NADH/NAD에 대한 내성과 불균형은 노화 및 노화 방지 개입을 예상합니다
Jun 13, 2022
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요약
산화 환원 커플은 세포 기능을 조정하지만 불균형의 결과는 불분명합니다. 이것은 실험적 정량화의 한계와 다소 관련이 있습니다. 여기에서 우리는 신진대사의 실리콘 프리젠테이션을 사용하여 산화환원 커플 불균형에 대한 피트니스 기반 내성 프로파일을 특성화하는 접근 방식을 제시함으로써 이러한 어려움을 우회합니다. 효모의 NADH/NAD1 산화환원 커플에 초점을 맞춰 환원적 불균형이 암세포에서 관찰되는 것과 유사한 대사 증후군을 생성한다는 것을 보여줍니다.시스탄치 추출물의 장점산화 환원 불균형에 대한 효모 돌연변이체의 내성은 또한 실험적으로 측정된 연대기 수명의 변동성의 30%를 설명할 수 있습니다. 또한, 균형을 유지하는 데 도움이 되는 일부 대사 산물의 중요성을 예측함으로써 병리학, 수명 보호 분자 또는 칼로리 제한 모방체의 기본 메커니즘인 영양소를 정확하게 식별합니다. 산화환원 불균형에 대한 내성은 이러한 방식으로 노화 표현형의 특성을 인식하는 프레임워크를 제공하는 동시에 노화 방지 개입을 평가하기 위한 생물학적 근거와 일치합니다.
소개
산화 환원 항상성에 대한 연구는 지난 20년 동안 상당히 확장되어 산화적 세포 손상에 대한 고전적인 개념을 지속적으로 재구성했습니다(Halliwell and Gutteridge, 2015). 이 항상성의 기초가 되는 가장 패러다임적인 분자 작용제 중에는 글루타티온, NADPH 및 NADH의 접합체 형태와 같은 산화환원 커플의 비율이 나타납니다. 글루타티온과 NADPH는 모두 미토콘드리아에서 활성 산소종(ROS)의 필수 소거 메커니즘으로 작용하는 반면, NADPH와 NADH는 각각 세포의 산화환원 상태와 동화 및 이화 경로를 연결합니다.
그럼에도 불구하고 NADPH/NADP* 및 NADH/NAD* 쌍을 산화환원 항상성과 연결하는 새로운 메커니즘이 계속 인식되고 있습니다. 예를 들어, NADPH/NADP 플러스의 균형은 AMP 활성화 단백질 키나아제의 생존 결과를 부분적으로 설명합니다(She et al., 2014). 또한 일주기 시간 측정을 산화환원 상태와 연관시킵니다(Rey et al., 2016). NADH/NAD 플러스 비율은 현재 미토콘드리아와 핵 기능의 조정, DNA 복구 및 세포 정체성의 후성 유전적 조절, 환경 변수에 대한 에너지 대사 조정에 관여하는 것으로 생각됩니다(Canto et al., 2015; Gomes et al., 2013). 비 병리학 적 조건에서 NADH / NAD * 비율은 산소 장력에 따라 변동하며 저산소 조건 및 더 높은 산소 가용성은 환원 및 산화 편차와 함께 발생합니다 (Clanton, 2007; Graef et al., 1999).
그러나 산화 환원 커플 비율에 대한 관심 증가는 주로 병리학에서의 의미에서 비롯됩니다.시스탄체 징기스칸환원(저산소, NADH 경향) 및 산화(과산소, NAD + 경향) 감각 모두에서 ROS의 출현은 미토콘드리아의 최상의 성능을 보장하는 최적의 산화환원 전위로부터의 발산과 관련이 있습니다(Aon et al., 2010 ; 클랜튼, 2007). 암과 관련하여 감소된 NADH/NAD 플러스는 교모세포종의 치사율의 기초가 될 수 있고(Gujar et al., 2016) 결장암 진행을 촉진할 수 있지만(Hong et al., 2019), 일부 건강한 표현형을 다른 정도로 구출할 수도 있습니다. 다른 종양 유형(Garrido 및 Djouder, 2017).
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NADH는 토론토 생물학에서도 관심의 대상이 되었습니다. 이러한 맥락에서, NAD 플러스 풀의 증대는 유기체 전반에 걸쳐 노화 및 기타 관련 병리학적 표현형의 부분적 역전을 초래했습니다(Das et al., 2018; Mendelsohn and Larrick, 2014; Wei et al., 2017; Zhu et al. , 2017), 노화 및 신생물 세포는 NADH/NAD 플러스 비율의 불균형을 나타내는 것으로 밝혀졌습니다(Braidy et al., 2011; Schwartz and Passonneau, 1974; Wiley et al, 2016). 또한, 새로 발견된 NADPH의 역할과 산화환원 항상성 및 노화의 마스터 레귤레이터로서 NADH/NADH의 새로운 개념은 모두 노화의 대사 안정성 이론과 일치합니다(Demetrius, 2004). 이 이론은 노화의 원인이 효소 반응 속도에 대한 무작위 환경 섭동에 대한 산화 환원 커플의 정상 상태 수준의 취약성을 제안하고 인간에게 적용되는 몇 가지 흥미로운 예측을 합니다.
