고감도 키나제 분석에 의해 입증된 흑색종 세포에서 미량 수준의 발암성 키나제 PAK1의 혈청/PDGF 의존적 멜라닌 생성 역할
Mar 18, 2022
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요약:우리는 이전에 흑색종과 정상 멜라닌 세포가 모두 매우 높은 수준으로 발현하는 발암성 키나제 PAK4가멜라닌 생성. 본 연구에서는 매우 민감한 "Macaroni-Western"(IP-ATP-Glo) 키나제 분석을 사용하여 흑색종(B16F10) 세포가 매우 미세한 수준에서만 발현하는 또 다른 발암성 키나제 PAK1의 멜라닌 생성 가능성을 조사했습니다. PAK1 유전자를 억제하기 위해 흑색종 세포를 PAK{6}}shRNA로 형질감염시킨 후, 멜라닌 함량,티로시나제PAK1의 활성 및 키나제 활성을 야생형과 형질감염체 사이에서 비교하였다. (i) PAK1이 IBMX(3-이소부틸-1-메틸 크산틴) 및 -MSH(멜라닌 세포 자극 호르몬)와 같은 멜라닌 생성 호르몬에 의해 크게 활성화되고, (ii) PAK{8}}특정 shRNA를 통한 흑색종 세포는 멜라닌 함량과티로시나제혈청 및 멜라닌 생성 호르몬의 존재 하에 기저 수준의 활성, (iii) 흑색종 세포에 외인적으로 추가된 야생형 PAK1은 기저에 영향을 미치지 않으면서 -MSH-유도성 멜라닌 수준을 몇 배로 증가시키고, (iv) - MSH/IBMX-유도 멜라닌 생성은 혈청 또는 PAK1이 없을 때 거의 일어나지 않으며, 이는 PAK1이 주로 혈청 및 -MSH/IBMX 의존성에 필수적임을 분명히 나타냅니다.멜라닌 생성그러나 흑색종 세포에서는 기저가 아닙니다. 이 연구의 결과는 CAPE(카페인산 페네틸 에스테르), 커큐민 및 시코닌과 같은 다양한 허브 PAK{0}차단제가 화장품에 유용한 이유를 설명하는 최초의 과학적 근거를 제공할 수 있습니다.피부 미백.
키워드:박1,멜라닌 생성, 흑색종,티로시나제, MITF,피부 미백, 혈청
소개
머리카락, 눈의 홍채, 피부의 색은 멜라닌이라는 색소군에 의해 조절됩니다. 멜라닌의 세포내 공급원은 티로신이며 다음을 포함하는 일련의 효소적 산화(수산화)를 통해 멜라닌으로 전환됩니다.티로시나제, TRP(티로시나제 관련 단백질) 1 및 TRP2. 이러한 멜라닌 생성 효소를 인코딩하는 유전자의 발현은 베타-카테닌 및 MITF(소안구증 관련 전사 인자)의 두 개 이상의 발암성/멜라닌 생성 전사 인자(MTF)를 필요로 합니다. 대부분의 허브 화합물은피부 미백화장품은 이러한 멜라닌 생성 효소를 직접 억제하거나 MTF를 하향 조절합니다. 코직산과 같은 티로신 유사체는 첫 번째 범주에 속합니다(티로시나제억제제), CAPE(카페인산 페네틸 에스테르), 커큐민 및 시코닌과 같은 나머지 대부분은 두 번째 범주(MTF 조절제)에 속합니다(1,2). 흥미롭게도 CAPE, 커큐민, 시코닌, 쿠커비타신을 포함한 이러한 MTF 조절제 중 다수는 발암성/노화 키나제 PAK1(RAC/CDC{3}}활성화 키나제 1)(3-5)을 차단하는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 PAK1은 유모 세포, 눈 홍채 또는 피부 멜라닌 세포에서 이러한 멜라닌 생성/종양 생성 전사 인자의 활성화에 관여할 가능성이 가장 높습니다. 실제로, 적어도 베타-카테닌은 PAK1의 직접적인 기질 중 하나입니다(6). PAK1은 활성화를 위해 Ser 675에서 베타-카테닌을 인산화시켜 악성 형질전환을 유도합니다. 또한 베타 카테닌은 MITF의 활성화에 필수적이며,멜라닌 생성또는/및 멜라닌 세포의 종양 발생(7).
