형광 단백질 항체의 연구 진행 및 응용: 나노바디에 초점을 맞춘 검토

추상적인: 형광 단백질(FP)이 발견된 이후 형광 단백질의 풍부한 형광 스펙트럼과 광화학적 특성으로 인해 생물학 연구 응용이 광범위하게 촉진되었습니다. FP는 녹색형광단백질(GFP)과 그 유도체, 적색형광단백질(RFP)과 그 유도체, 근적외선 FP로 분류할 수 있다. FP의 지속적인 개발로 인해 FP를 표적으로 하는 항체가 등장하게 되었습니다. 면역글로불린의 일종인 항체는 항원을 명시적으로 인식하고 결합하는 체액성 면역의 주요 구성 요소입니다. 단일 B 세포에서 유래하는 단일클론항체는 면역분석, 체외진단, 약물개발 등에 널리 응용되어 왔다. 나노바디는 전체가 중쇄 항체의 가변 도메인으로 구성된 새로운 형태의 항체이다. 기존 항체와 비교하여 이러한 작고 안정적인 나노바디는 살아있는 세포에서 발현되고 기능할 수 있습니다. 또한 표적 표면의 홈, 솔기 또는 숨겨진 항원 에피토프에 쉽게 접근할 수 있습니다. 이 리뷰에서는 다양한 FP에 대한 개요, 항체, 특히 나노바디의 연구 진행 상황, FP를 대상으로 하는 나노바디의 고급 응용 분야를 제공합니다. 이 리뷰는 FP를 표적으로 하는 나노바디에 대한 추가 연구에 도움이 될 것이며 생물학적 연구에서 FP를 더욱 가치있게 만들 것입니다.

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키워드: 형광 단백질; 단일클론항체; 나노바디; 연구 진행; 애플리케이션

1. 소개

형광 단백질(FP)은 생명의학 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 도구 단백질입니다. FP의 사용이 증가함에 따라 FP 항체도 개발되었습니다. 전통적인 항체(그림 1A)와 비교하여 낙타류의 중쇄 항체(HCAb)(그림 1B)와 상어의 면역글로불린 신규 항원 수용체(IgNAR)(그림 1C)에는 자연적으로 경쇄가 부족합니다. 단일 도메인 항체(sdAb)는 HCAb 또는 IgNAR의 가변 도메인으로 완전히 구성된 항체입니다. 분자량은 12-15 kDa로 단일클론 항체 크기의 약 1/10입니다. 따라서 나노바디라고도 합니다. 나노바디는 더 작은 크기, 산과 열에 대한 높은 안정성, 강력한 침투력, 유전공학 및 발현의 용이성, 높은 친화력 등을 갖고 있어 과학연구자들에 의해 다양한 분야에 응용되고 있다. 이는 표적 표면의 홈, 솔기 또는 숨겨진 항원 에피토프에 쉽게 접근할 수 있어 기존 항체가 인식할 수 없는 많은 항원을 인식합니다[1]. 따라서 나노바디는 발달 생물학에서 유기체 및 세포 배양 시스템의 생체분자, 안정 생물학에서 구조적 상태를 위한 결정성 샤페론, 효소 활성의 조절자 또는 억제제, 생화학 분석을 위한 면역조직화학적 시약, 면역블로팅 및 면역형광에서 2차 항체로 사용되어 왔습니다. –6]. FP에 특이적으로 결합하는 나노바디는 세포하 국소화, 세포내 신호 전달 경로 연구, 살아있는 세포 이미징 및 표적 나노물질에 널리 사용됩니다[7-9]. 특히, 나노바디는 초고해상도 이미징에서 기존 IgG 항체에 비해 고유한 장점을 가지고 있습니다.

그림 1. IgG(A), 낙타류 HCAb(B) 및 상어 IgNAR(C)의 구조 다이어그램. 중쇄의 가변 영역인 VH; 경쇄의 가변 영역인 VL; 중쇄의 불변 영역인 CH/C; 경쇄의 불변 영역인 CL; HCAb의 가변 도메인인 VHH; IgNAR의 가변 도메인인 VNAR.

2. 형광단백질의 개요

2.1. 형광 단백질의 발견

발광은 해양 무척추동물에서 흔히 나타나는 현상입니다. 해파리, 히드라, 산호를 포함한 강장동물은 자외선(UV) 또는 청색광 하에서 녹색 형광을 방출하는 반면, 유척동물은 청색 형광을 방출합니다. 녹색 형광 단백질(GFP)은 Shimomura et al.에 의해 Aequorea victoria에서 처음으로 확인되었습니다. 1962년에[10], 1985년에 복제되어 표현되었다[11]. 따라서 야생형 GFP(wtGFP)의 독특한 특성과 안정적인 구조로 인해 많은 연구자들이 이를 연구하고 있습니다. 이후 Tisen과 그의 동료들은 기존 지식과 그 결정 구조를 바탕으로 돌연변이에 의해 서로 다른 형광 특성을 갖는 다양한 GFP 단백질을 생성하고 GFP의 발광 메커니즘을 정교화했습니다 [12]. GFP 관련 연구에서는 GFP를 발견하고 그 응용에 탁월한 공헌을 한 세 명의 과학자(Shimomura, Chalfie, Tsien)가 2008년 노벨 화학상을 수상했습니다.

조상 적색 형광 단백질(RFP), 즉 DsRed는 1999년에 비생물발광 암초 산호에서 복제되었습니다[13]. RFP를 GFP와 함께 사용하면 GFP만으로는 해결할 수 없는 과학적 문제를 해결할 수 있습니다. 가장 중요한 것은 세포 내 이미징에서 RFP의 배경이 낮기 때문에 생명과학 연구에 적용하는 데 더 적합하다는 것입니다[14,15]. 많은 과학자들의 노력으로 FP의 형광 스펙트럼은 전체 가시 영역은 물론 근적외선 영역까지 포괄하는 것으로 보고되었으며, 이는 살아있는 세포의 단백질을 시각화하고 정량화하기 위한 풍부한 도구를 제공합니다[16]. 그림 2는 FP의 개발을 요약합니다.

그림 2. 형광 단백질의 발달. GFP, 녹색 형광 단백질; BFP, 청색 형광 단백질; 강화된 녹색 형광 단백질인 EGFP; YFP, 황색 형광 단백질; RFP, 적색 형광 단백질; VHH, 중쇄의 가변 도메인; VNAR, 가변적인 새로운 항원 수용체. 연한 녹색 마커는 GFP 적용에 대한 연구 진행 상황을 나타내고, 노란색 녹색 마커는 GFP 항체에 대한 연구 진행 상황을 나타냅니다.

