키고 혈구계산기를 사용하여 계수했습니다.

폐를 수확하고 무게를 측정한 후 HBSS에 1mg/mL 콜라게나제 IV(Gibco Ref#17104-019) 및 5μg/mL DNase I(Roche Ref#11284932001)을 함유한 GentleMACSTM 튜브에 넣었습니다. GentleMACS™ 해리기를 사용하여 샘플을 폐 프로토콜 A를 통해 실행한 다음 5% CO2가 포함된 37°C 인큐베이터에서 20분간 배양했습니다. 그런 다음 샘플을 GentleMACSTM 해리기의 폐 프로토콜 B를 통해 실행했습니다. HBSS의 샘플 부피의 두 배를 샘플에 첨가하여 효소 반응을 중화시켰습니다. 샘플을 70μm 기공 크기의 셀 스트레이너를 통해 50mL 원뿔형 튜브로 여과했습니다. 그런 다음 세포를 HBSS로 두 번 세척하고 ACK 용해 완충액에 재현탁시켰습니다. ACK 용해 완충액에서 5분 후, 세포를 HBSS로 2회 세척하고 배지에 재현탁시켰습니다.

사이토카인 반응 분석

조직 샘플의 단일 세포 현탁액을 96-웰 ​​플레이트에 이중으로 시딩했는데, 여기서 한 웰은 무자극 대조군으로 처리되었고 다른 웰은 잘 자극제 처리를 받았습니다. 자극되지 않은 웰에는 배지만 제공되었고 자극제 처리된 웰에는 배지에 10ng/mL 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA) 및 1,500ng/mL 이오노마이신이 공급되었습니다. 세포를 5% CO2, 37oC 인큐베이터에 1시간 동안 두었습니다. 그런 다음 Brefeldin A(GolgiPlug, Biolegend Cat#420601)(×100 희석)를 모든 샘플 웰에 첨가하고 플레이트를 추가 4시간 동안 인큐베이터에 다시 넣었습니다. 이어서, 세포를 PBS로 2회 세척하고 유세포분석법에 의한 분석을 위해 염색하였다.

B16F10 흑색종 세포

B16F10 세포를 액체 질소에서 해동하고 혈구계를 사용하여 계수했습니다. 그런 다음 세포를 배지(1% 페니실린/스트렙토마이신[HyClone Cat# SV30010] 및 10% 소 송아지 혈청[VWR Cat#10158-358])을 포함하는 Dulbecco의 고글루코스 변형 Eagles 배지[HyClone Cat#SH3002201])에 재현탁시켰습니다. mL당 1 x 105개 세포의 농도. 그런 다음 B16F10 세포를 배양 플라스크에 분주하고 5% CO2가 포함된 37℃ 인큐베이터에 넣었습니다. 투여용 B16F10 세포를 준비하기 위해 세포를 배양 플라스크에서 50 mL 원뿔형 튜브로 옮기고 PBS로 세척한 후 PBS에 재현탁시켰다. 혈구계산기를 사용하여 세포 수를 세고 PBS에 재현탁하여 200μL당 3 x 105개 세포의 용량을 제공했습니다.

세포내 사이토카인 항체 염색

세포를 {{0}}웰 플레이트에 시딩하고 Fc 블록(항-CD16/CD32, BioLegend Cat#101320)에 재현탁하고 4°C에서 15분 동안 배양했습니다. 세포를 0.5% 소 혈청 알부민(FACS 완충액)을 함유한 인산염 완충 식염수로 2회 세척한 다음, 세포 표면 염색 항체(CD45, BioLegend Cat#103132; NKp46, BioLegend Cat#137617; NKp46, BioLegend Cat#137617; DX5, BioLegend Cat#108919; CD127, BioLegend Cat#135007; Lineage Cocktail, BioLegend Cat#133311)을 넣고 4도에서 20분간 배양했습니다. 세포를 인산염 완충 식염수로 두 번 세척한 후 Zombie Aqua Fixable 생존 염료(FVD)(BioLegend Cat#423101)에 재현탁하고 4℃에서 30분 동안 배양했습니다. 인산염 완충 식염수를 사용하여 고정 완충액(BioLegend Cat#420801)에 재현탁하기 전에 세포를 두 번 세척했습니다. 세포를 4℃에서 20분 동안 배양하였다. 고정 후, 세포를 투과화 완충액(BioLegend Cat#421002)으로 2회 세척하였다. 세포를 세포내 염색 항체(IL-22, BioLegend Cat#516404; IL-17A, eBioscience Cat# 17-7177-81)의 마스터 믹스에 재현탁하고 4°C에서 배양했습니다. 20분 세포를 투과화 완충액으로 2회 세척한 후 FACs 완충액에 재현탁한 다음 BD FACSCantoTM II 유세포 분석기로 처리하고 BD FACSDivaTM 소프트웨어를 사용하여 분석했습니다.