그러나 흥미롭게도 최근에 색소가 있는 마우스에서 PAK1 유전자를 녹아웃시키는 것이 알비노 마우스를 생성하지 못한다는 사실이 밝혀졌으며(Hong He et al., 미공개 관찰), 이는 유모 세포와 눈 모두에서 최소한 기저 멜라닌 생성이 있음을 분명히 나타냅니다. 홍채는 PAK1과 독립적이지만 피부에 대한 PAK1의 기여는멜라닌 생성명확히 해야 한다.
우리는 이전에 발암성 키나제 PAK4(CDC{1}}의존성 키나제 4)가 흑색종 및 정상 멜라닌 세포주 모두에서 고도로 발현되고 이들의 멜라닌 생성을 담당하여 CREB/베타-카테닌-MIFT-를 활성화시키는 것으로 나타났습니다.티로시나제PAK 계열의 또 다른 고도로 발현되는 구성원인 PAK2(RAC/CDC{1}}활성화 키나제 2)는 멜라닌 생성에 역할을 하지 않습니다(8).
이 연구에서 우리는 피부에서 PAK1이라는 다른 발암성 키나아제의 특정 역할에 대한 최초의 생화학적 증거를 제공합니다.멜라닌 생성, 발현 수준이 미미함에도 불구하고: 마우스 흑색종 유래 멜라닌 세포(B16F10)에서 PAK1 유전자의 shRNA 유도 침묵은 -MSH/IBMX 유도성멜라닌 생성PAK1 유전자의 과발현은 기저 수준에 영향을 미치지 않으면서 -MSH-유도성 멜라닌 생성을 증가시키는 반면, 기저 수준으로. 또한, 우리는 -MSH/IBMX유도성 멜라닌 생성이 PDGF(혈소판 유래 성장 인자)일 가능성이 가장 높은 혈청 인자를 필요로 한다는 것을 발견했습니다. 무혈청 배지에서는 기초만멜라닌 생성일어난다.
시스탄체티로시나아제의 활성을 감소
2. 재료 및 방법
2.1. 재료
B16F10 흑색종 세포는 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)에서 구입했습니다. PAK1-SureSilencing 플라스미드, 매력적인 형질감염, endofree® 플라스미드 맥시 키트는 Qiagen(Valencia, CA 91355, USA)에서 구입했습니다. 1차 PAK1-항체, 비오틴화된 2차 항체, signalfireTM ECL 시약은 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)에서 구입했습니다. Kinase Glo 시약 및 ATP(ATP{5}}Glo 키나제 키트)는 Promega(Madison, Wisconsin, USA)에서 구입했습니다. Lipofectamine 및 JM109 컴피턴트 세포는 Invitrogen 및 Life Technology에서 구입했습니다. AG1295 및 AG1478은 Calbiochem(San Diego, CA, USA)에서 구입했습니다. 인간 PDGF-bb를 포함한 다른 모든 화학 물질은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다.
2.2. 마우스 PAK{5}특이적 shRNA를 사용한 안정적인 형질감염에 의한 마우스 멜라닌 세포(B16F10)의 PAK1 유전자 침묵
2.2.1. 세포 배양
B16F10 흑색종 세포는 5% CO2를 포함하는 가습 분위기에서 37도에서 10% 열 활성화 FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(10,{6}} U/mL 및 100 µg/mL)이 보충된 DMEM에서 배양되었습니다.
2.2.2. 마우스 PAK1-특정 shRNA를 사용한 안정적인 형질감염
B16F10 세포주의 ShRNA 형질감염은 기본적으로 이전에 설명한 것과 동일한 절차(9)를 통해 수행되었지만 마우스 PAK{3}}특정 shRNA(# KM04553, Qiagen)를 사용했습니다. 다음 4개의 shRNA 클론이 형질감염에 사용되었습니다: 클론 1(CCAGAGAAGTTGTCAGCTATT), 클론 2(CATCAAGAGTGACAATATTCT), 클론 3(GTACACACGGTTCGAGAGAAT), 클론 4(GTACCACCAGTGTCAGAAGAT) 및 shCONTROL 비표적화 shRNA로서 음성 대조군(GTACCACCAGTGTCAGAAGAT) . 그러나 이 연구에서 클론 1과 2는 이 멜라닌 세포주에서 마우스 PAK1 유전자를 억제하는 데 클론 3과 4보다 더 효과적인 것으로 나타났습니다(데이터는 표시되지 않음). 안정적인 형질전환체는 형질전환되지 않은 세포의 99% 이상을 죽이는 G418(1 mg/mL)의 존재 하에 선택되었습니다.