이러한 모든 의미를 감안할 때 많은 연구에서 수동적으로 수준을보고하거나 적극적으로 수정하여 산화 환원 커플 비율의 현상을 조사했습니다. 그러나 실험적인 조작은 어렵습니다. 가장 전통적인 비난은 깊은 실험적 경고(Sun et al., 2012)와 새로운 것들은 온도와 pH 간격의 제한으로 인해 여전히 특정 생물학적 상황을 놓치고 있습니다(Hung et al., 2011; Zhao et al., 2015). 더욱이, 대사 산물 보충(Hou et al., 2010) 및 NAD(H) 소비 효소의 돌연변이 또는 과발현에 의한 조효소 풀의 변경 후 다양한 표현형을 모니터링하는 것은 실험적으로 비용이 많이 듭니다(Bait al., 2011; Felipe et al., 1998). 따라서, 산화 환원 커플의 조작을 통한 산화 환원 항상성의 제어와 이 제어의 생물학적 결과에 대한 이해를 해결하기 위한 대체 전략이 필요합니다.
인 실리코 모델은 실험적 접근이 제한될 때마다 실용적인 연구 전략이 되며 관찰된 현상에 대한 완전한 기계론적 설명이 가능하다는 이점이 있습니다. 플럭스 균형 분석(FBA)을 통해 연구할 수 있는 게놈 규모의 대사 모델(Orth et al, 2010)은 세포 기능에 대한 대사 섭동의 결과를 연구하기 위한 시스템 생물학의 표준이 되었습니다(방법 S1). 다른 기여 중에서 그들은 새로운 항생제 및 화학 요법의 발견, 관심 물질의 산업적 생산에 최적화된 박테리아 균주의 설계, 인간 대사 질환의 더 나은 이해를 도왔습니다(Burgard et al., 2003; Pagliarini et al. 2016; Raman et al., 2009). FBA의 사용은 비대사성 교란 요인(유전적, 후성적, 기계적 등)의 영향 없이 대사 현상에 대한 통찰력을 제공하는 추가적인 이점이 있습니다. 따라서 게놈 규모의 대사 모델은 산화환원 항상성 편차의 대사 결과를 조사하는 데 특히 적합합니다.
여기에서 우리는 FBA를 사용하여 단세포 진핵생물 Saccharomyces cerevisiae의 게놈 규모 재구성에서 산화 환원 커플의 균형을 조사하여 사용 가능한 NADH/NAD의 제어된 교란의 대사 및 장수 관련 결과를 특성화합니다. 배경. 보다 구체적으로, 우리의 결과는 이러한 불균형에 대한 내성이 병리를 연상시키는 특정 대사 경로 변경으로 이어지고 또한 유사분열 후 수명의 특정 내 변동성의 4분의 1 이상을 설명한다는 것을 보여줍니다. 또한, 이 프레임워크는 연령 관련 병리의 맥락에서 잠재적인 치료 표적으로 대사산물과 효소를 식별하기 위한 계산 프로토콜(동물 및 인간 대사 모델에도 적용)을 설명하는 데 도움이 됩니다.
결과
피트니스 기반 내성 프로필은 산화 환원 커플 섭동을 특징으로합니다.
산화 환원 커플의 접합체 형태 사이의 불균형을 나타내기 위해 인공 가역 반응("불균형 반응")을 해당 대사 네트워크(STAR 방법)의 게놈 규모 재구성에 통합했습니다. 반응은 특정 세포 구획(예: 시토졸, 미토콘드리아 등)을 고려하면서 커플을 산화 또는 환원시키며, 그 활성은 원하는 속도 값으로 고정될 수 있습니다. 이러한 값 중 하나에 대해 특정 조건에 대한 효모 세포의 내성에 대한 프록시 역할을 하는 성장률("적응도")을 계산할 수 있습니다. 마지막으로 내성 프로파일은 범위에 대한 성장률을 계산하여 정의됩니다. 불균형 값(그림 1A, 환원/산화 조건은 원고 전체에서 각각 파란색/빨간색으로 표시됨).
허용 오차 프로파일은 일반적으로 영 불균형 지점 주변에서 최대 성장을 나타내며 대략 모든 편차(즉, 반응의 0이 아닌 값)로 인해 적합도가 감소합니다. 이것은 신진대사가 작동하기 위해서는 어떤 의미에서 산화환원 커플 비율을 조정하는 반응의 활동이 다른 의미에서 그것을 조정하는 반응의 활동에 비례해야 한다는 사실을 강조합니다. 보다 구체적으로, S.에서 NADH/NADt의 세포질 불균형시스탄체 수명 연장포도당 및 호기성 조건에서 성장하는 cerevisiae는 ~50mmol/DW/시간의 NADH가 NADH로 전환되는 불균형 프로파일의 지점에서 최대 성장이 산화 측면으로 크게 변위된 프로파일을 산출합니다(그림 1B). 대신 미토콘드리아의 불균형을 고려할 때 다른 프로파일(그림 S1)에서 유사하게 관찰된 패턴인 무효 불균형 지점에서 최대값을 관찰했습니다(그림 1C). 일반적으로 환원 조건은
그림 1. 허용오차 프로파일은 산화환원 불균형에 대한 반응을 특징짓습니다.