남성의 면역체계 강화를 위한 시스탄체의 효능

전사 인자 항체 염색

세포를 {{0}}웰 플레이트에 시딩하고 FC 블록(항-CD16/CD32 BioLegend Cat# 101320)에 재현탁한 후 4°C에서 15분 동안 배양했습니다. 세포를 FAC 완충액(PBS 내 소 혈청 알부민 [HyClone Cat# SH30574.02] 내 0.5%)으로 2회 세척한 후, 세포 표면 염색 항체(CD45, BioLegend Cat#103132; NKp46)의 마스터 믹스에 재현탁시켰습니다. , BioLegend Cat#137617; DX5, BioLegend Cat# 108919; CD127, BioLegend Cat#135007; Lineage Cocktail, BioLegend Cat#133311)을 넣고 4°C에서 20분 동안 배양했습니다. 그런 다음 세포를 FVD(BioLegend Cat#423101)에 재현탁한 인산염 완충 식염수로 두 번 세척하고 4℃에서 20분간 배양했습니다. 세포를 인산염 완충 식염수로 두 번 세척하고 마우스 FoxP3 고정 완충액(BD Pharmingen BD Sciences Cat#51-9006124)에 재현탁시킨 후 4°C에서 30분간 배양했습니다. 고정 후 FoxP3 투과 완충액에 재현탁된 마우스 FoxP3 투과 완충액(BD Pharmingen BD Sciences Cat#{34}})으로 세포를 세척하고 37oC에서 30분 동안 배양했습니다. 세포를 전사 인자 항체(ROR gamma(t), eBioscience Cat#17-6988-82; T-bet, eBioscience Cat# 12-5825-82)에 재현탁하고 4°C에서 20분간 배양했습니다. 세포를 투과화 완충액으로 2회 세척한 다음 FACs 완충액에 재현탁하고 BD FACSCantoTM II 유세포 분석기 및 BD FACSDivaTM 소프트웨어를 사용하여 분석했습니다.

통계 분석

NCR+ 및 NCR- ILC3의 비장 및 폐 집단은 짝을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 분석되었습니다. 동역학 실험 모집단 분석은 일반적인 일원 분산 분석(ANOVA)과 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 비교되었습니다. 비장과 폐의 사이토카인 분석은 양방향 ANOVA와 Šídák의 다중 비교 테스트를 사용하여 검사되었습니다. 처리 그룹의 평균은 p-값 < 0.05로 유의하게 다른 것으로 정의되었습니다.

게이팅 전략

먼저, 전방 산란 영역(FSC-A)과 측면 산란 영역(SSC-A)을 사용하여 림프구를 게이팅했습니다. 그런 다음, FSC-A 및 FSC-높이(FSC-H)를 사용하여 이중 세포를 제외했습니다. FVD에 대해 음성인 세포를 취함으로써 살아있는 세포를 게이트 온하였다. 그런 다음 CD127+ 및 계보 칵테일 셀을 사용하여 ILC 범위를 좁혔습니다. 그런 다음 CD45+ 셀이 켜졌습니다. 모든 NK 세포가 제외되었는지 확인하기 위해 DX5-를 활성화했습니다. ILC3의 전사 인자 식별을 위해 ROR t + 세포를 게이팅하고 이들 세포에서 NCR+ ILC3는 T-bet+ 및 NKp46+이고 NCR- ILC3는 T-bet- 및 NKp46이었습니다. 사이토카인 식별을 위해 림프구, 단일 세포, 살아있는 세포 및 CD127+ 계통-CD45+, IL-17 및 IL-22에 대한 게이팅을 다음과 같이 게이팅했습니다. ILC3는 IL-22 및 IL-17을 생성할 수 있는 이 최종 게이트의 유일한 셀이기 때문에 ILC3에 의해 생성됩니다.

남성의 면역체계 강화를 위한 시스탄체의 효능

5. 결론

비종양 모델에서 관찰된 비장의 ILC3-유래 IL-17 및 IL{2}} 생성 증가가 종양 유발 모델에서는 손실되었지만 NCR+ 및 IL{2}}에서는 반대의 변화가 있었습니다. 폐의 NCR- ILC3 집단. 이는 DC 백신접종이 종양 유발 모델은 물론 종양이 없는 쥐에서도 ILC3에 영향을 미쳤을 수 있음을 시사합니다. 그러나 항종양 반응에 대한 백신의 DC와 ILC3 사이의 이러한 관계의 효과는 아직 알려지지 않았으며 향후 연구 방향입니다. 따라서 여기에 설명된 연구는 종양이 없는 쥐와 종양이 있는 쥐 모두에서 DC 기반 백신과 ILC3 하위 집단 사이에 통신이 발생한다는 것을 보여줍니다. 이러한 의사소통과 그에 따른 면역 반응에 대한 영향은 복잡한 것으로 보입니다. 이러한 관찰은 향상된 DC 예방접종 전략을 개발하기 위한 노력의 일환으로 DC 백신과 ILC3 사이의 관계를 해독하려는 문헌 본문에 기여합니다. 우리는 항종양 반응을 지원하고 전종양 반응 지원을 제한하기 위해 ILC3 반응을 최적화하기 위해 이러한 의사소통을 조절할 수 있는 백신 접종 전략을 설계할 수 있는 가능성을 조사하는 추가 연구를 권장합니다.

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