2.2. GFP의 구조와 기능적 특성

GFP는 자연적으로 발생하는 구형의 가용성 산성 FP입니다. GFP의 기본 구조는 238개의 아미노산 잔기로 구성된 단량체로 구성되며 분자량은 27~30kDa입니다. 그 결정 구조는 11개의 역평행 사슬로 형성된 중심을 표시하여 원통형의 촘촘하게 채워진 배럴 구조를 형성합니다. 배럴 중심은 -나선에 연결된 4-(p-hydroxybenzylidene)-5-imidazolinone의 발광 그룹으로 보호되며 양쪽 끝은 짧은 -나선 세그먼트로 밀봉됩니다[17,18]. 발색단의 성숙에는 O2 이외의 보조인자가 필요하지 않습니다[19]. GFP는 청색광 또는 UV광을 흡수하고 녹색 형광을 방출하며, 주요 여기 피크는 395nm, 가장 낮은 여기 피크는 475nm, 방출 피크는 509nm입니다. GFP는 매우 안정적이며 고온 처리를 쉽게 견딜 수 있습니다. 포름알데히드 고정이나 파라핀 포매는 형광 특성에 영향을 미치지 않습니다. FP의 구조와 성숙 과정에 대한 심층적인 조사를 통해 점점 더 많은 연구자들이 FP의 구조를 재설계하여 새로운 기능과 특성을 제공하고 개발 및 응용을 더욱 촉진하고 있습니다.

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2.3. GFP 파생상품

GFP 응용 분야의 제한 요소는 pH, 염화물 이온 감도 및 열악한 광안정성입니다. GFP의 표적 수정은 이러한 결함을 수정하여 양자 수율, 밝기, 몰 흡광 계수 및 광안정성을 향상시킵니다. 또한 파란색, 군청색, 청록색, 노란색을 포함하여 방출되는 색상 범위를 넓히기 위해 여러 GFP 파생물이 확립되었습니다.

청색광 여기 하에서 wtGFP의 낮은 형광 강도와 포유류 세포에서의 불안정한 발현에 반응하여 Zhang et al. 는 GFP(F64L 및 S65T)의 아미노산 치환, 즉 형광 강도가 35-배 증가한 향상된 GFP(EGFP)를 설계했습니다[20]. EGFP는 우수한 광안정성과 높은 밝기로 인해 녹색광 영역에서 가장 일반적으로 사용되는 FP 돌연변이로 남아 있습니다. 또한, GFP의 접힘 특성이 최적화되어 슈퍼폴딩 능력을 갖춘 슈퍼폴더 GFP(sfGFP)를 얻었습니다. sfGFP에는 ​​S30R, Y39N, N105T, Y145F, I171V 및 A206V를 포함한 6개의 새로운 돌연변이가 있습니다. sfGFP는 불용성 단백질과 융합하여 발현되는 경우에도 효율적으로 접힐 수 있어 형광의 밝기를 보장합니다[21]. GFP의 또 다른 변형 형태인 GFPuv는 UV 조명 하에서 형광에 최적화되어 있습니다. 이는 395nm의 여기 피크와 509nm의 방출 피크를 갖는 UV 광이 있을 때 더 밝은 녹색 형광을 생성하며 다양한 세포 내 단백질의 위치를 ​​정확히 찾아내는 데 활용될 수 있습니다[22,23]. F99S, M153T 및 V163A를 포함하여 GFPuv에서 세 가지 아미노산 치환이 발생합니다. 이러한 돌연변이는 E. coli에서 wtGFP보다 18-배 더 강한 GFPuv 발현을 유도합니다. GFPuv 유전자는 GFPuv의 효과적인 발현을 보장하기 위해 5개의 저주파 Arg 코돈을 대장균에 적합한 코돈으로 대체한 합성 유전자입니다.

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Y66H의 부위 지정 돌연변이는 384nm의 여기 피크와 ~445nm의 방출 피크를 갖는 청색 형광 단백질(BFP)을 구성합니다. 여기 스펙트럼은 UV광에 가깝기 때문에 작동 중에 세포를 손상시키며, 짧은 방출 파장은 세포에서 자가형광을 유도합니다. 강화된 BFP(EBFP)는 발광성이 약하고 광표백 및 산에 대한 저항성이 낮으며 세포 이미징을 위한 배경 신호가 높습니다. Azurite [24], EBFP2 [25] 및 mTagBFP [26]를 포함하여 세 가지 더 밝은 EBFP 돌연변이가 개발되었으며 이는 1.6-, 2.0- 및 3.{{13} }각각 EBFP보다 몇 배 더 밝습니다. 가장 밝은 BFP인 mTagBFP는 적색 형광 단백질(RFP) TagRFP의 돌연변이체에서 파생되며[27], 소멸 계수는 52,000 M−1 cm−1 및 양자 수율은 {{19 }}.63, 이는 광표백에 대한 저항성을 크게 향상시킵니다. wtGFP에서 Y66F의 돌연변이는 방출 파장이 442nm인 군청색 형광 단백질을 생성합니다[28]. 그러나 GFP-Y66F 변종의 낮은 형광 양자 수율은 이미징에서의 적용 가능성을 심각하게 제한합니다. T65Q, Y145G, H148S 및 T203V의 아미노산 치환으로 GFP-Y66F를 추가로 돌연변이시키면 GFP-Y66F보다 25배 더 밝은 군청색 형광 단백질 Sirius가 생성됩니다[29].

청록색 형광 단백질(CFP)은 449 nm에서 여기 피크를 갖고 ~482 nm에서 방출 피크를 가지며 스펙트럼 특성은 BFP와 EGFP 사이에 있습니다. BFP와 유사하게 Y66W의 부위 지정 돌연변이가 CFP를 구성하는 데 사용됩니다. CFP는 뛰어난 광안정성으로 인해 다색 이미징 및 위치 파악 연구에 폭넓게 응용됩니다. 예를 들어, CFP를 코딩하는 유전자는 인간 코돈 선호도에 맞게 최적화되었으며 현재 AmCyan1(Clontech)이라는 상표명으로 상업적으로 이용 가능합니다. 또한 Cerulean, mTFP(Cerulean의 두 배 밝기) 및 청록색(ECFP의 약 두 배 밝기)과 같이 향상된 CFP(ECFP)보다 더 밝은 여러 돌연변이가 있습니다[21,30].

황색 형광 단백질(YFP)의 돌연변이는 발색단 Y66의 핵심 모티프에 제한되지 않고 구조적으로 Y66에 인접한 잔기에 제한됩니다. YFP의 여기 피크는 ~518nm이고 방출 피크는 ~531nm입니다. GFP와 비교하여 YFP의 형광은 적색 스펙트럼으로 이동하는데, 이는 주로 위치 203에서 Thr이 Tyr로 대체되었기 때문입니다. 향상된 YFP(EYFP)는 세포 내 pH를 감지하기 위해 가장 형광성이 있고 광범위하게 활용되는 FP 바이오센서 중 하나입니다. 염화물 이온 농도. 그러나 이는 산 및 염화물 이온에 매우 취약하며 많은 해파리 유래 FP보다 광안정성이 낮습니다[31]. EYFP의 개선된 버전인 mCitrine과 mVenus는 현재 가장 많이 사용되는 YFP입니다[32,33]. GFP와 그 파생물의 광물리적 특성은 표 1에 요약되어 있습니다.