(A) 탑. 우리는 산화 환원 조효소(여기서는 NADH/NADH 쌍)의 두 가지 접합체 형태를 상호 변환하기 위해 유기체(이 경우 효모)의 대사 재구성 모델에 인공 반응을 도입했습니다. 일련의 불균형 조건, 즉 인공 반응의 속도 값 각각에서 플럭스 균형 분석을 적용하여 성장률을 계산합니다. 맨 아래. 예측된 성장 값은 허용 오차 프로필을 나타내는 불균형 비율 값에 대해 표시됩니다. 선택된 섭동에 직면했을 때 신진대사의 내성에 대한 대용물.시스탄체 NZ(B) 세포질에 위치한 불균형과 관련된 효모의 내성 프로필.
(C) 미토콘드리아에 있는 불균형과 관련된 효모의 내성 프로필. 파란색/빨간색 음영은 각각 감소 및 산화 불균형 체제를 나타내고 회색 점은 불균형이 없거나 성장을 생성하지 않는 극단적인 환원/산화 불균형에 해당하는 값을 나타냅니다. 산화 체제보다 해롭고 치명적입니다. 두 가지 경우(세포질 NADH 또는 미토콘드리아 Thioredoxin의 접합된 쌍), 한 쌍의 약한 인공 산화는 성장을 향상시킵니다(그림 S1).
NADH/NAD* 섭동은 병리를 연상시키는 대사 증후군을 유발합니다.
불균형이 없는 효모의 에너지 대사는 해당과정이 트리카르복실산 회로(TCA) 및 산화적 인산화와 결합되는 포도당 존재(연구된 성장 조건)에서의 특징적인 호기성 대사에 해당합니다. 5탄당 인산 경로는 포도당을 산화시키고 뉴클레오타이드 합성을 위한 리보스{0}P 및 동화작용을 위한 NADPH 유래 환원력을 제공하는 반면, 보충 대사 경로는 글루타민 대사의 경로와 유사하게 TCA 회로를 떠나 주로 피리미딘 및 아미노산 합성. FBA를 통해 이러한 경로의 변화를 정량화하고 특정 불균형 체제의 기초가 되는 대사 특성을 궁극적으로 세부적으로 설명할 수 있습니다.
구체적으로, 그림 2A는 세포질 NADH/NADH의 환원적 불균형이 해당 과정의 증가, TCA 회로 및 전자 수송 사슬의 활성 감소, 글루타민 대사의 증가를 초래하는 방법을 보여줍니다. 이 pseudohypoxic 대사 신호는 -산소가 있을 때 - 혐기성 대사와 유사하며, 해당 과정에서 해당 과정이 알코올 또는 젖산 발효와 결합되어 미토콘드리아 경로를 손상시킵니다. 오탄당 인산 경로의 산소 부분이 차단되고 보다 활성화된 글루타민 대사가 동화 작용에 기여하는 것 외에도 피루브산을 생성하도록 경로가 변경될 수 있습니다. 특히, 이 표현형은 다양한 유형의 암세포에서 관찰되는 역설적 수율 대사의 일부 특징을 포착합니다(Warburg 효과)(Potter et al., 2016).
그림 2. 효모(A) 세포질 NADH/NAD 불균형(상단) 및 5개의 대표적인 경로(하단)의 플럭스 값의 내성 프로필의 기초가 되는 에너지 관리의 주요 경로의 플럭스; i/해당 분해(당분해, 코어), ii/Krebs 회로(TCA, 분홍색), ili/5탄당 인산(Penphos, 녹색), iv/산화적 인산화(Oxphos, 회색) 및 글루타민 대사(글루타민, 자주색). 표시된 플럭스 벡터는 특정 경로의 모든 반응 플럭스를 평균화한 결과입니다.
(B) 미토콘드리아 불균형과 관련하여 (A)와 동일합니다. 해당과정(패널 A, 하단)에서 음의 플럭스의 존재는 증가된 포도당신생합성을 나타냅니다. 자세한 내용은 본문을 참조하십시오.
대조적으로, 산화 내성의 기초가 되는 에너지 대사(세포질과 관련하여, 그림 2A)는 더 호기성과 유사한 구성을 나타내었지만 특히 활성 폴리아민 대사와 같은 특성이 있습니다. 및 증가된 포도당신생합성, 산화적 인산화 및 TCA 주기 활성을 포함한 극한 특성과 오탄당 인산 경로를 통한 매우 높은(정상 수준의 최대 12-배) 플럭스. 그럼에도 불구하고 후자는 매우 높은(과거 55mmol/gDW/h) 산화 불균형(방법 S1 참조)에서 바이오매스 유사 반응의 차이의 인공물일 수 있습니다.