2.2.3. PAK1 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석 및 형질감염체에서 PAK1의 키나제 활성에 대한 시험관내 분석
2.2.3.1. 웨스턴 블롯 분석
대조군(WT) 세포주와 PAK1-침묵형 형질감염체(G418-저항성) 모두에서 극도로 낮은 수준의 PAK1을 정량화하기 위해 "비특이적 잡음" 수준을 최소화하여 웨스턴 PAK1(#2062, Cell Signaling Technology)에 대한 토끼 다클론항체를 1차 항체로 사용한 블롯 분석. 간단히 말해서, 각 클론을 6웰 플레이트에 2 x 105 cells/well의 농도로 파종하고 48시간 동안 전배양하고 세포 용해물을 25 μL의 SDS-PAGE 완충액에서 5분 동안 끓였습니다. 슬롯당 각 상청액 8μL(총 단백질 15μg 포함)을 SDS-PAGE에 사용했습니다. 니트로셀룰로스를 항-PAK1 IgG(1:1, 1차 항체로 희석)로 블로팅하고, 이차 항체로서 HRP-연결된 항-토끼 IgG 및 항-비오틴 IgG(#7074, # 7075, Cell Signaling)은 PAK1 및 -액틴 밴드를 모두 검출하는 데 사용되었으며, 이는 Amersham의 ECL 시스템으로 최종적으로 시각화되었습니다. 웨스턴 블롯 분석은 세 가지 독립적인 실험을 대표합니다.
2.2.3.2. 흑색종 세포에서 PAK1에 대한 "Macaroni-Western"(IP- ATP_Glo) 키나제 분석
WT 멜라닌 세포 및 shRNA 형질감염체(SH)에서 PAK1의 키나제 활성은 이탈리아 그룹(1{39 }}). 간단히 말해서, B16F10 흑색종 세포주(WT 또는 SH, 2 × 105 cells/mL)를 웰 플레이트에서 24시간 동안 사전 배양했습니다. 그런 다음 세포를 100nM -MSH 또는 100μM IBMX로 48시간 동안 처리했습니다. 세포는 50mM Tris HCl pH 7.5 및 150mM NaCl 및 1% Triton-X를 함유하는 용해 완충액에 의해 파괴되었습니다. PAK1의 면역침전(IP)을 위해, 제거된 세포 용해물을 항-PAK1 IgG(1:50 희석) 및 단백질 A-아가로스 비드와 함께 1-2시간 동안 저온실에서 로터리 믹서로 계속 진탕하면서 인큐베이션했습니다. (일본 도쿄도 스기나미구 닛신). 각각의 lysate로부터 생성된 IP(PAK1)를 ATP와 MBP(myelin basic protein)의 존재하에서 ATP Glo kinase assay kit(Promega)와 함께 37도에서 1시간 동안 인큐베이션하고 ATP- 의존성 루시페린-루시페라제 반응은 결국 발광을 생성합니다(10). 최종 현탁액을 원심분리하고 상층액을 판독을 위해 96-웰 플레이트로 옮겼습니다. 발광은 웰당 0.5초의 통합 시간으로 MTP{37}Lab 마이크로플레이트 판독기(Corona, Hitachinaka-ku, Ibaraki, Japan)에 의해 기록되었습니다.
2.3. 형질감염체의 멜라닌 함량 및 티로시나아제 활성 측정
2.3.1. 멜라닌 함량 측정
멜라닌 함량은 이전에 설명한 대로 결정되었습니다(11). 간단히 말해서, B16F10 세포(야생형 또는 PAK1-특이적 shRNA 형질감염체)를 24-웰 플레이트에 2 × 104세포/웰의 밀도로 플레이팅했습니다. 24시간 배양 후, 100 µM isobutyl{10}methylxanthine(IBMX) 또는 100 nM -MSH를 첨가하고 37도에서 추가로 72시간 동안 배양했습니다. 세포를 인산염 완충액으로 2회 세척한 후 1M NaOH 및 10% DMSO를 포함하는 용액 500μL로 용해하고 80도에서 1시간 동안 배양하여 멜라닌을 가용화시키고 490nm에서 멜라닌 함량을 측정하였다. 야생형 세포와 형질감염된 세포의 멜라닌 함량을 비교하기 위해 야생형 멜라닌 세포에서 생성되는 총 멜라닌 양을 대조군(100%)으로 간주하고 이에 따라 형질전환체의 멜라닌 함량을 계산하였다.
