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X-연결 후생유전 조절자 UTX는 NK 세포 고유의 성 차이를 조절합니다

Dec 27, 2023

바이러스 감염 결과는 성별에 따라 다르며 일반적으로 남성이 여성보다 감염되기 쉽습니다. 역설적이게도 남성의 경우 항바이러스 자연살해세포(NK)의 수가 증가합니다. 우리는 수컷 생쥐에서 NK 세포의 수가 증가하는 반면 생쥐와 인간의 암컷에 비해 이펙터 기능이 감소함을 보여줍니다. 이러한 차이는 생식선 절제된 생쥐에서도 지속되었기 때문에 생식선 호르몬에만 의존하는 것이 아닙니다. X 불활성화를 피하는 후생적 조절자인 Kdm6a(UTX 단백질을 암호화함)는 수컷 NK 세포에서 더 낮았지만, 암컷 쥐의 NK 세포 고유 UTX 결핍은 NK 세포 수를 증가시키고 효과기 반응을 감소시켰습니다. 또한, NK 세포 고유의 UTX 결핍증이 있는 생쥐는 생쥐 거대세포 바이러스에 대한 치사율이 증가한 것으로 나타났습니다. 통합 다중 오믹스 분석을 통해 염색질 접근성과 NK 세포 항상성 및 효과기 기능에 중요한 유전자 발현을 조절하는 데 있어 UTX의 중요한 역할이 밝혀졌습니다. 종합적으로, 이러한 데이터는 UTX가 NK 세포의 성차를 결정하는 중요한 분자 결정 요인임을 암시합니다.

진화적으로 보존된 성차는 선천성 면역 반응과 적응성 면역 반응 모두에 존재합니다1,2. 남성은 자가면역에 덜 취약하지만, 여성보다 덜 강력한 항바이러스 면역 반응을 나타냅니다. 예를 들어, 남성은 감염 후 인간 거대세포 바이러스(HCMV) 부담이 더 높으며, 이는 바이러스 위협에 대한 감수성이 증가했음을 시사합니다4. 이는 최근 코로나바이러스 질병 2019(COVID{4}}) 팬데믹 중에도 나타났는데, 여기서 심각한 질병에 대한 강한 남성 편견은 면역 반응의 성별 차이를 반영하는 것으로 가정되었습니다5. 인간과 생쥐를 대상으로 한 여러 연구에서 최근 남성과 여성의 면역 세포 분포 및/또는 기능의 차이가 보고되었습니다6,7. 그러나 이러한 차이에 대한 분자적 기반과 이러한 차이가 질병 결과에 영향을 미치는 메커니즘은 여전히 ​​잘 이해되지 않고 있습니다. 포유류의 성별 차이는 다양한 생식선 호르몬뿐만 아니라 성염색체 용량에 의해서도 정의됩니다1. 예를 들어, X-연관 유전자 하위 집합의 발현은 남성(XY)보다 여성(XX)에서 더 높습니다8. 암컷은 성별 간에 비슷한 수준의 X 연결 단백질 발현을 유지하기 위해 무작위 X 염색체 불활성화(XCI)를 겪는 반면, XCI는 불완전하여 생쥐에서는 X 염색체 유전자의 3~7%가 불활성화를 피하고 쥐에서는 20~30%가 불활성화를 피합니다. 인간8,9. 따라서 여성과 남성의 X-연관 유전자 발현 수준의 차등은 신경관 결손10 및 자가면역 질환11,12을 포함한 광범위한 질환의 성별 차이와 연관되어 있습니다. 순환하는 1형 선천 림프구인 NK 세포는 헤르페스바이러스 계열 구성원에 대한 초기 방어선 역할을 합니다13. 항바이러스 면역에서 NK 세포의 중요성은 HCMV 및 Epstein-Barr 바이러스와 같은 헤르페스 바이러스에 의한 감염에 매우 민감한 NK 세포 수 또는 기능에 결함이 있는 환자에게서 설명됩니다. 생쥐에서 NK 세포는 생쥐 거대세포 바이러스(MCMV) 및 기타 바이러스 감염을 제어하는 ​​데 필요합니다15. NK 세포 기능에 유전적 결핍이 있거나 NK 세포 수의 손실이 있는 생쥐는 MCMV 감염 후 바이러스 역가와 사망률이 크게 증가합니다. 따라서 NK 세포는 생쥐와 인간 모두에서 항바이러스 면역에 매우 중요합니다.

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NK 세포의 강력한 항바이러스 기능을 고려할 때, 바이러스에 민감한 남성이 더 많은 수의 NK 세포를 표시한다는 것은 예상치 못한 일이었습니다6,7. NK 세포 수 외에도 이전에 인식되지 않았던 다른 성적으로 이형적인 NK 세포 특징이 바이러스 감염 중 성별 차이를 대신 설명할 수 있습니다. 우리는 남성 NK 세포가 생쥐에서 향상된 세포 적합성을 나타내는 반면, 생쥐와 인간에서는 감소된 이펙터 기능을 보여줍니다. NK 세포 구성 및 기능에 대한 이러한 성 편견은 생식선 절제술을 받은 생쥐에서도 지속되었기 때문에 완전히 호르몬 차이로 인한 것은 아닙니다. 차등 발현 스크리닝을 통해 우리는 X-연결된 후성유전 조절 인자와 알려진 XCI 탈출자 UTX를 확인했는데, 이는 마우스와 인간 남성 NK 세포 모두에서 상당히 낮은 수준으로 발현되었습니다. UTX는 여성 NK 세포의 UTX 반수체 결핍이 사이토카인 생산과 세포 독성을 손상시키면서 NK 세포 수를 증가시키는 데 충분했기 때문에 용량 의존적으로 NK 세포 적합성과 이펙터 기능을 모두 조절했습니다. 여성 UTX가 결핍된 NK 세포는 생체 내에서 향상된 지속성과 생체 외 세포 사멸에 대한 저항성을 나타냈을 뿐만 아니라 MCMV 감염에 대한 감수성도 증가했습니다. NK 세포 수와 인터페론(IFN) 생산이 '탈메틸화효소가 죽은' UTX 돌연변이를 발현하는 쥐에서 변하지 않았기 때문에 이러한 효과는 UTX의 내재적 탈메틸화효소 활성과 무관했습니다. 야생형(WT)과 UTX-의 시퀀싱(ATAC-seq), 벌크 RNA 시퀀싱(RNA-seq), anti-UTX CUT&Tag(Cleavage Under Targets and Tagmentation Assay)를 이용한 전이효소 접근 염색질 분석을 이용한 통합 분석 결핍된 NK 세포는 NK 세포 적합성과 효과기 반응에 관여하는 유전자좌의 발현을 조절하는 데 있어 UTX의 중요한 역할을 밝혀냈습니다. 우리의 연구 결과는 UTX가 유전자 발현의 데메틸라제 독립적 조절을 통해 NK 세포 항상성과 이펙터 기능의 성차의 주요 동인임을 확인했습니다.

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결과

NK 성적 이형성은 생식선 성호르몬과 무관합니다

C57BL/6 마우스의 비장을 조사한 최근 조사에서는 암컷에 비해 수컷에서 NK 세포 수가 증가한 것으로 보고되었습니다. 이러한 데이터와 일치하여 우리는 비장 NK 세포 (CD3- TCR - NK1.1+; 확장 데이터 그림 1a로 식별됨)의 빈도 (그림 1a, b)와 절대 수치 (그림 1c)가 증가하는 것을 관찰했습니다. ) 암컷과 비교하여 수컷 C57BL/6 마우스에서. 이러한 발견은 NK 세포 수를 넘어서는 다른 성적으로 이형성 특징이 남성의 바이러스 감염에 대한 감수성 증가를 설명할 수 있음을 시사합니다. 바이러스 감염에 반응하여 NK 세포는 전염증성 사이토카인, 특히 IFN- 20-22의 조기 생산에 중요합니다. NK 세포 고유 기능에 성별 차이가 있는지 테스트하기 위해 우리는 생체 외 암컷과 수컷 쥐에서 분리한 NK 세포의 이펙터 사이토카인 생산을 비교했습니다. 전염증성 사이토카인인 인터루킨(IL)-12 및 IL-15을 자극하면 남성 NK 세포의 IFN-생산이 낮아졌습니다(그림 1d,e 및 확장 데이터 그림 1b). IL-12 및 IL-18(확장 데이터 그림 1c,d)에 대한 반응에서도 유사한 결과가 관찰되었으며, 이는 사이토카인 자극에 대한 남성 NK 세포 반응성에 각각의 결함이 있음을 나타냅니다. 또한, IL-12 및 K562 백혈병 세포로 활성화된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 분리된 인간 NK 세포(TCR − CD3− CD56+ )는 IFN- +의 비율이 더 낮았습니다. 남성 대 여성 NK 세포의 (그림 1f 및 확장 데이터 그림 1e) 및 IFN- 평균 형광 강도 (MFI, 그림 1g). 따라서 NK 세포 수가 증가하더라도 남성 NK 세포 효과기 사이토카인 생산은 바이러스 감염 중에 유도된 전염증성 사이토카인에 대한 반응으로 생쥐와 인간 모두에서 지속적으로 감소합니다.