표 1. GFP, RFP 및 그 파생물의 광물리적 특성.

표 1. 계속

2.4. RFP 파생상품

RFP는 널리 사용되는 또 다른 FP입니다. DsRed는 단백질 융합을 수행할 때 다량체를 형성하는 경향이 있고 세포 내에서 발현될 때 독성을 나타낼 수 있는 사량체이므로 단량체를 얻도록 조작되었습니다. 가장 주목할만한 RFP는 mCherry, mBanana, mOrange, dTomato, mTangerine 및 mStrawberry(표 1)를 포함하는 "mFruit" 제품군이며, 그 중 K163Q 및 K83L의 돌연변이가 있는 mCherry가 가장 선호됩니다. mCherry는 덜 밝지만 빠른 성숙, 우수한 단량체 특성 및 더 나은 광안정성을 갖습니다[34]. 그러나 단량체 형태의 TagRFP는 mCherry보다 약 3~4배 밝으므로 현재 사용할 수 있는 상대적으로 밝은 단량체 RFP입니다[27]. mKate는 588nm의 여기 피크와 635nm의 방출 피크를 갖는 TagRFP의 4개 부위 돌연변이에서 파생된 새로운 단량체 원적외선 형광 단백질로 EGFP만큼 밝습니다. 이량체화 단백질인 Katushka는 EGFP보다 67% 더 밝습니다[35]. V38A, S165A 및 K238R의 아미노산 치환을 갖는 mKate의 돌연변이체인 mKate2는 mKate의 밝기가 약 두 배입니다[36]. GFP 및 RFP와 비교하여 mKate 및 Katushka는 개체 내 형광 이미징에 대해 더 나은 이미징 깊이와 풍부한 광학 신호를 나타냅니다[35]. 따라서 원적외선 형광 단백질을 개발하는 것은 생체 내 바이오이미징에 더 가치가 있습니다.

2.5. 근적외선 FP

근적외선(NIR) FP는 이미징 응용 분야에서 단백질 태그로 매우 요구됩니다. 대부분의 NIR FP는 박테리아 피토크롬 광수용체(BphP)로 설계되었습니다[37]. 살아있는 동물 영상화에 사용되는 최초의 NIR FP는 BphP에서 유래된 형광 단백질인 IFP1.4이며 BV(biliverdin) 발색단에 결합하여 형광을 발합니다[38]. DNA 섞기와 무작위 돌연변이 유발에 의해 더 밝은 IFP2.0가 개발됩니다[39]. 단량체 IFP1.4 및 IFP2.0는 BphP의 이량체화 경계면을 깨뜨려 달성할 수 있지만 여전히 고농도에서 이량체화하는 경향이 있습니다. 천연 단량체 적외선 형광 단백질(IFP)인 mIFP가 2015년에 설계되었습니다[40]. mIFP는 초파리 유충과 뉴런에 사운드 이미징 효과가 있는 것으로 입증되었습니다. Shcherbakovaet al. 는 miRFP670, miRFP703 및 miRFP709라는 뚜렷한 스펙트럼을 가진 세 가지 밝은 단량체 NIR FP를 설계했습니다[41]. BphP 유래 NIR FP는 BV 발색단을 공유적으로 부착하고 복잡한 "8자형 매듭" 구조를 보유하기 위해 최소한 PAS(Per-ARNT-Sim) 및 GAF(cGMP 포스포디에스테라제-아데닐레이트 시클라제-FhlA)의 두 도메인이 필요합니다. 접힘에 영향을 미치는 GAF 및 PAS 도메인을 위상적으로 연결합니다. 따라서 또 다른 종류의 박테리아 광수용체인 알로피코시아닌(APC)이 smURFP와 같은 NIR FP를 조작하는 데 사용됩니다[42]. APC 기반 NIR FP는 더 작지만 BV와 덜 효율적으로 결합하여 BphP 기반 NIR FP보다 포유류 세포의 밝기가 현저히 낮습니다. BphP 및 APC 기반 NIR FP의 결함을 극복하기 위해 miRFP670nano라는 단일 도메인 NIR FP가 시아노박테리오크롬(CBCR)에서 개발되었습니다. 이는 내인성 BV 발색단을 효율적으로 결합하고 밝은 형광을 방출할 수 있는 최초의 CBCR 유래 NIR FP를 나타냅니다. 포유류 세포 [43]. BphP 유래 NIR FP에 비해 miRFP670nano의 필수적인 장점은 높은 광안정성입니다. 부모 miRFP670nano에 비해 14개의 돌연변이가 있는 향상된 miRFP670nano3은 miRFP670nano와 유사한 광안정성을 나타냅니다[44]. 표 2에는 NIR FP의 광물리적 특성이 요약되어 있습니다.

표 2. NIR FP의 광물리적 특성

FP의 발견과 적용은 현대 생물학을 위한 강력한 연구 도구를 제공했습니다. 오늘날 FP는 과학자들이 유전자 발현 조절, 소기관 라벨링, 신호 전달, 약물 스크리닝 및 생체 분자 상호 작용과 같은 많은 연구 분야로 응용 프로그램을 확장하는 데 사용하는 일반적인 도구 중 하나가 되었습니다. FP를 발현하는 대부분의 클로닝 벡터는 상업화되었으며 상업 회사를 통해 이용 가능합니다.

3. 형광단백질 항체에 대한 연구 진행

3.1. 형광 단백질을 표적으로 하는 단일클론항체

항체는 B림프구에서 분비되는 면역글로불린의 일종이다. 단일클론항체는 2개의 중쇄와 2개의 경쇄로 구성되며, 중쇄는 1개의 가변영역(VH)과 3개의 불변영역(CH)으로 구성되고, 경쇄는 1개의 가변영역(VL)과 1개의 불변영역(CL)으로 구성됩니다. ). 중쇄는 이황화 결합으로 공유적으로 연결되어 있고, 경쇄의 CL 영역은 중쇄의 CH1 도메인과 비공유적으로 연결되어 안정적인 항체 분자를 형성한다[45]. 특정 수용체 ​​결합 능력으로 인해 단일클론 항체는 고전적 차단, 중화, 보체 활성화, Fc 수용체를 통한 표적 세포 살해 및 면역 활동 조절과 같은 다양한 생물학적 활동을 생성합니다. 이들은 면역분석, 체외 진단 및 약물 개발에 널리 적용되는 중요한 생물학적 거대분자입니다. 다클론 항체는 여러 B 세포의 면역반응 과정에서 유래된 이형 항체의 혼합물로, 각 항체는 동일한 항원의 서로 다른 에피토프를 인식한다[45]. 다클론 항체와 비교하여 단클론 항체는 항원의 에피토프를 특이적으로 검출하고 다른 단백질과 교차 반응할 가능성이 적으므로 낮은 배경 염색 신호를 생성합니다. 또한, 동일한 실험 조건에서 단일클론항체에 대한 결과의 재현성은 다중클론항체에 비해 더 높습니다.

