RNA M6 A 리더 YTHDF2는 NK 세포의 항종양 및 항바이러스 면역을 제어합니다 3부

YTHDF2는 IL-15 매개 NK 세포 생존, 증식 및 효과기 기능에 필요합니다.

IL-15는 NK 세포의 다발성 기능에 가장 중요한 사이토카인은 아니지만 중 하나입니다. 우리와 다른 사람들은 이전에 IL{1}}이 NK 세포 항상성, 생존 및 효과기 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 발견했습니다(Becknell and Caligiuri, 2005; Carsonet al., 1997; Carson et al., 1994; Wang et al., 2019b; Yu 외, 2013).

세포의 다발성(Pleiotropy)은 다양한 환경에서 다양한 기능을 수행하는 능력을 의미합니다. 면역계의 많은 세포가 다양한 역할을 수행할 수 있기 때문에 세포 다발성(cell pleiotropy)은 면역과 밀접한 관련이 있습니다.

면역 체계에서 T 세포는 매우 중요한 유형의 세포입니다. 그들은 병원체를 인식하고 공격하는 동시에 다른 면역 세포의 활동도 조절합니다. T 세포의 다발성(pleiotropy)은 매우 중요합니다. 왜냐하면 면역 체계가 새로운 병원체를 만났을 때 T 세포는 효과적으로 대응하기 위해 짧은 기간에 다른 역할을 해야 하기 때문입니다. 예를 들어, 면역체계가 세균 감염에 직면하면 T세포는 세균을 죽이는 역할을 해야 하고, 면역체계가 바이러스 감염에 직면하면 T세포는 다른 면역세포를 조절하는 역할을 해야 한다.

또한, 면역 체계에서는 대식세포라고 불리는 세포 종류도 다발성 발현 효과를 가지고 있습니다. 그들은 외래 병원체를 식균하고 분해할 수 있으며, 다른 면역 세포를 활성화하여 병원체를 공격할 수도 있습니다. 대식세포의 다발성(pleiotropy)은 다양한 환경에서 다양한 역할을 수행해야 하기 때문에 중요합니다. 예를 들어, 바이러스 감염의 경우 대식세포는 바이러스와 싸우기 위해 일부 물질을 분비해야 하는 반면, 박테리아 감염의 경우 대식세포는 병원체를 제거하기 위해 박테리아를 삼켜 소화해야 합니다.

요약하면, 세포 다발성과 면역 사이에는 밀접한 관계가 있습니다. 다발성 세포는 다양한 병원체에 감염된 환경에서 다양한 역할을 수행할 수 있으며, 이를 통해 면역 체계의 반응 능력을 강화하고 다양한 병원체에 대한 신체의 면역력을 향상시킵니다. 그러므로 우리는 세포의 다발성(다면발현)에 주의를 기울이고 면역력 배양을 강화하여 인간의 건강을 유지해야 합니다. 기억력 향상이 필요하다고 볼 수 있는데, Cistanche Deserticola는 아세틸콜린 수치와 성장인자 수치를 높이는 등 신경전달물질의 균형도 조절할 수 있기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 이 물질은 기억과 학습에 매우 중요합니다. 또한 Cistanche Deserticola는 혈류를 개선하고 산소 전달을 촉진하여 뇌에 충분한 영양분과 에너지를 공급하여 뇌 활력과 지구력을 향상시킬 수 있습니다.

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현재 연구에서 우리는 IL-15가 NK 세포에서 YTHDF2의 mRNA와 단백질 수준을 상향조절한다는 것을 보여줍니다(그림 6A; 및 그림 1, D-F). 따라서 우리는 NK 세포의 IL-15 매개 생존 및 효과기 기능에 YTHDF2가 필요하다고 추측했습니다.

우리는 먼저 YTHDF2 발현을 직접 조절하는 IL{0}} 신호의 하류에 있는 잠재적인 전사 인자를 식별하려고 시도했습니다. 우리는 JASPAR(http://jaspar.genereg)과 함께 전체 게놈에 걸쳐 결합 위치에 대한 예측을 제공하는 University of California, Santa Cruz, Genome BrowserDatabase(https://genome.ucsc.edu)를 사용하여 DNA 요소 백과사전을 분석했습니다. .그물).

우리는 NK 세포에서 IL-15의 주요 하류 인자인 STAT5가 Ythdf2의 전사 시작 부위(TSS)의 2kb 상류 내에 4개의 결합 부위를 가지고 있음을 발견했습니다. 이는 IL-15가 긍정적으로 작용할 수 있음을 나타냅니다. STAT5를 통해 마우스 NK 세포에서 Ythdf2 전사를 조절합니다.

STAT5 억제제 STAT5-IN-1(Müller et al., 2008)을 사용함으로써 우리는 STAT5의 억제로 인해 쥐의 NK 세포에서 mRNA와 단백질 수준 모두에서 Ythdf2가 감소한다는 것을 보여주었습니다(그림 S4, A). 및 B). YTHDF2가 STAT5에 의해 조절되는 하류 인자인지 확인하기 위해 Stat5fl/fl Ncr1-iCre 마우스(이하 Stat5ΔNK 마우스라고 함)를 사용했는데, 여기서 STAT5는 마우스 NK 세포에서 특이적으로 삭제되었습니다(Wiedemann et al. al., 2020).