여성 또는 남성의 성은 생식선 호르몬(예: 에스트로겐 또는 안드로겐)과 성염색체(예: 46XX 또는 46XY)의 합성을 기반으로 합니다1. 이전 연구에서는 NK 세포에 의한 IFN-생산 조절에 생식선 호르몬이 직접적인 영향을 미치는 것으로 나타났습니다23. 그러나 NK 세포 성별 차이가 세포 내재적 요인에 기인할 수도 있다는 가능성은 여전히 ​​남아 있습니다. 성호르몬 매개 효과를 확인하기 위해 우리는 성선 절제된 생쥐에서 NK 세포의 풍부함과 기능을 조사했습니다. 생식선 절제술은 NK 세포 빈도(그림 1h 및 확장 데이터 그림 1f), 절대 수치(그림 1i) 및 사이토카인 자극에 반응하는 IFN-단백질 생산(그림 1j,k 및 확장 데이터 그림 1)의 성별 차이를 제거하지 못했습니다. 1g) 이는 생식선 호르몬이 NK 세포의 성별 차이에 전적으로 책임이 없음을 나타냅니다. CD11b 및 CD27 발현에 의해 확인된 NK 세포 성숙 부분 집합은 생존 및 효과기 기능에 대한 차등적 능력을 가지고 있는 반면, WT 또는 생식샘 절제술을 받은 암컷 및 수컷 마우스에서 유래된 비장 NK 세포는 NK 세포 성숙 부분 집합의 빈도에서 유의미한 차이를 나타내지 않았습니다(확장 데이터 그림 .1h–k). 이러한 결과는 NK 세포 수와 효과기 기능에서 관찰된 성 편향이 차등적 성숙 상태로 인한 것이 아님을 나타냅니다. 따라서 우리는 성염색체 투여량이 성별 간 NK 세포의 풍부함과 기능 차이에 기여할 수 있다는 가설을 세웠습니다.

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UTX는 X 비활성화를 피하고 여성에서 더 많이 표현됩니다.

46XX 암컷은 X-연결 유전자의 투여량을 조절하기 위해 XCI를 겪는 반면, 유전자의 하위 집합은 XCI를 탈출(XCI 탈출자라고 함)하여 종종 수컷에 비해 암컷에서 더 높은 발현을 초래합니다25,26. 따라서 남성에 비해 여성의 XCI 탈출자 발현 증가는 잠재적으로 NK 세포의 성차를 중재할 수 있습니다. 인간과 생쥐에서 서로 다른 유전자가 X 불활성화를 피하는 반면, 5개의 유전자(XIST, DDX3X, KDM6A, EIF2S3, KDM5C)는 이전에 두 유전자 모두에서 XCI 탈출자로 확인되었습니다. XIST는 여성 세포에서 XCI의 역할로 알려져 있기 때문에 남성 세포에서는 발현되지 않기 때문에 추가 분석에서 제외되었습니다1. 나머지 4개의 유전자는 모두 인간(그림 2a)과 생쥐(그림 2b) 모두에서 남성 대 여성 NK 세포에서 유의하게 하향조절되었습니다. Kdm6a(UTX를 인코딩하는) 전사체 수준은 인간과 마우스 NK 세포 모두에서 가장 성적으로 이형적인 발현을 나타냈습니다(그림 2a,b). 수컷 NK 세포는 또한 생쥐의 암컷 NK 세포에 비해 낮은 UTX 단백질 수준을 나타 냈습니다 (그림 2c, d). Kdm6a 전사 수준과 UTX 단백질 수준의 이러한 차이는 성 염색체 보체(XX 또는 XY)가 분리된 성선 절제된 마우스(그림 2e-g)와 Four Core Genotypes(FCG) 마우스(확장 데이터 그림 2a) 모두에서 지속되었습니다. 생식선 성기(난소 또는 고환)28. 이러한 데이터는 Kdm6a(UTX)의 발현 수준이 NK 세포에서 성편향적이며 주로 생식선 호르몬보다는 X 염색체 용량에 의해 결정된다는 것을 나타냅니다.

UTX는 NK 세포 적합성을 억제합니다

UTX가 NK 세포에서 관찰된 성별 차이를 중재하는지 확인하기 위해 우리는 용량 의존적으로 UTX가 손실된 일련의 마우스를 생성했습니다. 먼저, 우리는 수컷에서 발현되는 UTX의 단일 복사본을 모방하기 위해 NK 세포(Kdm6afl/WT Ncr1Cre+, 이하 UTXHet로 지칭됨, 보충 데이터 표 1)에서 UTX의 이형접합성 결실을 갖는 암컷 마우스를 생성했습니다. 우리는 암컷 UTXHet와 수컷 WT(Kdm6afl/y Ncr1Cre-) 마우스 사이에서 유사한 NK 세포 UTX 단백질 발현을 확인했습니다(확장 데이터 그림 2b). 암컷 UTXHet 마우스는 수컷 WT와 비교하여 유사한 비장 NK 세포 수를 나타냈으며(그림 3a, b), 둘 다 암컷 WT에 비해 증가된 NK 세포 수를 나타냈습니다. 암컷 WT, 수컷 WT 및 암컷 UTXHet 마우스의 NK 세포 간에는 CD11b 및 CD27 발현에 의한 성숙에 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다 (확장 데이터 그림 2c). 따라서, UTX 사본 하나의 손실은 성숙과 무관한 방식으로 NK 세포 수를 증가시키기에 충분했습니다. 우리는 다음으로 UTX의 동형접합 결실(Kdm6afl/flNcr1Cre+, 이하 UTXNKD, 보충 데이터 표 1)이 있는 마우스를 생산하여 NK 세포에서 UTX의 두 사본이 모두 손실되었습니다. UTX 단백질 발현은 유세포 분석에 의해 여성 WT NK 세포에 비해 여성 UTXNKD NK 세포에서 유의하게 낮았으며(확장 데이터 그림 2b) 단일 UTX 복사본이 있는 NK 세포(즉, 남성 WT 및 여성 UTXHet)에 비해 낮았습니다. ). WT NK 세포와 비교하여 여성 UTXNKD에서 예상 크기(180 kD)의 UTX 단백질이 없다는 것이 웨스턴 블롯으로 확인되었습니다(확장 데이터 그림 2d). UTX 복사 수가 감소함에 따라 NK 세포 빈도와 절대 수는 증가했습니다 (그림 3c, d 및 확장 데이터 그림 3a). 이러한 데이터는 UTX가 NK 세포 빈도와 절대 수치를 용량 의존적으로 조절하는 것과 관련이 있습니다.

Fig. 1 | Sex differences in IFN-γ production and NK cell numbers are independent of gonadal hormones. a–c, Representative dot plots (a), frequency (b), and absolute numbers (c) of splenic NK cells (CD3− TCRβ− NK1.1+ ) in female and male C57BL/6 mice (n = 15 per group). d,e, Percentage IFN-γ+ (d) and normalized IFN-γ MFI (e) of total splenic NK cells from female versus male mice cultured with no treatment (NT) or IL-15 (50 ng ml−1) and IL-12 (20 ng ml−1) for 4 h, normalized to MFI of female IL-15/IL-12 treatment (n = 8 per group). f,g, Percentage IFN-γ+ (f) and normalized IFN-γ MFI (g) of CD3− CD56+ female (n = 6) and male (n = 7) human NK cells cultured and stimulated with 10 ng ml−1 of IL-12 for 16 h in the presence of K562 cells, normalized to MFI of female IL-12 treatment. h, i, Frequency (h) and absolute numbers (i) of splenic NK cells in gonadectomized female and male mice (n = 18 per group). j,k, Percentage IFN-γ+ (j) and normalized IFN-γ MFI (k) of total splenic NK cells isolated from gonadectomized female and male mice and cultured with NT or IL-15 (50 ng ml−1) and IL-12 (20 ng ml−1) for 4 h (n = 12 per group). Data are representative of 2–4 independent experiments. Samples were compared using a two-tailed unpaired Student's t-test and data points are presented as individual mice with the mean ± s.e.m. (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001). Specific P values are as follows: b = 0.0002; c = 0.006; d = 0.0036; e = 0.0013; f = 0.04; g = 0.03; h < 0.0001; i = 0.0006; j = 0.0234; k = 0.0019.

그림 1|IFN-생산과 NK 세포 수의 성별 차이는 생식선 호르몬과 무관합니다. a-c, 암컷 및 수컷 C57BL/6 마우스(n 그룹당 {7}}). d,e, 무처리(NT) 또는 IL{{1{47}}}로 배양된 암컷 대 수컷 마우스의 총 비장 NK 세포의 백분율 IFN- +(d) 및 표준화된 IFN-MFI(e) 4시간 동안 }(50 ng ml−1) 및 IL-12(20 ng ml−1), 여성 IL-15/IL{의 MFI로 정규화됨 {18}} 처리(그룹당 n=8). f,g, CD3− CD56+ 암컷(n=6) 및 수컷(n { {25}}) K562 세포 존재 하에서 10 ng ml-1 IL-12로 16시간 동안 배양 및 자극한 인간 NK 세포, 여성 IL의 MFI로 정규화됨-12 치료. h, i, 생식선 절제된 암컷 및 수컷 마우스(그룹당 n{32}})에서 비장 NK 세포의 빈도(h) 및 절대 수(i). j,k, 생식선 절제된 암컷 및 수컷 마우스로부터 분리하고 NT 또는 IL-15(50 ng ml- 1) 및 4시간 동안 IL-12(20ng ml−1)(그룹당 n{42}}). 데이터는 2-4개의 독립적인 실험을 나타냅니다. 샘플은 양측 unpaired Student's t-test를 사용하여 비교되었으며 데이터 포인트는 평균 ± sem(*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P)을 갖는 개별 마우스로 표시됩니다. < 0.0001). 구체적인 P 값은 다음과 같습니다. b=0.0002; c=0.006; d=0.0036; 전자=0.0013; f=0.04; g=0.03; h < 0.0001; 나는=0.0006; j=0.0234; k=0.0019.