2.3.2. 세포내 티로시나제 활성 분석
티로시나제활동은 약간 수정하여 이전에 설명한 대로 결정되었습니다(12). B16F10 세포(야생형 또는 형질감염체)를 2 x 104 cells/well의 밀도로 플레이팅하고, 24시간 배양 후 100μM IBMX 또는 100nM -MSH를 첨가하고 37도에서 추가로 72시간 동안 배양하였다. . 그런 다음 세포를 얼음처럼 차가운 인산 완충액으로 세척하고 1% Triton-X(500μL/웰)를 포함하는 인산 완충액(pH 6.8)으로 용해했습니다. 플레이트를 -80도에서 30분 동안 동결시켰다. 해동 후 1% L-DOPA 100μL를 각 웰에 첨가했습니다. 37도에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 흡광도는 490 nm에서 측정되었습니다.
2.4. -MSH 처리 후 멜라닌 세포를 과발현하는 PAK1-와 야생형의 멜라닌 함량 측정
Myc 벡터(2μg)를 사용하여 멜라닌 세포(B16F10)를 T423E 돌연변이를 갖는 야생형(WT) PAK1 또는 소위 "구성적으로 활성화된"(CA) PAK1으로 일시적으로 형질감염시켰다. 배양 3일 후, 각각의 형질감염된 클론을 추가 실험을 위해 수확하였다. PAK{9}}과발현이 멜라닌 함량에 미치는 영향은 앞에서 설명한 것과 동일한 절차를 통해 측정되었습니다(8). 간단히 말해서, 야생형 PAK1 또는 그 CA 돌연변이를 발현하는 야생형 또는 PAK 과발현인 멜라닌 세포를 3일 동안 100nM -MSH와 함께 배양했습니다. 1M NaOH와 20% DMSO가 포함된 용액으로 세포를 용해하여 멜라닌을 용해시키고 405nm에서 그 함량을 측정하였다.
2.5. 무혈청 배지에서의 멜라닌 생성
B16F10 세포(야생형 또는 PAK{3}}특이 shRNA 형질감염체)를 10% FBS가 있는 24-웰 플레이트에 2 × 104cells/well의 밀도로 플레이팅했습니다. 24시간 배양 후 배양액을 무혈청 배지로 교체하고 100μM IBMX 또는 100nM -MSH 유무에 관계없이 추가로 72시간 동안 배양하여 멜라닌 함량을 측정하였다.
2.6. 혈청 의존성 멜라닌 생성에 대한 PDGF/EGF 수용체 억제제의 효과
2 × 104 B16F10 세포를 10% FBS 함유 배지에서 24시간 동안 각 웰에 파종한 다음, 100nM -MSH를 함유한 새로운 배지에서 추가로 72시간 동안 배양하고 다음과 같이 하였다: (1) 무혈청, (2) 10% FBS 단독, (3) 10% FBS + 2μM AG1295(PDGF 수용체 억제제), (4) 10% FBS + 400nM AG1478(EGF 수용체 억제제)로 멜라닌 함량을 측정합니다.
2.7. 통계 분석
데이터는 표준 오차가 있는 평균값으로 표현됩니다. 통계적 비교는 일원 ANOVA에 이어 Duncan의 다중 범위 테스트에 의해 수행되었습니다. 통계 분석은 SAS(release 9.2; SAS Institute, Cary, NC, USA)를 사용하여 수행되었으며 p 0.05 이하가 유의한 것으로 간주되었습니다.
마카 인삼 시스탄체
3. 결과
3.1. 멜라닌 생성 호르몬에 의한 흑색종 세포주(B16F10)에서 PAK1의 활성화
두 가지 멜라닌 생성 호르몬, -MSH(멜라닌 세포 자극 호르몬) 및 IBMX(3-이소부틸-1-메틸 크산틴)는 종종멜라닌 생성흑색종 세포주 B16F10과 같은 멜라닌 세포에서. 따라서 우리는 PAK1의 단백질 수준이 PAK2 및 PAK4의 단백질 수준에 비해 매우 낮지만 이 호르몬이 이 세포주에서 PAK1을 활성화할 수 있는지 먼저 조사했습니다(8). 세포에서 PAK1의 키나제 활성 변화를 모니터링하기 위해 우리는 최근 세포에서 PAK1의 면역 침전(IP)을 결합하여 "Macaroni-Western"(IP ATP-Glo) 키나제 분석 프로토콜이라는 고감도/특이 키나제 분석을 개발했습니다. 용해물 및 Promega의 ATP{12}}Glo 키나제 키트(5). 이 키나제 분석을 사용하여 -MSH(100nM)와 IBMX(100μM)가 모두 흑색종 세포에서 PAK1을 활성화하며 -MSH는 IBMX보다 더 강력하다는 것을 발견했습니다(그림 1 참조). 그러나 여기에 표시된 PAK1의 배수 활성화는 명백할 뿐이라는 점을 독자들에게 상기시켜야 합니다. 왜냐하면 이러한 멜라닌 생성 호르몬 없이 수행되는 이 시간 소모적인 시험관 IP 및 키나제 분석(총 3시간 이상) 동안 PAK1은 점진적으로 정상화되기 때문입니다. 시각. 다시 말해, 이러한 자극제로 처리된 세포 배양이 끝날 때 PAK1의 정확한 키나제 상태를 동결할 수 없으며, 접힘 활성화는 이러한 시뮬레이터에 의한 세포 배양 중에 발생한 PAK1 활성화의 과소 평가된 반영일 뿐입니다.