GFP is a unique in vivo reporter that can be analyzed for gene expression in many species. Gengyoando and Mitani used the glutathione-S-transferase (GST) fusion protein, which contains the full-length GFP coding region and a synthetic peptide corresponding to residues Ser208-His217 of GFP, as an immunogen to create the monoclonal antibody 65B12 against GFP [46]. Immunoblot analysis demonstrates that 65B12 specifically bound the GFP fusion protein. Furthermore, it can recognize the fluorescent cells in transgenic animals expressing the uric-86-gfp reporter construct; hence, it can be applied in immunohistochemistry. Zhuang et al. developed an improved method to purify GFP protein [47]. The monoclonal antibody against GFP, FMU-GFP.5, was prepared by immunizing mice using purified GFP as an antigen. GFP with high purity (>97% homogeneity) and sample yield (>90%)는 mAb FMU-GFP를 사용하는 간단한 2-단계 기술을 사용하여 정제됩니다.5-결합된 Sepharose 4B 수지. 또한, GFP에 결합된 모든 기능성 재조합 표적 단백질은 GFP 에피토프 덕분에 세포에서 쉽고 직접적으로 분리될 수 있습니다. 이러한 데이터는 이 방법이 사용 가능한 방법보다 GFP를 정제하는 데 더 효과적이며 대부분의 GFP 정제 방법에서 낮은 수율 및 순도 문제를 해결한다는 것을 시사합니다.

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3.2. 형광 단백질을 표적으로 하는 나노바디

3.2.1. 나노바디 소개

큰 분자량, 복잡한 구조 및 제한된 생물학적 활성과 같은 단일클론 항체의 고유한 특성으로 인해 추가 적용이 점점 더 제한되고 있습니다. 따라서 단일클론항체를 대체할 항체 개발이 시급하다. 1989년에 Ward et al. 라이소자임에 대한 결합 능력이 약한 중쇄 단독 항체의 가변 도메인을 제조하여 sdAb 연구에 대한 관심이 급증했습니다[48]. 1993년 Hamers Casterman et al. 낙타 혈청에서 처음으로 전통적인 포유류 항체와는 전혀 다른 새로운 유형의 항체를 발견했습니다 [49]. 이러한 유형의 항체는 자연적으로 경쇄가 부족하기 때문에 HCAb로 명명됩니다. HCAb는 CH2, CH3, 힌지 영역 및 HCAb의 가변 도메인(VHH)으로 구성되어 있지만 여전히 완전한 항원 결합 능력을 가지고 있습니다. 1995년에 Greenberg et al. 간호사 상어에서 IgNAR로 알려진 중쇄 전용 항체를 발견했습니다 [50]. 이는 분비형과 막 결합 형태로 존재하며 VNAR(가변 신규 항원 수용체)이라는 가변 영역과 여러 불변 영역으로 구성됩니다. 그 후, IgNAR은 워베공상어, 가시개상어, 뿔상어, 흰반점대나무상어에서 발견되어 sdAbs 레퍼토리를 보완합니다. 나노바디는 작은 분자량, 높은 친화력, 강한 안정성, 우수한 용해도, 강한 조직 침투, 숨겨진 항원 에피토프 인식 등의 특성을 가지고 있습니다. 이는 질병 진단, 면역 시약, 병원체 탐지 및 약물 개발에서 점점 더 많은 관심을 끌고 있습니다[51]. 분자생물학 기술의 발전과 유전자 조작 항체 제조 기술의 향상으로 나노바디는 면역분석 분야에서 인기 있는 연구 분야가 되었습니다. 그림 3은 현재까지의 나노바디 개발 과정을 요약한 것이다.

그림 3. 나노바디의 개발. 연한 파란색 마커는 나노바디 약물에 대한 연구 진행 상황을 나타냅니다. FDA, 식품의약청; EMA, 유럽의약품청; NMPA, 국립 의약품 관리청; HCAb, 중쇄 항체; IgNAR, Ig 새로운 항원 수용체; sdAb, 단일 도메인 항체; VHH, HCAb의 가변 도메인; VNAR, IgNAR의 가변 도메인; PD-L1, 프로그램된 세포 사멸 1 리간드 1.

3.2.2. 형광 단백질을 표적으로 하는 나노바디

형광 단백질은 사용하기 쉬운 유전자 인코딩 형광 단백질 마커를 제공함으로써 세포 생물학과 생화학을 변화시켰습니다. 병행 개발 중 단백질 골격 라이브러리의 합성 및 선택을 통해 연구 및 약물 표적을 위한 여러 가지 단단한 결합제가 개발되었습니다[52]. 향상된 안정성, 용해도 및 수율로 선택이 더 쉬운 나노바디의 개발이 그 예입니다[53]. 전통적인 항체와 달리 이 작고 안정적인 나노바디는 살아있는 세포에서 기능을 발휘합니다. 따라서 FP에 대한 특이적 결합 활성을 갖는 나노바디는 다양한 생물학 연구 분야에서 FP 융합, 분리 및 세포 공학을 위한 강력한 도구입니다.

• GFP를 표적으로 하는 낙타과 유래 나노바디

탁월한 세포하 위치 파악 특성을 지닌 다양한 단백질이 GFP에 융합되어 다양한 세포하 구획에서 단백질을 직접 검출할 수 있는 시각적 항원을 생성합니다. 2006년 Rothbauer et al. 알파카를 GFP로 면역화하여 GFP 특이적 항체 단편(cAbGFP4)을 스크리닝했습니다[54]. cAbGFP4와 GFP 항원 사이의 상호작용에 대한 표면 플라즈몬 공명 분석(SPR)은 높은 친화도(KD=0.23 nM)를 나타냈습니다. 또한 항-GFP 나노바디를 단량체 RFP와 결합하여 살아있는 세포에서 항-GFP 나노바디의 분포를 조사하는 데 사용되는 가시적인 GFP 결합 항체를 생성했습니다. 겔 여과, 면역블롯팅 및 공초점 현미경 분석을 통해 GFP 특이적 나노바디는 단일 사슬 가변 단편에서 일반적으로 발견되는 검출 가능한 단백질 분해 또는 응집 없이 포유류 세포에 안정적으로 분포되는 것으로 입증되었습니다. 또한 Kubala et al. X-선 결정학 및 등온 적정 열량계(ITC)를 통해 GFP:cAbGFP4 복합체(그림 4A)를 특성화하여 단백질 결합에서 나노바디의 높은 친화력과 특이성에 대한 기초를 밝혔습니다. 2020년에는 A12, B9, D5 및 E6으로 명명된 4가지 별개의 항-GFP 나노바디가 파지 디스플레이를 사용하여 확인되었습니다[56]. 기본 PAGE 및 면역침강 분석을 통해 이러한 나노바디가 시험관 내 및 생체 내에서 GFP에 결합할 수 있음이 밝혀졌습니다.