우리는 Stat5WT 및 Stat5ΔNK 마우스의 비장NK 세포를 IL-15로 처리했습니다. 우리는 Stat5WT 마우스의 NK 세포와 비교하여 Stat5ΔNK 마우스의 NK 세포에서 YTHDF2가 RNA와 단백질 수준 모두에서 실질적으로 감소한다는 것을 발견했습니다(그림 6, B 및 C, 그림 S4, C 및 D).

루시퍼라제 리포터 분석은 STAT5a와 STAT5b 모두 Ythdf2 유전자 전사를 직접적으로 활성화한다는 것을 보여주었습니다(그림 6, D 및 E). Chromatin Immunoprecipitation(ChIP)-qPCR 결과는 STAT5가 정상 IgG 제어에 비해 4개 부위에서 상당한 농축을 가지고 있음을 보여주었는데, 이는 마우스 NK세포에서 직접 결합을 나타냅니다(그림 6F). 함께, 우리의 결과는 YTHDF2 발현이 NK 세포에서 IL{8}} 신호 전달의 하류인 STAT5에 의해 조절된다는 것을 보여줍니다.

그런 다음 우리는 Ythdf2-결핍 NK 세포가 IL-15에 대한 반응에 결함이 있는지 궁금해했습니다. 우리는 Ythdf2ΔNK 마우스와 Ythdf2WT 마우스로부터 비장 NK 세포를 분리하고 IL{4}} 존재 하에서 시험관 내에서 배양했습니다. 우리는 Ythdf2WT 마우스와 비교하여 Ythdf2ΔNK 마우스에서 NK 세포 성장이 유의하게 감소했음을 발견했습니다(그림 6G). CellTrace Violet(CTV) 표지 분석은 NK 세포의 증식이 Ythdf2 결핍에 의해 손상됨을 보여주었습니다(그림 6H).

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세포주기 분포 분석에 따르면 G0/G1 단계에서 Ythdf2ΔNK 마우스의 NK 세포 분율이 크게 증가했지만 S 단계에서는 Ythdf2ΔNK 마우스의 NK 세포 분율이 크게 감소한 것으로 나타났습니다(그림 6 I). 이는 Ythdf2 결핍 결과 NK 세포의 G0/G1 단계 정지.

또한, Ythdf2WT 마우스와 비교하여 Ythdf2ΔNK 마우스의 세포사멸(annexin V+Sytox-Blue+/-) NK 세포가 2~3배 증가했는데(그림 6J), 이는 손실 후 NK 세포의 생존 결함을 나타냅니다. Ythdf2. 이러한 결과는 YTHDF2가 시험관 내에서 IL-15에 대한 NK세포의 반응성을 조절한다는 것을 시사합니다. IL-15은 생체 내에서 정상 상태로 잘 번역되지 않고 분비되므로(Corbel et al., 1996; Fehniger et al., 2001), Ythdf2-결핍 NK 세포가 반응에 결함이 있는지 조사하기 위해 생체 내에서 IL-15로 마우스를 IL-15로 처리했습니다.

우리는 마우스를 IL-15로 처리했을 때 Ythdf2-결핍 대 WT NK 세포가 세포 증식을 크게 감소시키고 세포 사멸을 증가시키는 것을 발견했습니다(그림 6K 및 그림 S4, E-J). YTHDF2는 특히 IL-15 수준이 높은 일부 조건에서 IL-15에 대한 NK 세포의 반응성을 조절한다고 제안합니다. 우리는 또한 IFN-, 그랜자임 B 및 퍼포린의 mRNA 및 단백질 수준이 IL-15에 반응하여 Ythdf2WT NK 세포에 비해 Ythdf2ΔNK NK 세포에서 유의하게 감소했음을 발견했습니다(그림 6, L-N). 이는 YTHDF2가 또한 시험관 내에서 IL-15 매개 NK 세포 효과기 기능에 기여합니다.

종합적으로, 우리의 데이터는 YTHDF2가 IL-15 매개 NK 세포 생존, 증식 및 이펙터 기능에 필요하다는 것을 보여줍니다. 다음으로 우리는 YTHDF2가 IL-15 매개 NK 생존, 증식 및 이펙터 기능을 조절하는 하류 메커니즘을 조사했습니다. 우리는 Ythdf2ΔNK 마우스와 Ythdf2WT 마우스의 NK 세포가 비슷한 수준의 IL-15 수용체 CD122(IL-15R ) 및 CD132(IL-15R c; 그림 S4 K)를 가지고 있음을 발견했습니다. IL-15 신호는 NK 세포의 Ras–Raf–MEK–ERK, PI3K–AKT–mTOR 및 JAK1/3–STAT3/5(Mishra et al., 2014)의 세 가지 이상의 하류 신호 경로에 의해 매개됩니다.