3.2. 마우스 흑색종 세포주에서 shRNA에 의한 PAK1 유전자의 침묵
PAK1이멜라닌 생성피부 세포(멜라닌 세포)에서 흑색종 세포주 B16F10을 마우스 PAK{2}}특이 shRNA로 안정적으로 형질감염시켜 PAK1 유전자를 선택적으로 침묵시켰습니다.
3.2.1. 멜라닌 세포에서 PAK1 유전자 억제
예비 웨스턴 블롯 분석에 따르면 두 개의 별개의 PAK{0}}침묵 클론(SH1 및 2)에서 PAK1 단백질 수준이 상당히(약 75%) 감소했지만 이 흑색종 세포주 자체의 성장률은 그렇지 않았습니다. PAK1 사일런싱에 의해 크게 영향을 받습니다(데이터는 표시되지 않음). 그러나, 이 웨스턴 블롯을 스캔하여 PAK1 단백질 수준의 정확한 정량화는 다소 어려웠습니다. 주로 PAK1 밴드 주변의 높은 배경 잡음으로 인해 극히 낮은 발현 수준을 시각화하기 위한 노력 때문이었습니다. 대신 "Macaroni-Western" 키나제 분석(5,10)을 사용하여 SH1 및 2 클론 모두에서 PAK1의 키나제 활성이 대조군(WT) 세포의 키나제 활성의 약 25-30%임을 확인했습니다( 그림 2A 참조).
3.2.2. PAK1 유전자를 억제하여 멜라닌 생성 감소
우리의 다음 중요한 질문은 PAK1의 키나제 활성 감소가멜라닌 생성. 따라서, 이들 클론(SH1 및 2)의 멜라닌 함량을 72시간 동안 멜라닌 생성 유도제인 -MSH로 처리한 후 야생형(WT) 흑색종 세포와 비교하였다. 그림 2B에서 볼 수 있듯이 이러한 PAK{6}}결핍 멜라닌 세포(SH1 및 2)의 멜라닌 함량은 약 50%({10}}%) 감소하여 멜라닌 생성 호르몬이 없는 WT의 기본 수준에 도달합니다. 이러한 멜라닌 함량 감소가 티로시나아제 활성 억제와 관련이 있는지 알아보기 위해티로시나제WT와 비교하여 PAK{0}결핍 세포(클론 SH1 및 2)에서의 활성. 그림 2C에서 볼 수 있듯이 PAK1-결핍 세포의 티로시나제 활성은 WT의 약 45%(33-58%)에 불과하며 다시 기본(비자극) 수준에 도달하여 다음을 분명히 나타냅니다. PAK1은 -MSH에 의한 멜라닌 생성에 필수적입니다.티로시나제멜라닌 세포에서. 또한, 매우 유사한 방식으로 이 흑색종 세포주에서 PAK1 유전자를 억제함으로써 IBMX 유도 멜라닌 생성도 감소되었습니다(데이터는 표시되지 않음). 그러나 다음 두 가지 요소를 고려하면 절반 정도만멜라닌 생성멜라닌 세포에서 PAK{0}}의존적이며 나머지(대부분 '기본')는 PAK{1}}의존적입니다. (i) PAK4는 멜라닌 세포에서 -MSH 유도 멜라닌 생성에도 필수적이며(8) (ii) PAK1 유전자의 약 25%가 이러한 형질감염체(SH1 및 2)에서 여전히 발현되는 것으로 보입니다. 그러나 PAK1이 호르몬 유도성 또는 기초멜라닌 생성.
또한, 우리는 내인성 PAK1이 이 흑색종 세포주에서 IBMX 및 -MSH와 같은 멜라닌 생성 유도제에 의해 유의하게 활성화되지만(그림 1 참조), 항-pPAK1에 의해 판단되는 Thr 423에서의 자가인산화에는 큰 변화가 없음을 확인했습니다. 항체(데이터는 표시되지 않음).