그림 4. GFP-나노바디 복합체의 다이어그램. (A) cAbGFP4(PDB:3OGO, 주황색); (B) GBP1(PDB: 3K1K, 연한 파란색); (C) GBP4(PDB: 3G9A, 핑크); (D) LaG16(PDB: 6LR7, 노란색); (E) NbsGFP02(PDB: 7E53, 마젠타). (F) 위의 나노바디와 GFP 복합체의 구조적 중첩. GFP는 녹색으로 표시됩니다.

단백질 형태는 기능과 밀접하게 관련되어 있으며 일반적으로 규제 요인에 의해 제어됩니다. Axelet al. 7개의 GFP-특이적 결합제, 즉 GFP-결합 단백질(GBP) 1-7을 확인했습니다[57]. 그중 GBP1은 GFP 형광을 10-배 증가시킨 반면, GBP4는 GFP 형광을 5-배 감소시켰습니다. 따라서 이들은 각각 "강화제" 및 "최소화제"로 지칭되었습니다. GFP-나노바디 복합체의 구조 분석(그림 4B, C)은 두 개의 나노바디가 발색단 환경에서 약간의 반대되는 변화를 일으켜 흡수 특성을 변경시키는 것으로 나타났습니다 [58]. 또한, 25개의 GFP 특정 나노바디(LaG)가 확인되었으며, KD 값은 0.5 nM에서 20 μM 이상까지 다양합니다[59]. 2가 나노바디(LaG-16-LaG-2)는 KD 값이 36pM으로 가장 높은 친화성을 나타냈습니다. 또한, 과량의 LaG 단백질과 함께 배양하면 GFP의 최대 형광 강도가 ~60% 증가했습니다. Zhang et al. 1.67Å 분해능에서 LaG16(그림 4D)과 복합체를 형성한 GFPuv의 결정 구조를 보고했습니다[60]. GFP-배럴의 LaG16 결합 부위는 GFP 인핸서의 반대편에 위치했습니다. 따라서 LaG16과 GFP-enhancer는 (GS)4 링커와 융합되었습니다. 2가 나노바디는 0.5nM의 친화도를 가졌으며, 이는 서로 다른 에피토프와 결합하는 2개의 나노바디의 이량체화를 통해 초고친화도 표적 단백질 결합제 설계의 타당성을 입증했습니다.

2014년에 TWair et al. sfGFP를 준비하고 성체 외벌 낙타를 면역시켰습니다. 3개의 에피토프(NbsfGFP01, 02, 03, 04, 06, 07 및 08)를 표적으로 하는 7개의 항-sfGFP 나노바디가 분리되었습니다[61]. ELISA 및 면역 블로팅 분석을 기반으로 이 나노바디는 유리 또는 성장 호르몬에 융합된 것으로 표지된 sfGFP를 인식했습니다. 또한, sfGFP와 복합체화된 나노바디 NbsfGFP02의 결정 구조(그림 4E)는 2.2Å의 해상도로 확립되었습니다. NbsfGFP02와 sfGFP 사이의 친화도는 생물층 간섭계(BLI)에 의해 15.8nM인 것으로 결정되었습니다. NbsfGFP02의 용융 온도는 75.6도였으며[62]; 따라서 이는 가혹한 테스트 조건을 요구하는 응용 분야에서 유망한 GFP 나노바디 후보입니다. 대부분의 나노바디는 진핵 세포로의 플라스미드 형질감염을 통해 생체 내에서 기능적으로 발현될 수 있습니다. 따라서 나노바디는 살아있는 세포의 구조적 또는 동적 특징을 식별하는 데 탁월한 도구입니다. 2020년에 Zhou et al. 나노바디-mCherry라고 불리는 시험관 내 전사(IVT) mRNA로서 구성된 GFP 결합 나노바디(cAbGFP4)를 발현하는 새로운 방법을 제안했습니다[63]. 번역되지 않은 영역과 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 및 폴리(A) 꼬리로 캡핑된 역캡 유사체를 갖는 mRNA를 시험관 내에서 제조하여 형질감염에 사용했습니다. 플라스미드 DNA를 사용하여 발현된 나노바디와 달리, IVT mRNA를 사용하여 발현된 항-GFP 나노바디는 형질감염 3시간 이내에 확인되었으며 48시간 이내에 분해되었습니다. 따라서, 살아있는 세포에서 나노바디의 암호화된 mRNA를 발현시키는 것은 나노바디의 효율적인 전달을 가능하게 한다.

• GFP를 표적으로 하는 상어 유래 나노바디.

Weiet al. 는 대나무 상어가 림프구 수의 증가와 항원 특이적 IgNAR을 특징으로 하는 GFP 면역화에 대해 효과적인 면역 반응을 일으킨다는 것을 입증했습니다[64]. BsG3, 73, 80, 89, 93, 98 및 105를 포함하여 최대 0.3nM의 친화도를 갖는 총 7개의 항-GFP 나노바디가 면역화된 대나무 상어로부터 분리되었으며, 이는 대나무 상어가 고친화성 IgNAR을 제조합니다. 또한, GFP에 대한 가장 높은 친화도(20.7 pM)를 갖는 이중 파라토프 VNAR이 구축되었으며, 항-GFP 나노바디의 인트라바디 특성이 포유동물 세포에서 검증되었습니다. 이러한 발견은 대나무 상어 sdAbs의 연구 및 진행을 가속화하여 생물 의학 산업에 저렴하고 사용하기 쉬운 나노바디를 제공할 것입니다.

• 다른 형광 단백질을 표적으로 하는 나노바디.

Masabi는 밝은 단일체 녹색 형광 단백질입니다. Li et al. mWasabi를 항원으로 사용하여 낙타를 면역화하여 4 x 107 형질전환체의 항체 라이브러리를 성공적으로 구축하고 Nb4, Nb6 및 Nb27이라고 불리는 3개의 고친화도 mWasabi 특정 나노바디를 스크리닝했습니다[65]. 이러한 나노바디는 와사비만 인식하거나 프로그램 사망 1(PD{10}})과 결합하여 인식했습니다. 특이성이 높은 mCherry를 표적으로 하는 총 6개의 나노바디(LaM)가 확인되었으며 KD 값은 0.18nM에서 63nM 범위였습니다[59]. 또한, 나노몰 결합 친화도를 갖는 3개의 iRFP713-특이적 나노바디(BSR1, BSR3 및 BSR4)가 분리되었습니다[64]. 이러한 데이터는 대나무 상어의 면역화가 친화도가 높은 나노바디를 생산할 수 있음을 시사합니다. 전반적으로, 세포 단백질을 결합하고 FP 융합 단백질을 유인하는 나노바디의 능력은 살아있는 세포의 세포 과정과 구조를 정밀하게 제어할 수 있게 해줍니다. 이 다기능 FP-nano 트랩은 동일한 단백질의 독특한 조합으로 현미경, 생화학적, 기능적 분석을 가능하게 합니다. FP를 표적으로 하는 나노바디는 표 3에 요약되어 있습니다.