UTXNKD 마우스(CD45.2+ )에서 증가된 NK 세포 수의 기본 메커니즘을 정의하기 위해 WT(CD45.1+ )와 혼합 골수 키메라(mBMC) 마우스의 1:1 비율이 생성되었습니다. . 재구성 6주 후, 우리는 골수 이식 후 여성 수용자(CD451x2)의 WT와 비교하여 여성 UTXNKD(CD45.2+ ) NK 세포의 현저한 경쟁 우위를 관찰했습니다(확장 데이터 그림 3b,c). NK 세포와 대조적으로, UTX의 NK 특이적 결실로 인해 충분한 UTX인 동일한 기증자(UTXNKD, CD45.2+ )의 T 세포는 원래 주입 비율(1:1; 확장 데이터 그림)을 표시했습니다. .3b,c). 이러한 데이터는 UTX가 발달 과정에서 세포 고유의 방식으로 NK 세포 수를 억제했음을 시사합니다. 이 표현형이 증식의 차이에 의해 유발되는지 여부를 테스트하기 위해 우리는 유전자형 간의 세포 수를 표준화하기 위해 4:1 비율로 주입된 WT: UTXNKD mBMC 마우스의 비장 NK 세포에서 세포 분열 마커 Ki67을 분석했습니다. 역설적이게도 UTXNKD NK 세포는 Ki67+ 세포의 빈도가 더 낮았고 IL-15에 반응하여 CFSE 희석이 덜한 것으로 나타났습니다(확장 데이터 그림 3d,e). 이러한 결과는 UTXNKD 마우스에서 관찰된 더 높은 NK 세포 수가 증식 증가로 인한 것이 아니라는 것을 시사합니다. 이러한 결과를 바탕으로 우리는 UTXNKD 마우스(그림 3c,d)에서 NK 세포의 빈도가 증가하는 것은 UTX 발현이 없을 때 NK 세포의 세포 적합도가 향상되었기 때문일 수 있다는 가설을 세웠습니다. 이 가능성을 테스트하기 위해 선천적으로 구별되는 WT(CD451x2 ) 및 UTXNKD(CD45.2+ ) 비장 NK 세포를 CTV(Cell Trace Violet)로 라벨링하고 일정 시간 내에 WT(CD45.1+ ) 수용자에게 전달했습니다. 1:1 비율(확장 데이터 그림 3f). 이동 후 7일째에 이동된 개체군은 수혜자 비장에서 UTXNKD NK 세포 쪽으로 치우쳤으며(그림 3e, f), 이는 성숙한 NK 세포 항상성의 세포 내재적 UTX 억제를 입증합니다. 이 차이는 이동 후 7일째에 두 집단 모두에 의한 CTV 희석이 최소화되었기 때문에 증식의 변화로 인한 것이 아닙니다(확장 데이터 그림 3g). UTX가 세포사멸 조절을 통해 NK 세포 항상성을 억제하는지 테스트하기 위해 IL-15 단독 또는 IL-15 및 세포사멸 유도제인 Nutlin{{42)과 함께 배양한 분류된 NK 세포에서 절단된 카스파제 3 발현을 비교했습니다. }}a29. 낮은 UTX 발현은 저용량 IL-15 및 Nutlin-3a 처리가 있는 경우 절단된 카스파제 3+ NK 세포 감소와 상관관계가 있었습니다(그림 3g,h). 더욱이, 수컷 NK 세포는 암컷 NK 세포에 비해 Nutlin-3a에 반응하여 절단된 카스파제 3+ NK 세포의 빈도가 완만하지만 유의미하게 감소한 것으로 나타났습니다. 이는 생식선 절제술을 받은 생쥐에서도 지속되었습니다(확장 데이터). 그림 3h–k). 더욱이, NK 세포의 세포사멸과 생존의 조절은 Bim(세포사멸 촉진 인자)31에 의해 길항될 수 있는 Bcl{52}}(항세포사멸 인자)30의 상대적 발현 수준에 의존합니다. UTXNKD NK 세포는 WT NK 세포와 비교하여 Bcl-2의 세포내 단백질 발현이 증가하고 Bim이 약간 증가한 것으로 나타났습니다(그림 3i,j 및 확장 데이터 그림 3l). 이로 인해 UTXNKD NK 세포에서 Bcl-2:Bim 비율이 크게 증가했습니다(그림 3k). 남성 NK 세포는 또한 Bcl-2:Bim 비율의 유의한 증가를 나타냈으며(그림 3l), 이는 생식선 절제술 후에도 지속되었습니다(그림 3m). 함께, 이러한 데이터는 변경된 UTX 수준이 Bcl-2 발현 조절을 통해 NK 세포 적합도의 성별 차이의 기초가 될 수 있음을 보여줍니다.

Fig. 2 | X-linked UTX displays sexually dimorphic gene expression independent of sex hormones.a Normalized expression of XCI escapee genes using DICE database RNA-seq data on sorted NK cells from human females (n = 36) versus males (n = 54) normalized to females. b, Normalized expression of XCI escapee genes by quantitative PCR with reverse transcription (RT–qPCR) in splenic NK cells from female versus male mice (C57BL/6; 8 weeks old, n = 5 per group). Genes are ordered by increasing fold change between females and males from left to right. c,d, Representative histogram (c) and normalized MFI (d) of UTX protein expression in splenic NK cells from naive female versus male mice by flow cytometry, normalized to MFI of female mice (C57BL/6; 8 weeks old; n = 15 per group). e, Relative expression of Kdm6a (UTX) by RT–qPCR of isolated splenic NK cells normalized to females (n = 6 per group). f,g Representative histograms (f) and relative UTX MFI (g) of NK cells by flow cytometry from spleens of gonadectomized female and male mice (n = 6 per group) normalized to female. Samples were compared using unpaired two-tailed Student's t-test and data points are presented as individual mice with the mean ± s.e.m. (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001). Specific P values are as follows: a < 0.001; b: Ddx3x = 0.03, Kdm5c = 0.0017, Eif2s3 = 0.0113, Kdm6a = 0.000087; d = 0.003; e = 0.008; g = 0.0029).

그림 2|X-linked UTX는 성호르몬과 관계없이 성적으로 이형적인 유전자 발현을 표시합니다.a 인간 여성(n=36) 대 남성(n {{4)의 분류된 NK 세포에 대한 DICE 데이터베이스 RNA-seq 데이터를 사용하여 XCI 탈출 유전자의 정규화된 표현 }}) 여성으로 정규화되었습니다. b, 암컷 대 수컷 마우스(C57BL/6; 8주령, 그룹당 n= 5)의 비장 NK 세포에서 역전사(RT-qPCR)를 이용한 정량적 PCR에 의한 XCI 탈출 유전자의 표준화된 발현. 유전자는 암컷과 수컷 사이의 배수 변화를 왼쪽에서 오른쪽으로 증가시켜 정렬됩니다. c, d, 유세포 분석에 의한 순진한 암컷 대 수컷 마우스의 비장 NK 세포에서 UTX 단백질 발현의 대표적인 히스토그램(c) 및 표준화된 MFI(d), 암컷 마우스(C57BL/6; 8주령; n { 그룹당 {12}}). e, 암컷에 대해 표준화된 분리된 비장 ​​NK 세포의 RT-qPCR에 의한 Kdm6a(UTX)의 상대적 발현(그룹당 n{14}}). f, g 생식선 절제된 암컷 및 수컷 마우스(그룹당 n{15}})의 비장에서 유세포 분석을 통해 암컷으로 표준화된 NK 세포의 대표 히스토그램(f) 및 상대 UTX MFI(g). 샘플은 짝을 이루지 않은 양측 스튜던트 t-테스트를 ​​사용하여 비교되었으며 데이터 포인트는 평균 ± sem(*P < 0.{{20}}5; **P)을 갖는 개별 마우스로 표시됩니다. < 0.01; ***P < 0.001). 특정 P 값은 다음과 같습니다: a < 0.001; b: Ddx3x=0.03, Kdm5c=0.0017, Eif2s3 = 0.0113, Kdm6a=0.000087; d=0.003; e=0.008; g=0.0029).

UTX는 NK 세포 이펙터 기능을 향상시킵니다.