불균형 반응이 미토콘드리아에 있을 때 NADH의 감소는 한 가지 차이점이 있는 특정 pseudohypoxic 동작을 다시 생성했습니다(그림 2B). 해당 과정과 글루타민 대사를 통한 플럭스는 TCA 회로와 오탄당 인산 경로의 일부가 동시에 손실되면서 증가했습니다. 그러나 세포질의 경우와 달리 산화적 인산화는 크게 증가했습니다. 반면에 미토콘드리아 프로필의 산화적 측면은 더 특이했습니다. 해당 활성은 TCA 회로와 병행하여 증가했지만 산화적 인산화는 대부분 정상보다 낮은 수준에서 작동했으며 글루타민 대사는 거의 중요하지 않았습니다.
대사 증후군은 산화환원 균형, 바이오매스 생산, ATP/NADH 트레이드오프 간의 절충으로 인해 발생합니다.
우리는 이전 증후군을 형성하는 몇 가지 핵심 요소를 확인했습니다.cistanche 남근 크기산화적 섭동은 성장을 유지하고 불균형 섭동을 완충하는 것 사이의 절충안으로서 악화된 호기성 반응과 만났습니다. 이것은 바이오매스 구성성분을 생성할 수 있는 전체 플럭스 분포를 유지하면서 NAD 플러스를 감소시키는 가능한 최대 반응 수를 통해 플럭스를 재라우팅하는 것을 포함했습니다. 이 두 가지 기계적 요소(섭동 완충 및 바이오매스 최대화)는 최적화 문제의 가장 관련성이 높은 요구사항이며 허용 오차 프로파일의 산화 체제를 설명하기에 충분합니다.
그림 3. 경쟁 메커니즘은 효모의 가성 저산소 행동을 유발합니다.
(A) NADH, ATP 및 바이오매스 전구체 생산 간의 균형은 환원 체제의 결과를 보상하기 위해 가능한 한 많은 ATP와 적은 NADH를 생산하는 반응 모듈을 선호합니다. 여기서 보라색 화살표는 ATP 생산을 나타내고 노란색 화살표는 NAD(H) 생산을 나타내고 흰색 원은 바이오매스 전구체의 생성을 나타냅니다. (B) NADH가 발생하기 쉬운 NADH/NADt 섭동(x축)은 인공 ADP와 겹칩니다. ATP 형태의 환원력을 불균형한 대사에 강제적으로 도입하는 인산화 반응(y축). 녹색 그라데이션은 해당 정상 값(최대 100-배)으로 정규화된 해당 과정과 Krebs 주기 플럭스 간의 비율을 나타냅니다. ADP 인산화가 pseudohypoxic 표현형을 감소시키고 정지를 지연시킨다는 것을 이해할 수 있습니다.
환원적인 측면은 그러나 하나의 추가적인 통찰력이 필요했습니다. 점점 더 많은 NADH가 NADt를 사용하는 NADH 반응에 격리되고 바이오매스 구성요소를 생성하는 데 직간접적으로 필요한 것이 점점 더 제한됨에 따라 에너지 대사는 NADH에서 NAD'로의 높은 전환을 허용하고 제한하기 위해 경로를 다시 지정해야 합니다. NAD'를 NADH로 환원. NADH 형태의 대부분의 환원력은 본질적으로 많은 대사 목표, 반응 및 성장에 쓸모가 없기 때문에 섭동에 직면하기에는 여전히 불충분합니다. NADH에 저장된 에너지는 ADP에 재할당되어야 합니다. 따라서 신진대사는 가능한 한 많은 ATP와 적은 양의 NADH를 생성하는 반응 모듈을 우선적으로 처리해야 합니다. 이것은 높은 ATP/NADH 수율을 갖는 션트 및 경로(예: 해당과정 및 산화적 인산화)에 의존해야 합니다.
무엇보다도 이러한 결과는 TCA 주기를 감소시키고 해당 과정의 플럭스를 증가시켰습니다(그림 3A). 이 ATP/NADH 트레이드오프의 영향을 더 조사하기 위해, 우리는 환원적 NADH/NAD 섭동을 ADP의 인산화를 허용하는 인공 반응과 겹쳤습니다. . 시뮬레이션은 환원성 대사를 특징짓는 TCA 사이클 플럭스에 대한 해당과정의 증가가 ATP/NADH 수율에 의존한다는 것을 보여주었습니다.
그림 4. 효모의 시간순 수명 예측 인자로서의 내성 점수
(A) 효모 돌연변이에 대해 얻은 내성 프로필; 곡선의 파란색/빨간색 부분은 NADH/NADH 불균형의 환원/산화 체제를 나타냅니다.
(B) 정규화된 내성 점수(산화 및 환원 요법, STAR 방법 모두에서 불균형 값의 폭에 비례)와 시간적 수명 간의 연관성. 상관 관계는 총 분산(R'{1}}의 ~30%를 설명합니다. 29, p-값=3.2x 10-4, N= 41).