표 3. FP를 표적으로 하는 나노바디의 요약

4. 형광단백질나노바디의 응용

4.1. 단백질 검출의 응용

4.1.1. 세포내 단백질의 검출

단백질 기능을 이해하려면 신뢰할 수 있고 정량화 가능한 고해상도 단백질 위치 파악이 필요합니다. 표적 단백질을 표지하기 위해 항체를 사용하는 것이 분자 생물학에서 잘 확립되어 있지만 이 기술은 기존 항체의 크기와 다중성에 의해 제한됩니다. 나노바디의 크기가 작기 때문에 형광 분자, 효소, 펩타이드, 수용체, 비오틴 및 기타 약물과 연결한 후 세포내 이미징을 위한 추적자로 사용할 수 있습니다. 예를 들어, FP에 대한 나노바디는 유기 염료로 태그를 붙일 때 초고해상도 현미경 이미징에 사용되었습니다[66,67]. 튜불린 YFP를 지속적으로 발현하는 Ptk2 세포는 이 접근법을 사용하여 이미지화되었으며 해상도는 기존 항체의 약 450Å과 달리 269 ± 37Å으로 향상되었습니다.

나노바디 매개 라벨링은 정교한 단일 분자 국소화 현미경(SMLM) 이미징을 위해 일반적으로 접근 가능한 거의 모든 FP 유래 융합 구조에 라벨을 붙이는 빠르고 다양한 방법을 제공합니다. 구체적으로, 2색 SMLM은 GFP 및 RFP에 대한 나노바디가 동시에 사용될 때 기능적 GFP 및 RFP 융합 구조물의 세포내 위치를 조사할 수 있습니다[68]. 따라서 2색 SMLM 이미징을 사용하면 수많은 생물학적 문제를 신속하게 해결할 수 있습니다. Ariottiet al. 는 효소 기반 단백질 라벨링을 위한 모듈식 접근 방식을 제안하여 EM-분해능에 대한 세포 내 단백질 분포를 분석하기 위한 속도와 샘플링을 향상시켰습니다[7]. 변형된 대두 아스코르베이트 퍼옥시다제(APEX) 태그에 GBP4를 직접 설계함으로써 APEX가 관심 있는 모든 GFP 표지 단백질로 향할 수 있음이 나타났습니다. APEX-GBP4 융합은 소기관 하위 도메인에 주목할만한 고해상도 단백질 위치를 제공하고 세포 내 단백질 분포를 특성화하는 시간을 크게 단축합니다. 또한, 내인성 수준에서 발현되는 GFP 표지 단백질의 EM 분해를 허용합니다.

FP 특정 나노바디 코딩 플라스미드의 도구 상자가 생성되어 기능 모듈에 융합되었습니다. 이 도구 상자를 사용하면 살아있는 세포의 세포내 신호 전달 경로를 시각화하고 조작할 수 있어 생체 내 용도가 크게 확장됩니다[9]. 여기에는 Ca2+, H+ 및 ATP/ADP의 동적 시각화를 위한 형광 센서와 단백질 모집 또는 분리 및 소기관 간 막 접촉 부위의 인식을 허용하는 올리고머 또는 이종이량체 모듈이 포함됩니다. 2017년에 Herce et al. 면역 표지 및 항원 조작을 위해 항체를 세포로 직접 운반하기 위해 세포 투과 펩타이드(CPP)를 사용했습니다[69]. 핵소체에서 RNA에 대한 고리형 아르기닌이 풍부한 CPP의 높은 친화력을 활용하는 시스템이 구축되었습니다. 순환 아르기닌이 풍부한 CPP를 GFP 나노바디에 연결함으로써 핵소체에서 GFP의 재국재화를 세포에서 직접 관찰할 수 있습니다(그림 5A). 따라서 이 시각화된 시스템은 단백질의 위치를 ​​추적하고 다양한 CPP의 효율성을 정량적으로 비교하는 데 사용할 수 있습니다.

FRET(형광 공명 에너지 전달) 기술은 살아있는 세포의 생리학적 조건에서 신호 분자를 동적으로 실시간 감지할 수 있기 때문에 생명과학 연구에 널리 사용됩니다. 뛰어난 감도와 특이성으로 인해 시간 분해 Förster 공명 에너지 전달(TR-FRET) 기반 분석은 생물 의학 연구에서 점점 인기를 얻고 있습니다. 나노바디 기반 TR-FRET 방법을 사용하면 기존 형광 강도 판독보다 훨씬 높은 감도로 용해물에서 형광(융합) 단백질을 쉽게 정량화할 수 있습니다[70].

그림 5. 형광단백질 나노바디의 응용. (A) 단백질-단백질 상호작용의 시각화. 세포 투과 펩타이드(CPP)에 결합된 항-GFP 나노바디(Nb)는 세포핵을 침투할 수 있습니다. GFP 태그가 붙은 단백질이 RFP 태그가 붙은 단백질과 상호 작용하지 않으면 GFP 태그가 붙은 단백질만 Nb-CPP를 통해 핵소체에 다시 위치하여 녹색을 나타냅니다. 그러나 두 단백질이 상호작용하면 두 단백질 모두 핵소체에 다시 위치하여 노란색을 나타냅니다. (B) GFP 나노바디는 새로 세포외로 방출된 소포 단백질의 선택적 라벨링을 가능하게 합니다. 1단계: 소포 단백질은 GFP에 결합되고 비형광 나노바디(NbGFP)와 함께 배양되어 형광 결합 나노바디(NbGFP*)와 GFP의 접근이 불가능해집니다. 단계 2 및 3: 세포 세포외유출의 자극 후, 새로운 소포 단백질이 원형질막에 노출되고 NbGFP*로 표지될 수 있습니다. (C) 저하의 개략적 그림. 단백질 선택적 분해는 복잡한 일련의 효소에 의해 수행되는 유비퀴틴 경로를 통해 수행됩니다. SKP1-CUL1-F-box 단백질 리가제 복합체(SCF)에 있는 F-box 단백질(FBP)이 항-GFP 나노바디(Nb)와 융합되어 GFP 융합 단백질을 인식하고, 유비퀴틴 결합 효소(E2)는 여러 유비퀴틴 분자를 표적 단백질에 공유 결합으로 연결합니다. 그 후, 폴리유비퀴틴화된 단백질은 프로테아좀에 의해 분해됩니다. (D) BiCAP의 개략적 설명. HER 단백질은 GFP의 N 말단(GFP1) 또는 C 말단(GFP2) 단편에 융합됩니다. 두 융합체가 이합체를 형성하면 GFP는 다시 접히고 형광을 발합니다. 그런 다음 HER 이합체와 그 상호 작용 단백질은 GFP 단편에 대한 결합 능력이 없으므로 이합체의 분리를 가능하게 하는 GFP 나노바디를 사용하여 농축됩니다. (E) GFP 의존 전사 시스템. DNA 결합 도메인(DBD)과 활성화 도메인(AD)은 각각 GFP 나노바디 1(Nb1) 및 GFP 나노바디 2(Nb2)와 융합됩니다. GFP가 있는 경우 DBD-Nb1 및 AD-Nb2는 UAS(상류 활성화 서열) 리포터 유전자를 활성화하여 표적 유전자의 상향 조절을 유도할 수 있습니다. (F) DNA 나노구조에서 GFP 표지 단백질의 인식. 2개의 결합 부위가 있는 DNA 나노 구조를 자성 수지에 연결하고 상보적인 염기쌍을 통해 GFP 나노바디(Nb)와 결합한 다음 GFP 표지 단백질과 함께 배양합니다. 따라서 GFP로 표지된 단백질은 나노구조에 정확하게 부착될 수 있습니다.