남성 NK 세포는 생식선 호르몬(그림 1j, k)과 관계없이 감소된 IFN 생산(그림 1d, e)을 나타냈기 때문에 다음으로 이 표현형이 UTX 수준에 의해 조절되는지 확인하려고 했습니다. 사이토카인 자극 후 IFN{3}} 생성 세포(그림 4a 및 확장 데이터 그림 4a,b)와 IFN-MFI(그림 4a)의 빈도 및 절대 수는 남성 WT와 여성 UTXHet NK 간에 유사했습니다. 세포. 암컷 UTXHet NK 세포에 의한 IFN-생산은 암컷 WT와 암컷 UTXNKD NK 세포 사이의 중간 수준이었습니다(그림 4a 및 확장 데이터 그림 4a,b). 이러한 경향은 ELISA에 의한 NK 세포 IFN-축적을 비교함으로써도 관찰되었다(도 4b). 더욱이 이러한 현상은 IFN- 에 특이적인 것이 아니었습니다. 왜냐하면 염증성 NK 이펙터 분자인 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 생산도 여성 NK 세포에서 UTX 카피 수가 감소함에 따라 감소했기 때문입니다(그림 4c). ).

사이토카인 생산 외에도 NK 세포 세포용해 활성은 항바이러스 및 항종양 방어에 매우 중요합니다. NK 세포 세포 독성의 성별 차이를 평가하기 위해 우리는 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 결핍 MC38 세포를 표적으로 사용하여 사멸 분석을 수행했습니다. 4:1 이펙터:표적 비율에서 수컷 WT NK 세포는 암컷 WT에 비해 표적 세포의 용해가 현저히 낮았으며(그림 4d), 이는 성선 절제된 마우스에서 유지되었습니다(확장 데이터 그림 4c). 수컷 NK 세포에 의한 손상된 표적 세포 살상은 탈과립화의 차이로 인한 것이 아닙니다. 왜냐하면 CD107a 수준이 암컷과 수컷 NK 세포 사이에서 유사했기 때문입니다(확장 데이터 그림 4d,e). 그러나 수컷은 IL-15 및 항-NK1.1 활성화 수용체 결찰에 반응하여 세포 독성 분자인 퍼포린과 그랜자임 B의 수준이 상당히 낮았습니다(확장 데이터 그림 4d,e). 특히, UTXHet과 수컷 WT NK 세포는 유사한 살상 능력을 보였으며(그림 4d), 이는 암컷 WT와 UTXNKD NK 세포 사이의 중간 수준이었습니다(그림 4d). 함께, 이러한 데이터는 UTX가 용량 의존적 방식으로 NK 세포 세포독성을 향상시킨다는 것을 시사합니다.

Desert ginseng-Improve immunity (2)

cistanche tubeulosa - 면역 체계를 향상시킵니다.

NK 세포 이펙터 기능에 대한 UTX 손실의 관찰된 효과를 고려하여 우리는 UTXNKD 마우스가 바이러스 감염에 더 취약한지 여부를 조사했습니다. 신속한 IFN- 및 GM-CSF 생산은 NK 세포 매개 항바이러스 제어에 중요합니다. 놀랍게도 UTXNKD 생쥐는 치사량 이하의 MCMV 투여 시 빠르게 감염에 굴복했습니다(n= 3/8 생존). 더욱이, UTX가 결핍된 비장 NK 세포는 감염 후 1.5일째에 전체 NK 세포에서 IFN-생산 및 그랜자임 B 생산에 현저한 결함을 나타냈습니다(그림 4f 및 확장 데이터 그림 4f,g). 또한 UTXNKD에 의한 IFN-생산의 유사한 결함이 모든 성숙 하위 집합에서 관찰되었으며(확장 데이터 그림 4h), 이는 UTX가 성숙과 무관한 방식으로 IFN-생산을 제어한다는 것을 의미합니다. 성숙한 NK 세포에서 UTX 발현의 투여량이 생체 내 바이러스 감염 동안 IFN- 생성과 연관되어 있는지 확인하기 위해, 우리는 타목시펜 유도성 UTX 결실(Kdm6afl/fl Rosa26ERT2CRE+, 이하 iUTX-/ -, 보충 데이터 표 1). mBMC 마우스는 조혈 구획에 대한 UTX 결실을 제한하기 위해 WT(CD45.1+ )와 iUTX-/-(CD45.2+ )의 1:1 혼합으로 생산되었습니다. WT:iUTX-/-mBMC 마우스를 MCMV 감염 직전에 타목시펜으로 처리하여 UTX 발현을 제거했습니다(그림 4g). IDX−/− (CD45.2+ ) NK 세포는 WT 세포에 비해 IFN-을 적게 생성했습니다(그림 4h 및 확장 데이터 그림 4i). WT:iUTX-/- mBMC 마우스에 타목시펜을 투여하면 UTX 단백질 손실이 차등적으로 나타나고 감염 후 1.5일째에 세포내 UTX 수준과 IFN-생산 사이에 유의미한 양의 상관관계가 나타났습니다(그림 4i). 이러한 결과는 성숙한 NK 세포의 세포 고유 UTX 수준이 이펙터 분자 생산과 MCMV 감염에 대한 후속 보호를 조절한다는 것을 입증합니다.

Fig. 3 | UTX suppresses NK cell fitness. a,b, Frequency (F and M WT: n = 12; F UTXHet: n = 16; a) and absolute numbers (F WT: n = 6; M WT: n = 8; F UTXHet: n = 9; b) of NK cells in the spleen of female (F) WT, male (M) WT and F UTXHet mice. c,d, Frequency (WT: n = 12; UTXHet: n = 16; UTXNKD: n = 6; c) and absolute numbers (WT: n = 8; UTXHet: n = 12; UTXNKD: n = 6; d) of NK cells in spleen of F WT, UTXHet and UTXNKD mice. e, Representative contour plots of congenically distinct WT (CD451x2 ) and UTXNKD (CD45.2+ ) NK cells transferred into WT (CD45.1+ ) recipients at a 1:1 ratio before injection (left) and on day 7 after transfer (right). f, Frequency of WT and UTXNKD cells in the spleen of recipient mice before injection and day 7 after transfer (n = 6). g,h, Representative histograms (g) and percentage (h) of cleaved caspase 3+ NK cells of female WT, UTXHet, and UTXNKD mice cultured with IL-15 (5 ng ml−1) and either dimethylsulfoxide (DMSO; F WT: n = 7; F UTXHet: n = 11; F UTXNKD: n = 6) or 2.5 μM Nutlin-3a (F WT: n = 3; F UTXHet: n = 7; F UTXNKD: n = 3) for 24 h. i–k, Normalized Bcl-2 MFI (i), Bim MFI (j), and Bcl-2:Bim MFI ratio (k) in splenic NK cells from female WT and UTXNKD mice (n = 5). l,m, Bcl-2:Bim MFI ratio in splenic NK cells from female WT and male WT mice (n = 6; l) and gonadectomized female and male mice (n = 11; m). Data are representative of 2–4 independent experiments. Samples were compared using ordinary one-way analysis of variance (ANOVA; a–d), two-way ANOVA with Tukey's correction for multiple comparisons (h), or unpaired two-tailed Student's t-test (f, i–m). Data points are individual mice with the mean ± s.e.m. (NS, not significant; *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001). Specific P values are as follows: a: F WT versus M WT = 0.0201, M WT versus UTXHet = 0.989, F WT versus UTXHet = 0.0327, WT versus UTXNKD = 0.001; b: F WT versus M WT = 0.0320, M WT versus UTXHet < 0.99, F WT versus UTXHet = 0.0029, WT versus UTXNKD = 0.001; c: WT versus UTXHet = 0.0375, UTXHet versus UTXNKD and WT versus UTXNKD < 0.0001; d: WT versus UTXHet = 0.0191, UTXHet versus UTXNKD = 0.0278, WT versus UTXNKD = 0.001; f: Pre-injection = 0.3304; day 7 = 0.001918; h: DMSO < 0.0001, Nutlin-3a–F WT versus F UTXHet = 0.0048, rest < 0.0001; i < 0.0001; j = 0.0004; k = 0.0025; l = 0.0115; m = 0.0227.