(C) 이 연관성을 보는 다른 방법으로, 우리는 공차 점수와 수명 사이에 무작위로 생성된 10,000개의 연관성에서 얻은 회귀 기울기 값의 히스토그램을 얻었습니다. 이 샘플에서 내성 점수와 수명 데이터 간의 연관성이 발견된 것(빨간색 수직선으로 표시됨)보다 더 강한 경우 3개만 찾습니다.
(그림 3B). ADP를 강제로 인산화하면 NADH가 발생하기 쉬운 불균형 비율이 매우 강함에도 불구하고 이 유사저산소증 신호를 줄입니다.
내성은 다른 효모 돌연변이 사이의 실험적 연대기 수명 차이를 설명합니다
우리는 산화 환원 커플이 잠재적인 수명 결정 요인으로 논의되어 왔다는 점을 감안할 때 내성 프로파일이 수명의 예측 인자로 얼마나 작용할 수 있는지 다음으로 질문했습니다. 이것을 연구하는 한 가지 방법은 다양한 돌연변이(그림 4A)의 프로필을 계산한 다음 실험적으로 측정된 돌연변이 생존 곡선(Garay et al., 2014). CLS는 이러한 돌연변이 생존 곡선으로부터 야생형에 비해 정지기 생존의 증가로 계산됩니다.
FBA에서 특정 유전자의 돌연변이는 각 화학 반응을 반응의 효소(STAR 방법)로 번역되는 ORF와 관련시키는 부울 규칙을 통해 관련 반응의 플럭스를 제한함으로써 시뮬레이션됩니다. 이러한 돌연변이체 각각에 대해 돌연변이체 내성 프로파일(그림 4A)을 계산하고 성장률이 반감되는 불균형 절대값의 합(환원 및 산화 요법 모두에서)을 내성 스칼라 점수(STAR 행동 양식).
그러나 우리의 돌연변이 세트는 몇 가지 제한 사항(STAR 방법)에 의해 제한되었습니다. 특히, 우리는 엄청난 계산 시간에 도달하지 않고 야생형 값의 10ppm 미만의 허용 오차 차이를 구별할 수 없었고 많은 돌연변이체는 수명에서 무시할 수 있는 차이와 허용 오차에서 무시할 수 있는 차이를 모두 나타냈습니다. 또한, 일반적으로 FBA는 기능 획득 결실을 특성화할 수 없으며, 예상대로 돌연변이 내성이 야생형의 내성을 초과하지 않는 것으로 간주됩니다.
이러한 제약 외에도 in silico 내성 프로필은 실험적으로 측정된 수명 변동성의 -30%를 설명할 수 있었습니다(그림 4B, R2= 0.29, N=41,p 값{{5 }}.2x 10-)가 큰 의미가 있음:10,000 데이터 쌍의 무작위화는 회귀 기울기가 더 큰 3개의 인스턴스로 이어졌습니다(그림 4C).
기존의 영양소는 NADH/NADH 불균형에 대한 내성을 가능하게 합니다.
마지막으로 특정 식이 대사 산물이 산화 환원 불균형에 대한 반응에서 특히 결정적인지 여부를 조사했습니다. 이를 위해 우리는 FBA 모델의 추가 기능을 사용했습니다. 이 기능은 특정 대사 산물의 사용에 액세스할 수 있는 가능성입니다(정상 상태, STAR 방법에서 소비율로 정의됨). 우리는 환원성 및 산화성 NADH/NAD와 불균형의 값이 증가함에 따라 이 비율이 어떻게 변하는지 조사했습니다.
사용량은 프로필의 양쪽과 대부분의 대사 산물에서 다소 선형적이었습니다. 따라서 우리는 이 변화하는 패턴을 선형 모델에 맞추고 (절대) 기울기를 산화환원 불균형을 견딜 수 있는 해당 대사 산물의 관련성을 나타내는 스칼라로 간주했습니다(그림 5A). iAZ900의 최고 반응성 영양소 중 우리는 아세테이트(Burtner et al., 2009)와 같이 효모 수명을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 식이 대사 산물과 효모, 벌레, 또는 말산염, 하이드록시부티레이트, 스페르미딘 또는 옥살로아세테이트를 포함한 인간 세포(Madeo et al., 2018; Mishur et al., 2016)(그림 5B-5D, 표 S1).
특정 영양소는 NAD 감소에 대한 내성, 다른 영양소는 NADH산화에 대한 내성, 그리고 이 두 요법 모두에 더 관련이 있습니다. 환원 내성에 대한 가장 중요한 식이 대사 산물은 아세테이트, 베타-하이드록시부티레이트(BHB), 글루타메이트 및 글루타민의 순서로 있었고(그림 5B), 한편 NADH 산화를 견디는 데 가장 중요한 것은 아세테이트, NADP plus, 퓨트레신 및 스페르미딘이었습니다. (그림 5D). 프로파일의 양쪽에서 내성으로 참여한 사람들 중에서 가장 관련성이 높은 순서는 아세테이트, 글루타메이트, 옥살로아세테이트 및 옥소글루타레이트입니다(그림 5C).