그림 5. 계속

4.1.2. 세포 표면의 단백질 검출

박테리아 표면 디스플레이는 세포 고정 단백질을 생산하고 전체 세포 촉매를 설계하는 유망한 기술입니다. 다양한 외부 막 단백질이 표면 디스플레이에 사용되지만 표면 디스플레이 시스템을 평가하고 개발하는 데 사용할 수 있는 간단하고 보편적이며 처리량이 높은 호환 ​​방법은 없습니다. 또한, 세포 내 단백질과 표면 표시 단백질을 구별하는 것도 어렵습니다. Wendelet al. GFP-나노바디를 외부 막 앵커에 융합시켜 형광 기반 표면 디스플레이 감지 시스템을 구축했습니다[71]. 일반적으로 사용되는 두 가지 외부 막 단백질인 외부 막 단백질 A(OmpA)와 자가수송체(C-IgAP)가 앵커로 선택되었습니다. 따라서 OmpA 또는 C-IgAP를 GFP 특정 나노바디와 융합하여 두 개의 서로 다른 디스플레이 모듈을 구성하고 외부에서 정제된 GFP를 추가하여 시각화합니다. GFP 자체가 세포 표면에 표시될 수 있지만 이 새로운 방법은 GFP가 세포 표면에 제시된 나노바디에 결합하는 경우에만 세포가 형광 신호를 생성할 수 있기 때문에 위양성 문제를 방지합니다. 이 분석은 플레이트의 전체 세포 형광 검출, 젤 내 형광, 현미경 검사 및 유세포 분석을 포함한 다양한 형광 검출 방법과 호환됩니다. 이 저렴하고 읽기 쉬운 표면 표시 방법은 단백질이 살아있는 세포 표면으로 이동하는 메커니즘을 입증하는 데 도움이 될 것이며, 향후 박테리아 표면 표시 시스템과 강력한 전세포 생체촉매의 합리적인 개발을 가능하게 할 것입니다.

신경전달물질의 방출에는 세포외유출, 세포내이입 및 새로운 융합 소포의 형성이 필요합니다. 세포외유출 후 소포 단백질이 원형질막에 남아 있을 때 어떤 일이 일어나는지는 잘 알려져 있지 않습니다. 이러한 단백질은 pH에 민감한 GFP 부분(불소)에 자주 결합됩니다. pHluorin 이미징은 일반적으로 소포보다 몇 배 더 큰 반점의 회절에 의해 제한되므로 항-GFP 나노바디를 사용하여 세포 밖으로 나온 소포를 선택적으로 라벨링하는 것이 중요합니다[72]. 항-GFP 나노바디를 초고해상도 이미징에 적합한 화학 형광단에 연결함으로써 다양한 조건에서 pHluorin으로 표지된 단백질의 크기와 강도를 pHluorin만으로는 불가능한 방식으로 감지할 수 있습니다. 세포외유출이 자극되면 새로운 소포 단백질이 원형질막에 노출되고 형광 표지된 나노바디가 pHluorin과 결합합니다(그림 5B). 따라서 나노바디 기반 pHluorin 검출은 뉴런에서 세포외유출 후 사건을 연구하기 위한 유망한 도구입니다.

4.2. 단백질 분자의 표적 분해에 대한 응용

유전자 편집 및 RNA 간섭과 비교하여, 단백질 수준에서 생체분자를 직접 조작하는 것은 단백질 기능 연구를 위한 보다 효율적인 경로이며, 잠재적인 오프 타겟 효과, 유전자 불활성화 및 필수 유전자 표현형 기능의 손실과 같은 한계를 극복합니다. 표적 단백질 분해는 현재 관심 있는 단백질의 기능 손실과 단백질 분해를 달성하기 위한 주요 연구 전략입니다. 나노바디 기반 단백질 분해제는 관심 단백질의 신속한 분해와 가역적 조절을 달성하는 데 도움이 될 수 있습니다. Caussinuset al. 모든 진핵 시스템에서 표적 GFP 융합 단백질을 직접적이고 신속하게 고갈시키기 위한 단백질 분해 방법을 개발했습니다[73]. 간단히 말해서, GFP 융합 단백질을 녹다운하기 위해 항-GFP 나노바디가 SKP1-CUL1-F-box 단백질(SCF) E3 리가제 복합체의 F-box 단백질(FBP)에 융합됩니다. GFP 융합 단백질을 인식합니다. 유비퀴틴 결합 효소(E2)는 여러 유비퀴틴 분자를 표적 GFP 융합 단백질에 공유적으로 연결합니다. 그 후, SCF 복합체는 폴리유비퀴틴화된 단백질을 분해합니다. 따라서 표적 단백질을 제거하는 것은 모니터링하기 쉽습니다(그림 5C). 녹색 형광 단백질 분해(deGradFP)라고 불리는 이 기술은 포유류 세포, 제브라피시 배아[74] 및 식물[75]에서 GFP 및 그 융합체의 분해에 사용되었습니다.

4.3. 이분자 보완 친화성 정제 시스템의 응용

2016년에 Croucher et al. 인간 표피 성장 인자 수용체(HER) 이량체(동종 및 이종)를 단량체와 효과적으로 구별할 수 있는 이중 분자 보완 친화성 정제 시스템(BiCAP)을 개발했습니다[76]. 이 시스템에서는 FP 분자의 두 상보적 단편이 두 개의 HER 단백질(HER1, HER2 또는 HER3)과 융합됩니다. 이 두 조각은 자발적으로 활성 형광 단백질로 조립될 수 없습니다. 그러나 두 HER 단백질이 서로 상호작용한다고 가정해 보겠습니다. 이 경우 두 조각은 공간적으로 서로 가깝고 보완적이며 완전하고 활성인 형광 단백질로 재구성됩니다(그림5D). HER 이량체와 그 상호 작용 단백질은 GFP 단편에 대한 친화력이 없는 GFP 나노바디를 사용하여 농축될 수 있으므로 이량체의 분리 및 농축이 가능합니다. 확인된 단백질을 분석함으로써 3개의 이량체(HER2:HER2, HER2:HER3 및 HER1:HER2)가 공통 상호작용 단백질과 그들의 특정 상호작용체를 가지고 있음이 밝혀졌습니다. HER1:HER3 이량체와 특이적으로 상호작용하는 단백질인 FAM59A는 세포외 신호 조절 키나제 경로의 활성화를 매개하여 유방암 치료를 위한 새로운 표적을 제공합니다.