그림 3|UTX는 NK 세포 적합성을 억제합니다. a,b, 빈도(F 및 M WT: n=12; F UTXHet: n=16; a) 및 절대 숫자(F WT: n=6; M WT: n {{ 4}}; F UTXHet: n=9; b) 암컷(F) WT, 수컷(M) WT 및 F UTXHet 마우스의 비장 내 NK 세포. c,d, 빈도(WT: n=12; UTXHet: n=16; UTXNKD: n=6; c) 및 절대 숫자(WT: n=8; UTXHet: n {{10}}; UTXNKD: n=6; d) F WT, UTXHet 및 UTXNKD 마우스의 비장에 있는 NK 세포. e, 주입 전 1:1 비율로 WT(CD45.1+ ) 수용자로 전달된 동질적으로 구별되는 WT(CD451x2 ) 및 UTXNKD(CD45.2+ ) NK 세포의 대표적인 등고선 플롯(왼쪽) 및 이동 후 7일째(오른쪽). f, 주사 전 및 이식 후 7일째(n{22}}) 수용자 마우스의 비장에서 WT 및 UTXNKD 세포의 빈도. g, h, IL-15(5 ng ml-1)과 함께 배양된 암컷 WT, UTXHet 및 UTXNKD 마우스의 절단된 카스파제 3+ NK 세포의 대표적인 히스토그램(g) 및 백분율(h) 디메틸설폭사이드(DMSO; F WT: n=7; F UTXHet: n=11; F UTXNKD: n=6) 또는 2.5 μM Nutlin-3a(F WT: n { {33}}; F UTXHet: n=7; F UTXNKD: n=3) 24시간 동안. i-k, 암컷 WT 및 UTXNKD 마우스의 비장 NK 세포에서 정규화된 Bcl-2 MFI(i), Bim MFI(j) 및 Bcl-2:Bim MFI 비율(k)(n {{ 39}}). l, m, Bcl{{40}}: 암컷 WT 및 수컷 WT 마우스(n=6; l) 및 성선 절제된 암컷 및 수컷 마우스(n {{ 42}};m). 데이터는 2-4개의 독립적인 실험을 나타냅니다. 샘플은 일반적인 일원 분산 분석(ANOVA, a-d), 다중 비교를 위한 Tukey 보정(h) 또는 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던트 t-테스트(f, i-m)를 사용한 양방향 ANOVA를 사용하여 비교되었습니다. 데이터 포인트는 평균 ± sem(NS, 유의하지 않음; *P < 0.05; **P < 0.01; *)을 갖는 개별 마우스입니다. **P < 0.001; ****P < 0.0001). 구체적인 P 값은 다음과 같습니다: a: F WT 대 M WT=0.0201, M WT 대 UTXHet=0.989, F WT 대 UTXHet=0.0327, WT 대 UTXNKD { {63}}.001; b: F WT 대 M WT=0.0320, M WT 대 UTXHet < 0.99, F WT 대 UTXHet=0.0029, WT 대 UTXNKD=0.001; c: WT 대 UTXHet=0.0375, UTXHet 대 UTXNKD 및 WT 대 UTXNKD < 0.0001; d: WT 대 UTXHet=0.0191, UTXHet 대 UTXNKD=0.0278, WT 대 UTXNKD=0.001; f: 사전 주입=0.3304; 일 7=0.001918; h: DMSO < 0.0001, Nutlin-3a–F WT 대 F UTXHet=0.0048, 나머지 < 0.0001; 나는 <0.0001; j=0.0004; k=0.0025; l=0.0115; m=0.0227.

UTX는 탈메틸효소와 무관한 방식으로 NK 세포를 조절합니다

히스톤 탈메틸화효소인 UTX는 트리메틸화된 히스톤 H3 Lys27(H3K27me3, 억제성 히스톤 표시)에서 메틸 그룹을 제거하여 활성 유전자 발현을 위한 염색질을 조절함으로써 NK 세포 항상성과 이펙터 유전자 발현 프로그램을 제어할 수 있습니다. 그러나 UTX는 또한 유전자 발현을 조정하기 위해 후생적 조절인자 및 염색질 변형자와 상호작용함으로써 데메틸라제 독립적 활성을 보유합니다. NK 세포 항상성 및 이펙터 기능 조절에서 UTX 데메틸라제 활성의 역할을 탐색하기 위해 우리는 p.His1146Ala 및 p.Glu1148Ala를 포함하는 촉매적으로 비활성인 UTX(UTX 'demethylase-dead' 또는 UTXDMD 마우스, 보충 데이터 표 1)를 발현하는 마우스를 활용했습니다. 촉매 도메인의 점 돌연변이38. 흥미롭게도 암컷 UTXDMD와 WT 마우스는 비슷한 빈도와 비장 NK 세포의 절대 수를 보인 반면 (그림 5a-c), UTXNKD 마우스는 둘 다에 비해 비장 NK 세포 수가 증가한 것으로 나타났습니다. 이러한 발견은 UTX의 NK 세포 수 억제가 탈메틸효소와 무관하다는 것을 시사합니다. 더욱이, 사이토카인 자극에 반응하여 IFN-을 생성하는 능력에서 WT와 UTXDMD NK 세포 사이에는 차이가 관찰되지 않았습니다(그림 5d-f). 이러한 결과는 NK 세포 수를 억제하고 IFN-생산을 촉진하는 UTX의 기능이 탈메틸효소와 무관하다는 것을 입증합니다. UTX의 단일 복사본 외에도 수컷은 UTX의 Y 염색체 연결 상동체인 촉매적으로 비활성인 Kdm6c(UTY 단백질을 인코딩함)를 발현합니다. 우리는 UTY가 인간(확장 데이터 그림 5a)과 생쥐(확장 데이터 그림 5b)의 남성 NK 세포에서만 발현되고 생쥐에서 생식선 절제술에 의해 변경되지 않음을 확인했습니다(확장 데이터 그림 5b). 위에서 논의한 바와 같이 수컷 WT (UTX 및 UTY의 한 복사본)와 암컷 UTXHet (UTX의 한 복사본) 마우스 (그림 3a, b 및 4a, d) 사이의 NK 세포 수 또는 이펙터 기능에는 차이가 없었습니다. NK 세포 항상성 및 이펙터 기능 조절에서 UTY의 역할은 제한적입니다. 또한 수컷 UTXNKD(Kdm6afl/y Ncr1cre+) 마우스는 수컷 WT 대조군에 비해 증가된 NK 세포 빈도와 절대 수(확장 데이터 그림 5c,d)를 보였고 더 적은 IFN-(확장 데이터 그림 5e-h)를 생성했습니다. NK 세포 UTX 결핍이 있는 여성에게서 나타나는 변화를 반영합니다. (그림 3a, b 및 4a, b). 따라서 NK 세포의 UTX 손실은 여성과 남성에게 유사한 영향을 미칩니다.

UTX는 염색질을 리모델링하여 NK 세포 전사체를 제어합니다

최근 연구에서는 NK 세포 활성화 이전에도 신속한 이펙터 반응을 위해 선천적 림프구 세포를 준비시키는 NK 세포 조절 회로(레굴론)가 확인되었습니다 39. 후생적 변형자로서 UTX는 표적 유전자좌의 조절 요소에서 염색질을 구성하여 전사를 변경할 수 있습니다4{23} }. NK 세포의 염색질 접근성 및 유전자 발현에 대한 UTX 매개 변형을 조사하기 위해 정렬 정제된 WT(CD45.1+ ) 및 UTXNKD(CD45.{{)에 대한 벌크 RNA-seq와 함께 ATAC-seq를 수행했습니다. 9}} ) 4:1 WT: UTXNKD mBMC 마우스의 NK 세포(확장 데이터 그림 6a). mBMC 마우스를 사용하면 내부적으로 통제된 실험이 가능하고 환경 교란 요인이 최소화되었습니다. ATAC-seq 및 RNA-seq 데이터의 주성분 분석(PCA)을 통해 유전자형에 따른 샘플 클러스터링이 나타났습니다(확장 데이터 그림 6b). ATAC-seq에서는 WT NK 세포와 비교하여 UTXNKD에서 접근성이 3,569개 피크가 감소하고 2,113개 피크가 증가한 것으로 나타났습니다(log2 배수 변화 > ±0.5, 조정된 P 값 < 0.05 , 거짓 발견률(FDR) < 0.05; 보충 데이터 표 2). 더욱이, RNA-seq는 WT에 비해 UTXNKD에서 701개의 감소된 유전자와 554개의 증가된 유전자를 확인했습니다(log2 배수 변화 > ±0.5, 조정된 P 값 < 0.05, FDR < 0.05, 확장 데이터 그림 6c 및 보충 데이터 표 3). 이러한 발견은 UTX가 없을 때 NK 세포의 염색질 지형과 전사체 모두에 심각한 변화가 있음을 시사합니다.

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시스탄체 식물의 면역 체계 증가

ATAC-seq와 RNA-seq의 통합 분석을 통해 차등적으로 접근 가능하고 평균 log2 사이에 상당한 양의 상관관계(Spearman 상관관계: R=0.62, P < 2.2 × 10−16)로 표현되는 395개의 유전자가 확인되었습니다. ATAC-seq 피크의 배수 변화 및 RNA-seq 발현의 log2 배수 변화(확장 데이터 그림 6d). ATAC-seq 및 RNA-seq 데이터 세트의 퍼지 c-평균 클러스터링은 크게 감소(클러스터 1, 2, 3 및 6)하거나 증가(클러스터 4 및 5)한 6개의 주요 클러스터를 식별하고 접근 불가능성(그림 6a) 및 발현 (그림 6b) UTXNKD NK 세포에서. 기능 강화 분석을 위해 g:Profiler를 사용하여 RNA-seq로 식별된 차별적으로 발현된 유전자 클러스터를 분석했습니다(그림 6c). 면역 체계 과정, 사이토카인 생산, IFN 생산, 림프구 활성화 및 면역 이펙터 과정과 같은 주요 경로는 UTXNKD의 발현 감소와 관련이 있었습니다(클러스터 1, 2, 3 및 6; 그림 6c). 한편, 발달 과정, 생합성 과정 및 대사 과정과 같은 경로는 UTXNKD의 발현 증가와 유의미한 관련이 있습니다 (클러스터 4 및 5, 그림 6c). 주목할 만한 점은 세포 사멸 경로 유전자를 분석한 결과 여러 유전자가 차별적으로 발현되는 것으로 나타났습니다(확장 데이터 그림 6e). 특히, 항세포사멸 유전자 Bcl2의 발현은 증가한 반면, 세포사멸 촉진 유전자 Casp3은 감소하였다(확장 데이터 그림 6e). 종합적으로, 이러한 발견은 UTX의 손실이 염색질 접근성의 변형과 NK 세포 항상성 및 이펙터 기능과 관련된 유전자의 발현을 초래한다는 것을 의미합니다.