3.3. 과발현된 PAK1에 의한 -MSH-유도성 멜라닌 생성 증가
형질감염에 의해 멜라닌 세포(B16F10 세포주)에서 야생형(WT) PAK1 유전자의 과발현에 의해, 우리는 외인성으로 추가된 PAK1 유전자가 -MSH-유도성 멜라닌 수준을 몇 배 증가시키는 것으로 밝혀졌습니다(그림 3의 왼쪽 참조, 비교 레인 2와 4), 독립적인 "기저" 멜라닌 수준 자체에는 거의 영향을 미치지 않는 반면(그림 3의 왼쪽 패널에서 레인 1과 3 비교), 이는 PAK1이 주로 -MSH/IBMX 의존성에 기여함을 시사합니다.멜라닌 생성, 그리고 외인성 자극제가 없는 기저 멜라닌 생성은 아닙니다.
3.4. -MSH/IBMX-유도성 멜라닌 생성에 대한 혈청 효과
더 흥미롭게도, 우리는 -MSH/IBMX에 의한 멜라닌 생성의 유도가 PAK1 외에 10% FBS(소 태아 혈청)를 필요로 한다는 것을 발견했습니다. 도 4A에 나타낸 바와 같이, 무혈청 배지에서 -MSH 또는 IBMX는 거의 유도되지 않았다.멜라닌 생성WT 세포에서 10% FBS 단독(-MSH/IBMX 제외)이멜라닌 생성크게(약 60%). 흥미롭게도 혈청의 존재 여부에 관계없이 SH 형질감염체(PAK{1}}결핍 세포)의 멜라닌 생성은 혈청이 없는 WT 세포의 멜라닌 생성과 동일한 수준이었으며(그림 4B 참조), 이는 혈청 의존적 멜라닌 생성을 시사합니다. PAK1도 필요합니다. 이 개념을 뒷받침하기 위해 혈청 단독은 WT 세포에서 PAK1의 키나제 활성을 유의하게 활성화하지만 WT 세포에서 PAK1의 -MSH 의존적 활성화에는 혈청이 필요합니다(그림 4C 참조).
단독으로 PAK1을 활성화하는 멜라닌 생성 혈청 인자의 화학적 성질과 관련하여 우리는 다음과 같은 이유로 PDGF(혈소판 유래 성장 인자)라고 추측합니다. PDGF 수용체에 의한 EGF(표피 성장 인자) 수용체의 transactivation을 통해 PAK1을 활성화하는 혈청(13,14), 매우 최근에 다른 사람들은 PDGF 또는 EGF 단독으로 실제로 자극을 촉진한다는 것을 입증했습니다.멜라닌 생성멜라닌 세포 (15,16).
3.5. 혈청/PDGF 의존성 멜라닌 생성에는 EGF 수용체가 필요합니다
이 멜라닌 생성 혈청 인자의 특정 화학적 특성을 확인하기 위해 AG1295(PDGF 수용체에 특이적인 억제제) 또는 AG1478(EGF 수용체에 대해 특이적인 억제제)이 혈청 의존성에 미치는 영향을 테스트했습니다.멜라닌 생성멜라닌 세포에서. 그림 5에서 볼 수 있듯이 2μM AG1295 또는 400nM AG1478은 혈청 의존성멜라닌 생성기본(무혈청) 멜라닌 생성과 동등한 수준으로. PDGF는 혈청에 풍부하게 존재하지만 EGF가 아니며 AG1295는 EGF 수용체를 억제하지 않는 반면 AG1478은 PDGF 수용체를 억제하지 않기 때문에(13), 혈청의 PDGF가 수용체를 활성화하고 차례로 EGF 수용체를 트랜스-활성화할 가능성이 가장 높습니다. 결국 혈청 의존성 멜라닌 생성에 필수적인 PAK1을 활성화합니다(자세한 내용은 그림 6 참조). 이 가정을 바탕으로 PAK1의 활성화를 위한 -MSH와 혈청/PDGF 간의 명백한 시너지 효과를 뒷받침하는 가장 가능성 있는 메커니즘을 나중에 논의하여 강력한 멜라닌 생성을 유도합니다.
마지막으로, -MSH가 없는 "기저" 멜라닌 함량은 T423E 돌연변이를 보유하는 PAK1의 과발현된 CA(구성 활성) 돌연변이에 의해 크게 변하지 않았다는 점을 지적할 가치가 있습니다(그림 3의 왼쪽 패널, 레인 5 참조). DN(우성 음성) 또는 비활성 돌연변이인 경우. 사실, -MSH는 Thr 423에서 WT PAK1의 인산화를 전혀 유도하지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 따라서 Thr 423에서 PAK1의 자가 인산화는 PAK1의 -MSH 유도 활성화와 아무 관련이 없다는 결론을 내릴 수 있으며, 이는 강력한멜라닌 생성흑색종 세포에서. PAK1의 T423E 돌연변이는 발암성이 높은 것으로 잘 알려져 있기 때문에(6), 아마도 Thr 423에서의 자가 인산화는 "멜라닌 생성"에서 "발암성" 신호전달로의 전환을 제공할 수 있습니다.