NK 세포에서 YTHDF2에 의해 어떤 신호 전달 경로가 조절되는지 조사하기 위해 IL-15로 자극한 후 Ythdf2ΔNK 마우스 또는 Ythdf2WT 마우스의 NK 세포에서 ERK, AKT, S6, STAT3 및 STAT5의 인산화 수준을 조사했습니다.

결과는 Ythdf2 결핍이 IL-15 자극 시 ERK, AKT, S6 및 STAT3 인산화에 영향을 미치지 않았지만(그림 S4, L 및 M) Ythdf에서 STAT5의 인산화 수준이 감소한 것으로 입증되는 것처럼 STAT5 활성화를 크게 억제한다는 것을 보여주었습니다. 7}}Ythdf2WT 마우스의 NK 세포보다 NK 세포가 부족한 것으로 나타났습니다(그림 6O). 이는 YTHDF2가 활성화된 NK 세포에서 최적의 IL{11}}/STAT5 신호 전달에 필요함을 나타냅니다.

우리는 IL-15 하류의 인산화된 STAT5가 Ythdf2의 프로모터에 결합한다는 것을 보여 주었고(그림 6, D-F) 여기서는 YTHDF2가 최적의 STAT5 인산화에 필요하다는 것을 보여 주었으므로 우리의 데이터는 하류의 STAT5-YTHDF2 양성 피드백 루프를 제안합니다. NK 세포 생존, 증식 및 효과기 기능을 제어할 수 있는 IL-15.

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전사체 전체 분석을 통해 Tardbp가 NK 세포에서 YTHDF2 표적으로 확인되었습니다.

YTHDF2가 NK 세포를 조절하는 분자 메커니즘을 다루기 위해 먼저 IL-2 확장된 Ythdf2WT 및 Ythdf2ΔNK NK 세포에서 RNA 시퀀싱(seq)을 수행했습니다. NK 세포에서 Ythdf2의 결실은 252개의 상향 조절된 유전자와 365개의 하향 조절된 유전자를 포함하여 617개의 차별적으로 발현된 유전자를 생성했습니다(그림 S5A).

유전자 온톨로지(GO) 분석은 차별적으로 발현된 유전자가 유사분열 세포질 분열, 염색체 분리, 방추체, 뉴클레오솜, 중간체 및 염색체를 포함하는 세포 주기, 세포 분열 및 세포 분열 관련 과정에서 상당히 풍부하다는 것을 보여주었습니다(그림 7). ㅏ).

유전자 세트 농축 분석(GSEA)은 Ythdf2ΔNKNK 세포에서 E2F 표적, G2/Mcheckpoint 및 유사분열 방추 특징 유전자 세트의 상당한 농축을 입증했습니다(그림 S5 B). Aurka, Aurkb, Cdc20, Cdc25b, Cdc25c, Cdk1, E2f2 및 Plk1(Bertoli et al., 2013)을 포함한 세포 주기 및 세포 분열 관련 유전자는 Ythdf2ΔNK 마우스의 NK 세포에서 크게 감소했습니다(그림 7B). ).

Anln, Aspm, Birc5, Bublb, Cenpe, Esco2, Ska1, Ska3 및 Tpx2(Gorbsky, 2015)와 같은 방추 및 염색체 분리 유전자도 Ythdf2WT 마우스의 NK 세포와 비교하여 Ythdf2ΔNK 마우스의 NK 세포에서 상당히 하향조절되었습니다(그림 7C).

또한 Birc5(Niu et al., 2010), Septin4(Larisch et al., 2000) 및 Rffl(Yanget al., 2007)을 포함한 세포 생존 유전자는 Ythdf2ΔNK 마우스의 NK 세포에서 유의하게 감소했습니다(그림 2). 7D). Klrk1, Ncr1, CD226 및 Gzma(Bezman et al., 2012)를 포함한 NK 세포 이펙터 기능 유전자도 Ythdf2ΔNK 마우스의 NK 세포에서 상당히 하향조절되었습니다(그림 7D).

이러한 데이터는 NK 세포 증식, 생존 및 이펙터 기능을 조절하는 YTHDF2의 특징적인 역할을 뒷받침합니다. 그런 다음 Ythdf2WT 및 Ythdf2ΔNK 마우스의 IL{3}} 확장 NK 세포에서 m6A-seq를 수행했습니다. 주요 구성 요소 분석에서는 각 유전자형의 세 가지 생물학적 복제물이 함께 클러스터된 것으로 나타났으며(데이터는 표시되지 않음), 이는 m6A-seq 샘플의 우수한 반복성을 시사합니다.

HOMER(모티프 강화의 초기하 최적화) 분석을 통해 m6A 합의 모티프(GGAC)가 확인되었으며, 이는 m6A 수정된 사본이 성공적으로 강화되었음을 나타냅니다(그림 7E). m6A 변형은 주로 단백질 코딩 전사체에 위치했으며 피크는 59개의 번역되지 않은 영역(UTR)과 39UTR, 특히 시작 및 종료 코돈 주변에서 풍부했습니다(그림 7F 및 그림 S5C).

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