Fig. 4 | UTX enhances NK cell effector function and is required for survival against viral infection. a Percentage IFN-γ+ and normalized IFN-γ MFI of NK cells from female WT (n = 8), male WT (n = 8), female UTXHet (n = 12) and female UTXNKD (n = 6) mice with no treatment (NT) or IL-15 (50 ng ml−1) and IL-12 (20 ng ml−1) for 4 h, normalized to MFI of female IL-15/IL-12 treatment. b,c, IFN-γ (b) and GM-CSF (c) concentrations measured by ELISA in supernatants from female WT (n = 4), UTXHet (n = 5) and UTXNKD (n = 3) NK cells with NT or IL-12 (20 ng ml−1) and IL-18 (10 ng ml−1) for 4 h. d, Specific lysis of MHCI-deficient MC38 (target) cells by female WT (n = 5), male WT (n = 8), female UTXHet (n = 12) or female UTXNKD (n = 6) NK (effector) cells for 16 h at a 4:1 effector: target ratio, normalized to lysis by female WT. e, Kaplan–Meier survival curves of WT and UTXNKD mice infected with MCMV (n = 8). Mantel–Cox test (P = 0.0093). f, Percentage IFN-γ+ (n = 14), normalized IFN-γ MFI (n = 14) and granzyme B (GzmB) MFI (n = 8) relative to WT in splenic NK cells on D1.5 after MCMV infection of 4:1 WT:UTXNKD mBMC mice. g, Schematic of 1:1 WT (CD45.1+ ) and iUTX−/− (CD45.2+ ) bone marrow (BM) transferred into busulfan-depleted hosts and treated with 1 mg tamoxifen for 3 d before MCMV infection. h, Percentage IFN-γ+ and normalized IFN-γ MFI of NK cells from 1:1 WT:iUTX−/− mBMC mice on D1.5 after MCMV infection, normalized to WT (n = 6). i, Two-tailed Pearson correlation of IFN-γ versus UTX MFI of NK cells (n = 12; r 2 = 0.775; P < 0.0001). Data are representative of 2–3 independent experiments. Two-way ANOVA (a–c), one-way ANOVA with Tukey's correction for multiple comparisons (d), or paired two-tailed Student's t-test (f,h) were used. Data points are individual mice with the mean ± s.e.m. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001. Specific P values: a: F WT versus M WT = 0.0027, F WT versus F UTXHet and F WT versus F UTXNKD < 0.0001, M WT versus F UTXHet = 0.269, F UTXHet versus F UTXNKD = 0.0007; b: WT versus UTXHet = 0.0037, UTXHet versus UTXNKD = 0.0011, WT versus UTXNKD < 0.0001; c: WT versus UTXHet = 0.0026, UTXHet versus UTXNKD = 0.0349, WT versus UTXNKD < 0.0001; d: F WT versus M WT = 0.0005, F WT versus F UTXHet and F WT versus F UTXNKD < 0.0001, M WT versus F UTXHet = 0.1616, F UTXHet versus F UTXNKD = 0.0439; f: %IFN-γ+ < 0.0001, IFN-γ MFI = 0.0024, GzmB = 0.0032; g: %IFN-γ+ < 0.0001, IFN-γ MFI = 0.0018. PI, post-infection.

그림 4|UTX는 NK 세포 이펙터 기능을 향상시키고 바이러스 감염에 대한 생존에 필요합니다. a 여성 WT(n=8), 남성 WT(n=8), 여성 UTXHet(n=12)로부터의 NK 세포의 백분율 IFN- + 및 정규화된 IFN-MFI 및 처리되지 않은 암컷 UTXNKD(n=6) 마우스(NT) 또는 IL-15(5{{70}} ng ml−1) 및 IL{{1{{8{ 4시간 동안 {82}}}}}}(20 ng ml−1), 여성 IL-15/IL-12 치료의 MFI로 정규화되었습니다. b, c, 여성 WT(n=4), UTXHet(n=5) 및 UTXNKD(n {{2)의 상등액에서 ELISA로 측정한 IFN-(b) 및 GM-CSF(c) 농도 0}}) NT 또는 IL-12(20 ng ml−1) 및 IL-18(1{{1{{1{{115})을 갖는 NK 세포 }8}}4}} ng ml−1) 4시간 동안. d, 여성 WT(n {{3{123}}}}), 남성 WT(n=8), 여성 UTXHet(n=12)에 의한 MHCI 결핍 MC38(표적) 세포의 특정 용해 ) 또는 여성 UTXNKD(n{33}}) NK(이펙터) 세포를 4:1 이펙터:표적 비율에서 16시간 동안, 여성 WT에 의해 용해로 정규화했습니다. e, MCMV에 감염된 WT 및 UTXNKD 마우스의 Kaplan-Meier 생존 곡선(n{37}}). Mantel–Cox 검정(P=0.0093). f, 비장의 WT 대비 백분율 IFN- +(n=14), 정규화된 IFN-MFI(n=14) 및 그랜자임 B(GzmB) MFI(n=8) 4:1 WT:UTXNKD mBMC 마우스의 MCMV 감염 후 D1.5의 NK 세포. g, 1:1 WT(CD45.1+ ) 및 iUTX−/−(CD45.2+ ) 골수(BM)의 도식은 부술판이 고갈된 숙주로 옮겨지고 3일간 1 mg 타목시펜으로 처리되었습니다. d MCMV 감염 전. h, MCMV 감염 후 D1.5에 1:1 WT:iUTX-/- mBMC 마우스의 NK 세포의 백분율 IFN- + 및 표준화된 IFN-MFI, WT로 표준화됨(n{64}}). i, NK 세포의 IFN- 대 UTX MFI의 양측 Pearson 상관관계(n=12; r 2=0.775; P < 0.0001). 데이터는 2~3개의 독립적인 실험을 나타냅니다. 양방향 ANOVA(a–c), 다중 비교를 위한 Tukey 보정(d) 또는 쌍을 이루는 양측 스튜던트 t-검정(f,h)을 사용한 일원 분산 분석이 사용되었습니다. 데이터 포인트는 평균 ± sem *P < 0.05인 개별 마우스입니다. **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001. 특정 P 값: a: F WT 대 M WT=0.0027, F WT 대 F UTXHet 및 F WT 대 F UTXNKD < 0.0001, M WT 대 F UTXHet=0.269, F UTXHet 대 F UTXNKD=0.0007; b: WT 대 UTXHet=0.0037, UTXHet 대 UTXNKD=0.0011, WT 대 UTXNKD < 0.0001; c: WT 대 UTXHet=0.0026, UTXHet 대 UTXNKD=0.0349, WT 대 UTXNKD < 0.0001; d: F WT 대 M WT=0.0005, F WT 대 F UTXHet 및 F WT 대 F UTXNKD < 0.0001, M WT 대 F UTXHet=0.1616, F UTXHet 대 F UTXNKD {{112 }}.0439; f: %IFN- + < 0.0001, IFN-MFI=0.0024, GzmB=0.0032; g: %IFN- + < 0.0001, IFN- MFI=0.0018. PI, 감염 후.

Fig. 5 | UTX controls NK cell homeostasis and IFN-γ production independent of demethylase activity. a–c, Representative density plots (a), frequency (b), and absolute number (c) of NK cells in the spleens of female WT, UTXDMD, and UTXNKD mice (n = 5 per group). d–f, Representative contour plots (d), percentage IFN-γ+ (e), and normalized IFN-γ MFI (f) of female WT, UTXDMD, and UTXNKD NK cells (n = 5 per group) normalized to WT. Data are representative of 2–3 independent experiments. Samples were compared using one-way ANOVA with Tukey's correction for multiple comparisons. Data points are presented as individual mice with the mean ± s.e.m. *P < 0.05; **P < 0.01; ****P < 0.0001. Specific P values are as follows: b: WT versus UTXDMD = 0.7353, WT versus UTXNKD and UTXDMD versus UTXNKD < 0.0001; c: WT versus UTXDMD = 0.4888, WT versus UTXNKD and UTXDMD versus UTXNKD < 0.0001; e: WT versus UTXDMD = 0.855, WT versus UTXNKD = 0.0030, UTXDMD versus UTXNKD = 0.0380; f: WT versus UTXDMD = 0.1382, WT versus UTXNKD = 0.0079, UTXDMD versus UTXNKD = 0.0166.