우리는 불균형에 대한 반응에서 어떤 영양소가 결정 요인인지 확인하기 위해 다른 유기체의 대사 모델을 고려했습니다(방법 S1, 주요 경로의 플럭스가 어떻게 변하는지 그림 S2 참조). 이 모든 주요 기여자는 알파 케토산, 산화 환원 커플, 특정 비타민 및 특정 아미노산이 C.elegans 및 인간 재건에서 NADH/NADt 섭동을 제어하는 데 크게 필요하기 때문에 광범위하지는 않지만 변경되었습니다. 이러한 유기체에서 산화환원 불균형에 대한 가장 일반적인 반응은 아세테이트, 중탄산염, 중인산염, 나트륨, 물 등과 같은 pH 항상성을 매개하는 대사 산물에 관한 것입니다. 유사하게, 글루타메이트, 글루타민, 아스파테이트, 트레오닌, 세린 및 글리신의 관련성은 이들을 다른 아미노산 및 대부분의 대사 산물과 구별합니다. oxoglutarate, malate 및 oxaloacetate와 같은 중간 크기의 산화된 산은 비오틴과 일부 엽산과 마찬가지로 내성에 일관되게 역할을 합니다(전체 목록은 표 S1 참조).
논의
우리는 여기에서 산화 환원 커플의 변화의 광범위한 생물학적 결과를 이해하기 위한 대안적인 접근 방식을 제안합니다. 이 접근 방식은 인실리코 대사 모델을 기반으로 하며 이러한 변화에 대한 세포 회복력을 정량화하는 척도로 내성 프로파일의 개념을 도입합니다.
그림 5. 효모의 항상성 영양소
(A) 각각 기울기 m 및 m을 특징으로 하는 해당 환원성(파란색) 및 산화성(빨간색) 선형 회귀가 있는 영양소의 사용 프로필 예(절대값). 우리는 참조로 백그라운드에서 세포질 내성 프로필을 포함했습니다.
(B) NADH/NAD 플러스 섭동의 환원적 의미에서 상위 4개 항상성 영양소의 선형 회귀 기울기(m,).
(C) 섭동의 두 가지 의미에서 항상성인 상위 4개 영양소의 선형 회귀 기울기; 파란색: 환원적 선형 회귀 기울기; 빨간색: 산화 선형 회귀 기울기.
(D) NADH/NAD 플러스 섭동의 산화적 의미에서 상위 4개 항상성 영양소의 선형 회귀 기울기(m.).
프로필의 기초가 되는 대사 조정은 환원적 NADH 체제와 관련된 pseudohypoxic 표현형의 존재를 나타냅니다. 이 표현형은 암(Warburg 효과)에서 관찰되는 명백히 역설적인 저수율 에너지 대사를 연상시키며 효모(Crabtree 효과) 및 박테리아(오버플로 대사) 세포에서도 인식됩니다(Basan et al., 2015; Mori et al., 2016, Potter et al., 2016). 이러한 행동이 비교적 높은 성장률 또는 포도당 섭취율에서 발생하는 자원 할당 제약으로 인해 발생할 수 있다는 가능성이 최근 몇 년 동안 제기되었습니다(Basan et al, 2015; Mori et al, 2016). 그러나 우리가 관찰한 pseudohypoxic 표현형은 성장률 및 포도당 흡수와 무관하며 실제로 낮은 성장률(STAR 방법)과 함께 발생합니다. 우리는 그 원인이 최근 실험 연구(Maldo-nado and Lemasters, 2014)에 의해 뒷받침되는 근거인 근본적인 ATP/NADH 절충에 있음을 보여주었습니다.
또한, 우리의 플럭스 분석은 ATP 유지가 환원성 NADH/NAD와 불균형에 의해 부정적인 영향을 받을 수 있음을 시사합니다. 증가된 NADH는 감소된 ATP 가용성과 상관관계가 있는 것으로 생각되는데, 산화적 인산화의 손상은 NADH/NAD 플러스의 증가와 ATP/ADP의 감소 모두를 초래할 수 있기 때문입니다. 우리는 외부적으로 생성된 NADH 불균형이 산화적 인산화가 정상 수준에서 작동하는 동안에도 직교 대사 메커니즘을 통해 에너지 가용성 감소의 원인이 될 수 있음을 보여줍니다. 감소된 에너지 가용성 및 ATP/ADP 비율은 세포 노화 및 노화 관련 병리의 보존된 특징이기 때문에 노화 연구의 맥락에서 매우 중요합니다(Moreira et al., 2003; Pall, 1990; Yaniv et al., 2013 ) 단백질 회전율을 감소시켜 단백질 반감기를 증가시켜 독성 폐기물의 축적과 단백질 항상성 손실(노화의 또 다른 특징)을 촉진할 수 있습니다(Anisimova et al., 2018).