4. 토론
멜라닌 세포/흑색종 세포에서 PAK{0}}의존성 및 PAK{1}}의존성 멜라닌 생성에 대한 관찰 결과, 지적해야 할 두 가지 잠재적으로 흥미로운 문제가 있습니다. (i) PAK1의 '특정' 멜라닌 생성 활성( 미세하게 발현됨)은 흑색종 세포에서 PAK4(고발현)보다 훨씬 높아야 합니다. (ii) PAK1은 주로 혈청 유도 멜라닌 생성을 담당하는 반면 PAK4는 주로 내인성(기저) 멜라닌 생성을 담당하는 것으로 보입니다.멜라닌 생성. 즉, PAK{0}결핍은 생쥐에서 태어날 때 치명적이지만 PAK{1}}결핍만으로는 '알비노' 생쥐를 생성하지 못하지만 원래 피부색(기본멜라닌 생성) 예를 들어 흑인과 백인 사이의 차이는 PAK4 발현 수준의 차이와 멜라닌 생성 수준의 차이를 적어도 부분적으로 반영할 수 있습니다.티로시나제s.
생체 내에서 HRM{0}}(색소가 있지만 털이 없는) 마우스를 사용하여 최근에 10μM PF3758309(PAK1/PAK{4}}억제제)를 함유한 크림이 피부의 UV 유도 멜라닌 생성을 감소시키는 것으로 나타났습니다. PAK4 또는 PAK1이 멜라닌 생성의 UV 유도에 책임이 있는지 여부는 아직 명확하지 않지만 기초 수준입니다(8). PAK1은 유도성 멜라닌 생성을 담당하지만 기저 멜라닌 생성은 담당하지 않기 때문에 PAK1이 UV 유도성에 크게 기여하는지 테스트할 가치가 있습니다.멜라닌 생성(sun tanning) 뿐만 아니라, 검은 머리카락과 눈을 가지고 있는 쥐의 C57B16 균주에서 파생된 희귀 PAK1 KO(knock out) 돌연변이를 사용하여(Hong He et al., 미공개 관찰), 다양한 허브 PAK1인지 이해하기 위한 시도 화장품의 차단제는 자외선 차단제에 유용합니다. 흥미롭게도 PAK1은 UV 조사 및 기타 DNA 손상 인자에 의해 활성화되는 것으로 보고되었습니다(17).
-MSH는 Tyr 키나제 JAK2(18)를 활성화하고, 이는 차례로 Tyr 285(Thr 423 대신)에서의 인산화에 의해 PAK1을 활성화하여 PIX-PAK1 상호작용을 유도하는 것으로 나타났습니다(19). 이것은 PAK1의 -MSH 의존적 활성화와 멜라닌 생성이 Thr 423에서 PAK1의 자가인산화를 포함하지 않는 이유를 설명할 수 있습니다. 따라서 우리는 최근에 PAK 의존적 멜라닌 생성이 강력한 허브 JAK에 의해 차단되는지 조사했습니다.{14} JAK2(20)를 직접 억제하는 비터멜론(Goya)의 cucurbitacin I(CBI)이라고 불리는 억제제, 그리고 CBI가멜라닌 생성멜라닌 생성 호르몬이 70% 이상 존재하는 경우 CBI가 PAK1뿐만 아니라 PAK4도 차단할 가능성이 있음을 시사합니다(5). 이러한 맥락에서 CAPE, curcumin, shikonin 및 FTY 720과 같은 약초 PAK{4}}차단제가 마우스 또는 인간 피부 세포의 -MSH 유도 멜라닌 생성을 억제할 수 있다는 점은 매우 흥미로울 것입니다. PAK1이 거의 완전히 차단된 농도에서도 50%(1,2), PAK1과 PAK4를 모두 억제하는 합성 pan-PAK-차단제 PF3758309는멜라닌 생성300nM에서 피부 세포에서 약 90%까지(8). 즉, 멜라닌 세포의 -MSH 유도 멜라닌 생성 시스템은 PAK{5}}특정 차단제를 범 PAK 차단제와 구별할 수 있습니다. 지금까지 약초 PAK4-특정 차단제(PAK4-특정 siRNA 제외)는 확인되지 않았습니다. 그러나 아마존 정글에서 자란 쓴 나무에서 추출한 글라우카루비논이라는 매우 강력한 쿼시노이드는 최근 PAK1과 PAK4를 모두 차단하여 시험관 내 및 생체 내에서 췌장암 세포의 성장을 억제하는 것으로 나타났습니다(21). 따라서 이 허브 PAK-차단제가 PF3758309와 마찬가지로 피부 세포의 멜라닌 생성을 거의 완전히 억제하는지 테스트하는 것이 매우 흥미로울 것입니다.