시스탄체 식물의 면역 체계 증가

4.4. 다른 분야의 응용

질병의 조기 체외 진단과 치료 효과의 모니터링은 질병 진단의 주요 문제입니다. 이상적인 조영제는 조직 침투가 양호하고, 항원 친화력이 높으며, 정상 조직에 손상을 최소화하면서 신속한 제거 능력을 갖추어야 합니다. 나노바디는 더 나은 영상화 및 치료 응용을 위해 혈관을 통과하고 조직에 들어갈 수 있는 이상적인 영상화제로서의 잠재력을 가지고 있습니다.

FP는 세포와 생물학적 과정을 밝힐 뿐만 아니라 수많은 숙주 단백질 네트워크와의 연결이 명백히 부족하기 때문에 탁월한 지지체를 만듭니다. GBP와 GFP를 발판으로 사용하여 생물학적 활성 복합체 형성을 유도하는 Tang et al. GFP 및 그 파생물의 존재 하에서 유전자 발현을 독점적으로 제어하는 ​​하이브리드 전사 인자 라이브러리를 만들었습니다[77]. GFP의 생산은 세포 특이적 유전자의 발현을 제어하고(그림 5E) 마우스 망막과 뇌의 기능 장애를 촉진합니다. 또한, GFP 형질전환 마우스와 제브라피시 계통은 신경 회로의 광유전학적 모니터링을 위한 GFP 의존 전사를 달성하도록 변형되었습니다. 이 연구는 GFP의 위치를 ​​다용도 스캐폴드로 확립하고 형질전환 균주에서 다양한 GFP 태그가 붙은 세포를 선택적으로 조작할 수 있는 문을 열어줍니다. 이를 바탕으로 다른 세포 내 제품도 다세포 유기체의 세포 특이적 지지체로 개발될 수 있습니다.

DNA 나노구조는 효소 활성과 단백질 기능을 연구하는 데 필수적이고 효과적인 도구가 되었습니다. 그러나 DNA 나노구조에 단백질 복합체를 형성하기 위한 보편적인 전략을 개발하는 것은 어렵습니다. 어려움 중 하나는 관심 있는 단백질을 DNA 나노구조에 부착하는 것입니다. Sommeseet al. DNA 나노 구조를 표지하는 새로운 접근법을 제안했습니다 [78]. GFP 나노바디로 기능화함으로써 단백질 부착 능력을 정밀하게 제어할 수 있습니다(그림 5F). GFP 특이적 DNA 압타머와 비교하여 나노바디는 GFP에 대해 더 높은 특이성, 안정성 및 친화성을 나타냅니다. 따라서 DNA 나노구조를 세포, 발달 생물학 및 단백질 생화학에서 흔히 발견되는 FP와 연결함으로써 생물학 연구에서 프로그래밍 가능한 스캐폴드로 DNA 나노구조를 적용하는 것이 극적으로 단순화되었습니다.

5. 향후 전망에 대한 논의

전통적인 항체와 비교하여 나노바디는 더 나은 물리적, 화학적 특성을 가지며 발현 및 스크리닝이 더 쉽습니다. 나노바디는 기존 항체보다 구조가 훨씬 간단합니다. 이는 단일 유전자에 의해 암호화되며 미생물에 의해 쉽게 생산될 수 있어 생산 비용이 크게 절감됩니다. 나노바디가 항체 연구에 획기적인 발전을 이루었지만 여전히 해결해야 할 몇 가지 문제가 있습니다. 한편으로는 조작이 불편하고 동물 예방접종 비용이 높다는 단점이 있습니다. 또한, HCAb와 IgNAR은 말초 혈액 단핵구에 풍부하기 때문에 FP 항원을 표적으로 하는 나노바디는 일반적으로 특정 낙타과 또는 상어 면역 라이브러리에서 선별됩니다. 라이브러리 구축 및 나노바디 개발 기술의 성숙에 따라 합성 라이브러리에서 FP 특정 나노바디를 스크리닝하는 것은 동물을 면역시키는 불편함을 극복하고 실험 기간을 단축하며 비용을 획기적으로 절감할 수 있는 새로운 방향입니다. 반면, 나노바디의 스크리닝과 발현은 상대적으로 간단하지만, 잠재적인 응용 가치를 지닌 FP 나노바디를 얻는 것은 매우 복잡한 과정입니다. 파지 나노바디 라이브러리의 스크리닝은 필라멘트성 파지 표면과 항원의 결합으로 인한 위양성을 피할 수 없는 반면, 효모 및 박테리아 나노바디 라이브러리의 작은 용량은 나노바디 스크리닝의 또 다른 어려운 문제입니다.

FP에 대한 나노바디의 적용은 앞으로도 계속 증가할 것입니다. (1) 세포 내 항체 기술의 발달로 살아있는 세포에서 세포 내 분자를 검출하는 것이 가능해졌습니다. 나노바디는 이 점에서 독특한 장점을 가지고 있습니다. (i) 나노바디는 작고 세포 진입 효율은 기존 항체보다 훨씬 높습니다. (ii) 나노바디는 살아있는 세포에서 발현되고 기능할 수 있다. (2) 이중특이성나노바디는 서로 다른 두 항원에 동시에 특이적으로 결합할 수 있는 인공적으로 변형된 항체의 일종이다. 이는 1가 나노바디로부터 쉽게 구성될 수 있으며 미생물에서 발현될 수 있습니다. 따라서 FP에 대한 나노바디는 이중특이성 나노바디 개발을 위한 광범위한 응용 가능성을 제공합니다.

6. 결론

본 논문에서는 FP의 기원, 구조 및 특성을 검토합니다. FP를 표적으로 하는 단일클론 항체와 나노바디 및 그 응용도 요약되어 있습니다. 항체는 고정된 세포에서 생물학적 성분을 표시하는 데 유용한 도구이지만, 살아있는 세포에서 전통적인 항체의 사용은 가변 중쇄 및 경쇄의 비효과적인 접힘 및 조립으로 인해 제한됩니다. 항체의 직접 미세주입은 항체 세포내 적용에 사용되는 주요 방법으로, 이는 기술적으로 어렵고 세포에 스트레스를 줍니다. 낙타 또는 상어 유래 단일 도메인 항체는 중쇄의 가변 도메인을 통해 항원을 인식합니다. 이러한 작고 안정적인 나노바디는 살아있는 세포에서 발현되고 기능할 수 있습니다. 따라서 FP를 표적으로 하는 나노바디를 생성하면 생물학적 연구에서 FP의 가치가 더욱 높아질 것입니다.

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