그림 5|UTX는 데메틸라제 활성과 관계없이 NK 세포 항상성과 IFN-생산을 제어합니다. a-c, 암컷 WT, UTXDMD 및 UTXNKD 마우스(그룹당 n{2}})의 비장에 있는 NK 세포의 대표 밀도 플롯(a), 빈도(b) 및 절대 수(c). d–f, 여성 WT, UTXDMD 및 UTXNKD NK 세포(그룹당 n=5)의 대표 등고선 플롯(d), 백분율 IFN- +(e) 및 정규화된 IFN-MFI(f) WT로 정규화되었습니다. 데이터는 2~3개의 독립적인 실험을 나타냅니다. 샘플은 다중 비교를 위한 Tukey 보정과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 비교되었습니다. 데이터 포인트는 평균 ± sem *P < 0.05; **P < 0.01; ****P < 0.0001. 구체적인 P 값은 다음과 같습니다: b: WT 대 UTXDMD=0.7353, WT 대 UTXNKD 및 UTXDMD 대 UTXNKD < 0.0001; c: WT 대 UTXDMD=0.4888, WT 대 UTXNKD 및 UTXDMD 대 UTXNKD < 0.0001; e: WT 대 UTXDMD=0.855, WT 대 UTXNKD=0.0030, UTXDMD 대 UTXNKD=0.0380; f: WT 대 UTXDMD=0.1382, WT 대 UTXNKD=0.0079, UTXDMD 대 UTXNKD=0.0166.

ATAC-seq와 RNA-seq에서 관찰한 접근성과 유전자 발현의 게놈 전반에 걸친 차이를 고려하여 직접적인 UTX 매개 효과도 조사했습니다. 우리는 항-UTX CUT&Tag를 수행한 후 시퀀싱을 수행하여 항체 기반 면역침전 방법을 사용하여 UTX에 결합된 DNA 영역을 검출할 수 있었습니다. 정렬 정제된 WT 및 UTXNKD NK 세포의 Anti-UTX CUT&Tag는 5,746개의 UTX 결합 피크를 나타냈습니다(FDR < 0.01, 조정된 P 값 < 0.05; 그림 6d 및 보충 데이터 표 4). ATAC-seq 및 RNA-seq 데이터의 PCA는 유전자형에 따른 샘플 클러스터링을 나타냅니다(확장 데이터 그림 6f). 우리는 UTX 결합되어 있고 ATAC-seq에 의해 차별적으로 접근 가능하며 RNA-seq에 의해 차별적으로 발현되는 191개의 유전자를 확인했습니다(그림 6d). 이 191개 유전자 내에서 UTX 결합 피크의 대부분은 프로모터(20.58%), 인트론(46.94%) 및 유전자간(27.4%) 영역에 위치했습니다(그림 6e). NK 세포 항상성(Bcl2 및 Thy1; 그림 6f) 및 이펙터 기능(Ifng 및 Csf2)과 관련된 주목할만한 유전자는 UTX 결합되어 차등적으로 접근 가능하고 차등적으로 발현되었습니다(그림 6g). 더욱이, 191개 UTX 결합 유전자 중 140개 유전자의 발현이 감소한 반면, 나머지 51개 유전자는 증가했습니다(보충 데이터 표 3). 이는 UTX가 유전자 전사를 활성화하고 억제하는 데 모두 기능한다는 T 세포의 이전 보고를 뒷받침합니다. 이들 191개 UTX 결합 유전자에 대한 Enrichr 경로 분석44은 UTXNKD NK 세포에서 염증 반응, IFN 신호 전달 및 NK 세포 세포 독성 경로가 감소한 것으로 나타났습니다(확장 데이터 그림 6g). 반대로, 세포사멸 촉진 및 세포사멸 방지 유전자(예: Bcl2, Bbc3 및 Gadd45g)를 모두 포함하는 증가된 세포 이화 과정 및 세포사멸 신호 전달 경로가 UTXNKD NK 세포에서 나타났습니다. UTX 의존적 발현과 염색질 접근성 차이가 있는 865 UTX 결합 피크(191개의 고유 유전자) 중에서 선형 회귀 분석은 염색질 사이에 유의미한 양의 상관관계(Pearson's R=0.5165, P < 0.0001)를 보여주었습니다. 접근성 및 유전자 발현 (확장 데이터 그림 6h, i). Bcl2, Thy1, Ifng 및 Csf2 유전자좌 내의 UTX 점유 영역은 접근성 및 유전자 발현의 차이도 주목되는 영역과 일치합니다 (그림 6f, g). 이러한 데이터는 UTX가 NK 세포 항상성과 기능을 조절하는 데 중요한 염색질 접근성과 유전자 전사 경로를 조절한다는 것을 시사합니다.

UTX는 전사인자(TF)와 상호작용하여 표적 유전자 전사를 조율하는 것으로 알려져 있습니다. UTX의 손실로 인해 차등적 접근성을 갖는 추정 TF 모티프를 식별하기 위해 ATAC-seq로 식별된 차등적으로 접근 가능한 피크에 대해 HOMER(Hypergeometric Optimization of Motif Enrichment)45 TF 모티프 분석을 수행했습니다(확장 데이터 그림 6j). NK 세포 이펙터 기능과 관련된 TF(예: Runt(Runx1 및 Runx2)46 및 T-box(Eomes, T-bet, Tbr1 및 Tbx6) 계열 구성원)는 더 중요했으며 NK 세포와 관련된 표적 모티프의 비율이 더 높았습니다. UTXNKD의 접근성 감소(클러스터 1, 2, 3 및 6, 확장 데이터 그림 6j). 반대로, 아연 핑거 및 ETS 계열 TF48의 증식, 분화 및 대사와 관련된 TF는 접근성 증가와 더 유의미하게 연관되어 있습니다(클러스터 4 및 5, 확장 데이터 그림 6j). 또한, UTX CUT&Tag에 의한 UTX 결합 피크의 TF 모티프 분석은 NK 세포 효과기 프로세스(T-bet, Eomes, Runx1 및 Tbx5)와 발달 프로그램(ETS1 및 AP-1) 모두에서 중요한 TF를 밝혀 이러한 결과를 확증합니다. 확장 데이터 그림 6k). 이러한 데이터는 NK 세포 적합성과 효과기 과정을 조절하는 데 관여하는 중요한 TF 결합 모티프의 차등적 접근성과 직접적인 UTX 결합을 모두 제시합니다. 이러한 분석은 UTX가 염색질 환경을 조절하여 NK 세포 항상성(Bcl2 및 Thy1) 및 효과기 기능(Ifng 및 Csf2)에 중요한 유전자의 발현을 제어한다는 것을 시사합니다. 궁극적으로, 이러한 발견은 차등적인 UTX 발현 수준이 NK 세포 적합성과 이펙터 기능의 중심 조절자로서 NK 세포의 성적 이형성의 기초가 될 수 있다는 모델을 제시합니다(그림 6h).

Fig. 6 | Global changes in NK cell chromatin accessibility and transcription mediated by UTX. a–c, 4:1 WT: UTXNKD mBMCs were generated by transferring WT (CD45.1+ ) and UTXNKD (CD45.2+ ) bone marrow into lymphodepleted host mice (CD451x2 ) and allowed to reconstitute for 6 weeks. Splenic NK cells were sorted for ATAC-seq and RNA-seq library preparation (n = 3 per group). Line graphs (left) and heat map (right) of fuzzy c-means clustered differentially accessible peaks identified by ATAC-seq (a) and differentially expressed genes identified by RNA-seq (b) of splenic NK cells from WT: UTXNKD mBMC mice (adjusted P value < 0.05 and membership score > 0.5). Line graphs show the mean (black line) and standard deviation (red ribbon) of mean-centered normalized log2 values of significance (FDR and adjusted P value < 0.05). c, Pathway analysis of significant fuzzy c-means clustered RNA-seq genes using g: Profiler with point size indicating −log10(P value; calculated by g: GOSt using Fisher's one-tailed test). d–g, Anti-UTX CUT&Tag was performed in WT and UTXNKD NK cells and identified 5,746 unique UTX-bound peaks (n = 3 per group). d, Venn diagram outlining overlapping differentially accessible (DA) genes identified by ATAC-seq and differentially expressed (DE) genes identified by RNA-seq. e, Location of UTX-bound peaks. f,g, Representative gene tracks from UCSC Integrated Genome Browser of anti-UTX CUT&Tag ('anti-UTX'), ATAC-seq and RNA-seq of Bcl2 and Thy1 (f) and Ifng and Csf2 (g); y-axis depicts counts per million (CPM). h, Schematic of how differential UTX expression levels underlie sexual dimorphism in NK cell composition and function (left). Diagram of how UTX may be regulating gene programs involved in NK cell numbers and effector function during homeostasis and viral infection (right). Created with BioRender.com.