우리는 산화환원 불균형을 완충하는 식이 대사 산물과 수명 예측자로서의 우리 프레임워크의 유효성을 결정하는 것을 목표로 합니다. 허용 오차는 사용 가능한 데이터 세트로 인해 몇 가지 제한이 있지만 세포 수명을 예상합니다. 이러한 제한 사항을 제어하면(Garay et al., 2014) 결과 상관 관계가 여전히 허용 오차 분산과 CLS 간의 관계에 대한 충분한 증거임을 발견했습니다.
우리의 기대와 달리 식이 대사 산물 분석에서 얻은 가장 뚜렷한 교훈은 불균형에 대한 반응을 주도하는 주요 물질이 특히 NADt 회수 네트워크에 의존하지 않는다는 것입니다. 실제로, 최상위 "항상성 영양소"는 TCA 회로의 중간체이며 작용이 NAD 전구체보다 훨씬 더 침투하는 중추 대사의 다른 부분입니다. 또한 산화 환원 쌍과 주요 대사 경로 사이의 다리 역할을 하면서 NAD(H)를 환원 또는 산화시키는 반응의 관련성은 NADt 회수 제한 효소(예: 니코틴아미드 모노뉴클레오타이드 아데닐트랜스퍼라제)의 관련성보다 훨씬 우수합니다.
예를 들어, 효모 모델의 옥살로아세테이트와 옥소글루타레이트 점수는 환원 및 산화 조건 모두에서 내성의 기본이 되는 상위 4개 대사 산물 중에서 이전 실험 결과를 뒷받침하는 일관된 기능입니다(Chin et al., 2014; Williams et al., 2009). . 다른 중요한 대사 산물로는 수명을 늘리고 NAD를 조절하며 기아에 대한 반응을 중재하는 것으로 일관되게 밝혀진 하이드록시부티레이트(Edwards et al., 2014; Newman and Verdin, 2014)와 폴리아민 계열에 속하며 연령 관련 과정, 자가포식 및 DNA 보호에서 역할을 합니다(Eisenberg et al, 2009; Minois et al.2011: Pietrocola et al.2015).
우리는 이전 평가를 강화하기 위해 C.elegans와 인간 모델을 사용하여 pH 항상성, 산화 환원 커플 및 TCA 주기를 중심으로 한 더 넓은 그림을 보여주었습니다. 이것은 pH(Burtner et al., 2009)와 NADH 불균형(Ayer et al., 2014)이 세포의 노화를 결정하는 방식이 깊이 얽혀 있음을 시사합니다. pH 외에도 NADH/NAD와 불균형을 조절하는 가장 광범위하고 중요한 영양소는 알파 케토산 옥살로아세테이트 및 옥소글루타레이트, 이들의 아민화된 형태 및 기타 미토콘드리아 관련 대사산물인 말산, 피루브산 및 푸마르산(즉, 산화 환원 균형 제어는 TCA 사이클입니다.
오늘날까지 아미노산과 TCA 순환 중간체가 효모와 C. 엘레간스의 수명 연장에 영향을 미치는 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. malate, oxaloacetate, fumarate, valine, serine 또는 threonine과 같은 대사 산물은 실제로 유기체의 수명을 연장할 수 있지만 이러한 효과로 이어지는 과정은 논의되고 복잡합니다(Edwards et al., 2013, 2015). 우리의 결과는 이러한 모든 장수 현상에 대한 공통된 설명이 NADH/NAD 플러스 비율의 섭동을 견디는 세포의 능력에 대한 영양소의 영향에 있음을 나타냅니다.
그러나 고려되는 대사 산물 중 일부는 결국 NADH와 NAD plus를 상호 변환하는 반응에 관여하기 때문에 자명한 것처럼 보인다고 주장할 수 있습니다. 그렇다면 문제는 선험적으로 자명해 보이는 다른 대사산물이 우리 결과에 나타나지 않는 이유입니다. 답은 FBA에서 현실적인 예측을 보장하는 메커니즘에 있습니다. 영양소가 산화환원 불균형에 대해 "항상성"이 되기 위해서는 NADH 또는 NADt 생산을 증가시킬 뿐만 아니라 높은 ATP/NADH 수율 및/또는 바이오매스 구성요소를 제공하는 능력을 갖는 경로 또는 모듈의 중심에 있어야 합니다.
마지막으로, 우리의 결과에서 두 가지 더 많은 통찰력이 주목할 만합니다. 한편으로 그들은 산화 환원 불균형에 대한 반응으로 대사 네트워크가 신호 전달 네트워크에 의해 autophagy, 항산화 및 호르몬 반응의 필요성을 배제하는 것으로 해석되는 일부 대사 산물을 점점 더 생산 및/또는 소비할 태세를 갖추고 있다고 제안합니다. 또는 보충은 CR 매개 수명 연장과 관련된 신호 전달 경로에 의존하는 방식으로 수명을 증가시키고/거나 칼로리 제한(CR)의 효과를 모방하는 것으로 밝혀졌습니다. 이것은 동일한 수명 연장 및 건강 증진 과정의 일부로서 CR 및 NADH/NADH 균형을 연결하는 이전 증거를 강화합니다(Lin et al., 2004).