이 연구의 주요 목표는 PAK1의 특정 멜라닌 생성 역할에 초점을 맞추고 PAK1이 멜라닌 생성 효소 및 MTF를 포함한 멜라닌 생성 신호 경로를 활성화하는 방법을 자세히 조사하지 않는 것입니다. 그러나 PAK1은 Ser 675에서 인산화하여 베타-카테닌을 직접 활성화하여티로시나제(티르).
최근에 우리는 PAK4(CDC{1}}의존성 키나제 4)가멜라닌 생성MIFT 활성화에 필수적인 2개의 전사 인자인 CREB와 베타-카테닌을 활성화하여 동일한 흑색종 세포주를 제거합니다(8). CREB는 베타-카테닌과 같은 LIM 키나제(22,23)에 의해 활성화되는 것으로 알려져 있으며, 이는 PAK1과 PAK4(6,18) 모두의 일반적인 직접 기질 중 하나이므로 PAK1과 PAK4가 동일한 CREB를 공유할 가능성이 가장 높습니다. /beta-catenin-MITF 신호 전달 경로는 멜라닌 생성 효소 유전자를 활성화합니다.
그러나 PAK1의 -MSH/IBMX 의존적 활성화로 이어지는 상세한 신호 경로는 PAK4의 활성화로 이끄는 것과 크게 다를 수 있는데, 주로 전자가 혈청 인자(PDGF)를 포함하기 때문입니다. 혈청만으로도 PAK1(13)을 활성화할 수 있고 PAK1의 -MSH/IBMX 의존적 활성화도 촉진합니다. 즉, PAK1 활성화 및멜라닌 생성.
다음은 이 시너지가 어떻게 일어날 수 있는지에 대한 우리의 작업 가설입니다. PAK1 활성화로 이어지는 주요 신호 경로는 발암성 EGFR(표피 성장 인자 수용체)-RAS-PI 3 키나제-RAC/CDC{5}}PAK1 캐스케이드입니다. 그러나 이 캐스케이드만으로는 전체 활성화에 충분하지 않습니다. PAK18이라는 18개 아미노산의 Pro-rich 모티프를 통해 PAK1에 직접 결합하는 SH3 어댑터 단백질인 PIX라는 또 다른 인자가 필요합니다. PIX-PAK1 상호작용에는 Tyr 285에서 PAK1을 인산화하는 Tyr-키나제인 JAK2라는 세 번째 단백질이 필요합니다. RAS는 프로락틴을 통해 JAK2를 상향 조절합니다. 우리와 다른 사람들(13-16)의 몇 가지 이전 연구 결과에 따르면 PDGF(혈소판 유래 성장 인자)는 -MSH/IBMX 유도에 필수적인 주요 멜라닌 생성 혈청 인자입니다.멜라닌 생성, 수용체(PDGFR) Tyr-키나제를 활성화하여 EGFR(표피 성장 인자 수용체=ErbB1) Tyr-키나제를 차례로 활성화하여 발암성 RAS-PI3 키나제-RAC를 통해 PAK1을 활성화합니다. /CDC42 경로(13). 따라서 혈청 내 PDGF 단독으로 PAK1을 활성화하고 멜라닌 생성을 중간까지 유도할 수 있습니다. 그러나 PAK{12}}의존성 멜라닌 생성의 완전한 활성화를 위해 -MSH/IBMX는 궁극적으로 PIX-PAK1 상호작용을 보호하는 cAMP 의존성 경로(PKA가 포함될 수 있음)를 통해 JAK2를 활성화하는 데 필요합니다(자세한 내용은 그림 6 참조).
결론적으로, 여기에서는 화장품 크림에 들어 있는 CAPE, 커큐민, 시코닌과 같은 다양한 허브 PAK{0}차단제가 "피부 미백" 효과. 인간 멜라닌 세포에 대한 일련의 유사한 연구가 추가 증거 또는 확인을 기다리고 있습니다.
마카 인삼 시스탄체
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