그림 6|UTX에 의해 매개되는 NK 세포 염색질 접근성 및 전사의 전반적인 변화. a–c, 4:1 WT: UTXNKD mBMC는 WT(CD45.1+ ) 및 UTXNKD(CD45.2+ ) 골수를 림프 고갈된 숙주 마우스(CD451x2 )에 옮겨서 생성되었으며 6주. ATAC-seq 및 RNA-seq 라이브러리 준비를 위해 비장 NK 세포를 분류했습니다(그룹당 n{12}}). ATAC-seq(a)에 의해 식별된 퍼지 c-평균 클러스터링된 차별적으로 접근 가능한 피크와 WT의 비장 NK 세포의 RNA-seq(b)에 의해 식별된 차별적으로 발현된 유전자의 선 그래프(왼쪽) 및 히트 맵(오른쪽): UTXNKD mBMC 마우스 (조정된 P 값 < 0.05 및 회원 점수 > 0.5). 선 그래프는 평균 중심 정규화 log2 값(FDR 및 조정된 P 값 < 0.05)의 평균(검은색 선) 및 표준 편차(빨간색 리본)를 보여줍니다. c, g를 사용하여 유의미한 퍼지 c-평균 클러스터링된 RNA-seq 유전자의 경로 분석: -log10(P 값; g에 의해 계산됨: Fisher의 단측 테스트를 사용하여 GOSt)을 나타내는 점 크기를 갖는 프로파일러. d–g, Anti-UTX CUT&Tag는 WT 및 UTXNKD NK 세포에서 수행되었으며 5,746개의 고유한 UTX 결합 피크(그룹당 n= 3)를 식별했습니다. d, ATAC-seq에 의해 식별된 차등적으로 접근 가능한(DA) 유전자와 RNA-seq에 의해 식별된 차등적으로 발현된(DE) 유전자의 중첩을 설명하는 Venn 다이어그램. e, UTX 바운드 피크의 위치. f, g, anti-UTX CUT&Tag('anti-UTX'), Bcl2 및 Thy1(f) 및 Ifng 및 Csf2(g)의 ATAC-seq 및 RNA-seq의 UCSC 통합 게놈 브라우저의 대표적인 유전자 트랙; y축은 백만당 개수(CPM)를 나타냅니다. h, 차등적인 UTX 발현 수준이 NK 세포 구성 및 기능에서 성적 이형성의 기초가 되는 방식에 대한 도식(왼쪽). UTX가 항상성 및 바이러스 감염 동안 NK 세포 수 및 이펙터 기능과 관련된 유전자 프로그램을 조절하는 방법에 대한 다이어그램(오른쪽). BioRender.com으로 제작되었습니다.

논의

성별은 바이러스 감염의 결과를 결정하는 데 중요한 생물학적 변수입니다3. 이는 최근 코로나-19에서 나타났는데, 여기서 남성의 성별은 심각한 질병의 주요 위험 요소로 확인되었습니다5. 더욱이, 최근 연구에서는 NK 세포 기능 장애를 심각한 코로나-19 질병과 연관시키는 것으로 나타났습니다49. 항바이러스 면역에서 NK 세포의 중요성을 고려할 때, NK 세포 생물학에서 성별 차이의 근본 원인을 이해하는 것은 내인성 효과기 반응을 최적화하는 데 광범위한 영향을 미칠 것입니다. 이 연구에서 우리는 남성 NK 세포의 낮은 UTX 발현이 숫자 증가와 이펙터 기능 감소에 기여한다는 것을 입증합니다. NK 세포 UTX는 NK 세포 적합성을 제어하고, TF 결합 모티프의 접근성을 조절하고, 효과기 유전자 위치에서 염색질 접근성을 높이고, 바이러스 감염에 대한 신속한 반응을 위해 NK 세포를 준비하는 데 필요합니다.

NK 세포 외에도 B 세포, 단핵구, 호중구, CD{0}} T 세포 및 CD{1}} T 세포에서도 성적 이형성이 보고되었습니다25. 면역 세포의 성별 차이는 이전에 생식선 성호르몬에 의해 매개되는 것으로 보고되었지만50-52 이러한 불균형의 일부는 차별적인 UTX 발현에 기인할 수도 있습니다. 이러한 가능성을 뒷받침하기 위해 UTX 결핍은 T 세포 감소 및 불변 NK T 세포 수53-55와 관련이 있습니다. UTX 전사체는 DICE 데이터베이스56에서 쿼리된 여러 면역 세포 유형(CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 단핵구, B 세포)에 대해 남성 세포와 여성 세포에서 더 낮습니다. 다른 면역 세포 유형의 성별 차이를 조절하는 데 있어 UTX의 역할을 확인하려면 추가 표현형 연구가 필요합니다. NK 세포 매개 효과기 기능에는 사이토카인 생산과 세포독성 분자 발현이 포함됩니다. 우리의 다중 오믹 분석에 따르면 UTX는 이펙터 유전자좌의 접근성과 전사를 증가시켜 바이러스 문제에 신속하게 대응할 수 있도록 NK 세포의 염색질 환경을 조성합니다. 이 연구에서는 UTX에 의해 동시에 결합되고 차등적으로 접근 가능하고 발현되는 191개 유전자(Ifng 및 Csf2 포함)20,32가 밝혀졌습니다. IFN- 및 GM-CSF 사이토카인 생산 감소와 UTX 결핍 NK 세포의 세포용해 능력 손상은 염증 동안 이펙터 기능을 촉진하는 UTX의 역할을 뒷받침합니다. 그러나 차별적으로 발현되지만 UTX에 의해 결합되지 않는 추가 유전자에 의해 입증되는 것처럼 NK 세포 이펙터 기능에서 중요한 역할을 하는 UTX 매개 유전자 조절의 추가적인 간접적인 결과가 있을 수 있습니다.

H3K27me3 탈메틸화효소인 UTX는 활성 유전자 발현을 위해 염색질을 조절합니다. 촉매 활성 외에도 UTX는 다른 후성유전 조절 인자(예: SWI/SNF, MLL4/5 및 p300)와 다중 단백질 복합체에서 기능하여 탈메틸효소 독립적 방식으로 염색질 리모델링을 중재합니다36,57. 우리는 NK 세포의 항상성 및 이펙터 프로그램 조절에 있어 UTX의 탈메틸화효소 독립적 기능을 보고합니다. 이는 데메틸라제 활성이 필요한 불변 NK T 세포에서 UTX의 역할과 대조적입니다. 따라서 UTX 기능을 수행하는 분자 메커니즘은 계통별로 다를 수 있습니다. 이 가설을 뒷받침하기 위해 UTX는 T 세포의 계통 특이적인 TF와 상호 작용하여 효과기 유전자좌를 표적으로 삼는 것으로 보고되었습니다. 우리의 HOMER 모티프 분석은 Runx1, Runx2, Eomes 및 바이러스 감염 중 NK 세포 이펙터 기능에 중요한 기타 TF와의 잠재적인 UTX 상호 작용을 보여주었습니다. 더욱이, 이러한 분석은 또한 KLF1, KLF5, Sp2 및 NK 세포 증식, 분화 및 대사와 관련된 기타 TF와의 UTX 상호작용을 가리킵니다48. 또한, 우리의 결과는 다른 세포 유형의 UTX가 T-bet, Eomes 및 Tbx5(참조 40), ETS1(참조 48) 및 AP-1(참조 48)와의 반응을 조정한다고 보고된 이전에 발표된 연구를 뒷받침합니다. 참조 58). 마지막으로 Runx1은 UTX 규제 BRG1 및 SWI/SNF 복합체와 상호 작용하는 것으로 나타났습니다. 그러나 HOMER 분석의 상관 특성으로 인해 이러한 상호 작용을 현장에서 실험적으로 검증하려면 동시 면역 침전 및 질량 분석법에 대한 추가 연구가 필요합니다. 또한 구성적인 XCI 탈출자로서 UTX는 (i) 존재하는 보조 인자 풀과 (ii) 후성 유전 적 결합 파트너의 가용성이라는 두 가지 가능성을 통해 세포 유형별 메커니즘을 가질 수 있습니다. UTX는 효소 활성에 중요한 보조 인자(예: Fe(II), -케토글루타레이트 및 산소)에 대한 대사 경로의 부산물에 의존합니다. 따라서 대사 상태에 따라 UTX의 탈메틸효소 기능에 접근할 수 있는 별도의 보조인자 풀이 있어 세포 유형에 따라 촉매 활성의 차등 수준을 허용합니다. 또한 UTX의 기능은 상염색체로 인코딩된 결합 파트너(예: MLL3/4, SWI/SNF 및 p300)의 활동 및 발현 수준에 따라 달라질 수도 있습니다.

Desert ginseng-Improve immunity (21)

남성의 면역체계 강화를 위한 시스탄체의 효능

서로 다른 면역 반응을 보이는 환자 하위 집합을 정의하는 가중치를 적용하면 '일률적인' 치료 접근 방식을 넘어 정밀 의학 패러다임으로 이동할 수 있습니다. UTX 결핍은 면역 조절 장애 및 감염 증가와 관련된 두 가지 인간 질환인 가부키 증후군 및 터너 증후군과 관련이 있습니다. 우리의 연구 결과는 인간 NK 세포의 UTX 결핍이 이러한 환자에서 관찰되는 바이러스 면역감시 감소에 기여할 수 있다는 가능성을 제시하지만, 이 가설을 뒷받침하기 위해서는 향후 연구가 필요할 것입니다. 더욱이, 치료 결정에 성별을 생물학적 요인으로 포함시키려면 NK 세포 기능의 성별 차이를 이해하는 것이 필요합니다. 예를 들어 심각한 바이러스 질환을 앓고 있는 남성의 경우 NK 세포 UTX 활동을 강화하면 치료 효과를 얻을 수 있습니다. 우리는 이러한 통찰력이 바이러스 감염의 환경뿐만 아니라 NK 세포가 중요한 역할을 하는 다른 감염 및 암에서도 중요할 것으로 기대합니다. 이러한 발견은 또한 NK 세포가 큰 관심의 대상인 입양 세포 치료에 중요한 의미를 가질 수 있습니다.

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