반면에, 우리의 연구는 변경된 비율에 대한 반응으로 신진대사가 아세테이트, 퓨트레신 또는 아세트알데히드와 같이 세포를 화학적으로 손상시킬 수 있는 특정 물질의 사용을 증가시킨다는 것을 보여줍니다. 뿐만 아니라 글루타민, 숙시네이트 및 푸마레이트와 같은 대사 재배선을 통해 종양 형성을 촉진할 수 있는 일부(Sciacovell et al., 2016). 그러면 이것은 산화 환원 불균형과 관련된 병리 및 퇴행성 및 종양 질환과 같은 거시적 과정을 부분적으로 설명할 수 있습니다. 산화 환원 불균형이 독성 물질로 완충되어야 하는 경우 이러한 물질은 아마도 공동 병리학의 메커니즘일 것입니다. - 산화환원 불균형으로 발생합니다.
우리는 산화 환원 불균형에 대한 우리의 접근 방식이 대사 네트워크 견고성에 대한 연구의 특이한 변형으로 이해될 수 있으며 개선의 여지가 많이 남아 있는 특정 경고를 비난할 수 있다는 것을 알고 있습니다. 견고성과 관련하여 FBA를 사용한 연구는 전통적으로 FBA를 특정 섭동(산화환원 불균형)보다는 반응 속도의 다양한 감소(예: Edwards and Palsson, 2000)에 대한 반응으로 객관적 솔루션(일반적으로 성장)의 변화로 정의했습니다. ) 우리가 하는 것처럼 대사 산물에서. 우리 분석의 한계와 관련하여 규제 유전자의 부재와 같은 FBA 자체의 본질적인 한계와 연결될 수 있습니다. 궁극적으로, 우리 결과의 신뢰성은 대사 재구성의 예측력에 달려 있습니다. 현재 효모 모델은 예측하고 발전했지만 완벽하지 않으며(Heavner and Price, 2015), 여전히 대부분의 것보다 훨씬 뛰어납니다. 정확한 다세포 재구성이 가능합니다. 이러한 모든 우려에도 불구하고, 자연적 행동에 대한 신진대사 모델의 충실도가 증가하는 것을 정당화하는 증거가 많이 있습니다.
현재, 지배적인 연구는 NADH/NADH 비율을 무차별적으로 감소시키는 잠재적인 부정적인 결과를 무시하는 경향이 있습니다. 이것은 부분적으로 신생물 표현형의 감소, 수명 및 건강 기간 연장을 포함하여 실험적으로 달성된 가벼운 감소로 인한 유망한 이점 때문입니다. 그러나 이러한 긍정적인 결과(Gujarat al., 2016; Hong et al., 2019)와 NADH/NADH 비율이 다음 이상으로 감소함으로써 부정적인 결과를 예측하는 견고하고 실험적으로 지속되는 이론적 틀에 대해 극도의 주의를 권고하는 새로운 증거가 있습니다. 임계값(Aon et al., 2010). 우리의 NADH/NADt 불균형 내성 프로필은 가벼운 산화 편차가 유익할 수 있지만 더 높은 편차는 반대 극단만큼 해롭기 때문에 이 새로운 그림을 충족합니다.
보다 구체적으로 말하면, 우리의 내성 프로필은 화학적 또는 생리학적 문제를 일으키는 것 외에도 낮은 NADH/NADH 비율과 높은 NADH/NADH 비율 모두 감소된 에너지 가용성 및/또는 생합성 출력을 포함하여 순전히 신진대사 결점을 충족해야 함을 시사합니다. 또한, 우리가 지적했듯이, 우리가 다루는 일부 질문에 사용할 수 있는 제한된 실험적 관찰은 여기에서 보고하는 결과를 연상시키는 것 같습니다.
연구의 한계
여기에 제시된 결과는 사용된 모델이 더욱 정교해지면 개선될 것입니다. 우리의 작업은 또한 기술로서의 FBA의 본질적인 한계로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 예를 들어, 현재 사용 가능한 동적 플럭스 분석 버전이 범위가 너무 축소되면 동적 정보에 도달할 수 없습니다. 유사하게, 플럭스 균형에 내재된 에너지 제약이 없기 때문에 높은 성장률에 대한 예측 가능성이 감소합니다. 이 약점은 우리가 원고에서 고려한 바와 같이 CAFBA와 같은 기술을 추가하도록 동기를 부여했습니다. 마지막으로, 쉽게 제어하고 켜거나 끌 수 있는 규제 정보에 액세스하는 것이 흥미로울 것입니다. 현재 FBA에서 유전자 조절을 구현하기 위한 표준화된 접근 방식은 없습니다. 제약 경계에 대한 반응 활성 점수의 적용은 이와 관련하여 유망합니다.
이 기사는 iScience 24, 102697, 2021년 7월 23일에서 발췌했습니다.