Cistanche Deserticola의 총 배당체는 MCAO/R 쥐에서 Nrf{0}}/Keap{1}} 경로를 통해 신경 혈관 재생을 유도하여 신경 기능 회복을 촉진합니다

연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com

Fujiang Wang , Ruiyan Li , Pengfei Tu , Jianping Chen , Kewu Zeng 및 Yong Jiang

배경:중국 전통 의학인 Cistanche Deserticola는 심혈관 및 뇌혈관 질환에 유효한 것으로 보고되었습니다. 그러나 허혈성 뇌졸중의 보호를 위한 활성 성분은 명확하지 않습니다. 우리는 의 활성 구성 요소를 탐색하는 것을 목표로 했습니다.C. 데저티콜라허혈성 뇌졸중 및 잠재적 기전에 대해.행동 양식:우리는 추출물의 뇌 보호 효과를 조사했습니다.C. 데저티콜라, 중간 대뇌 동맥 폐색-재관류(MCAO/R)의 쥐 모델에서 총 배당체(TG), 다당류(PS) 및 올리고당(OS). 2, 3, 5-Triphenyl tetrazolium chloride(TTC) 염색을 사용하여 뇌경색 부피를 평가하고 Evans blue 분석을 사용하여 BBB(혈액뇌장벽) 투과성을 평가했습니다. 그런 다음 표현식 CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, claudin{10}}, occludin, Keap{11}} 및 Nrf{{ 12}}는 western blotting 또는 면역형광법을 이용하여 분석하였고, MDA, SOD, CAT, GSH-Px 활성은 kit를 이용하여 분석하였다.결과:TGs 치료는 모델 그룹과 비교하여 신경학적 결손 점수와 경색 부피를 현저하게 감소시키고, 혈관신생 및 신경 리모델링을 촉진하고, 효과적으로 혈액-뇌 장벽 무결성을 유지했습니다. 또한, TG는 뇌에서 MDA 수준을 유의하게 감소시키고 항산화 활성(SOD, CAT 및 GSH-Px)을 증가시켰습니다. 한편, TG는 Keap-1 발현을 현저하게 하향조절하고 Nrf-2 핵 전위를 촉진했습니다. 반대로 PS군과 OS군에서는 보호효과가 관찰되지 않았다.결론:TG는 의 주요 활성 구성 요소입니다.C. 데저티콜라MCAO/R 유발 뇌 손상에 대한 방어이며, 보호는 주로 Nrf-2/Keap-1 경로를 통해 이루어집니다.

키워드: Cistanche Deserticola, 뇌손상, 총 배당체, 다당류, 올리고당, Nrf{0}}/Keap{1}} 경로

소개

뇌졸중은 세계에서 사망 및 장애의 주요 원인으로 간주됩니다(Donnan et al., 2008). 모든 뇌졸중 사례의 거의 87%가 허혈성 뇌졸중에 의해 유발됩니다(Ovbiagele 및 Nguyen-Huynh, 2011). 현재, 허혈성 뇌졸중 치료에 사용되는 가장 효과적인 약제이자 FDA 승인 약물은 재조합 조직 플라스미노겐 활성제입니다. 그러나 많은 뇌졸중 환자가 이 약의 치료 기간이 좁고 출혈성 합병증의 심각한 위험 때문에 이 약물에 반응하지 않습니다(Lee et al., 2012; Schellinger and Kohrmann, 2014). 혈전 용해 치료의 주요 과제는 뇌 손상 및 기능 파괴의 주요 원인으로 간주되는 허혈/재관류(I/R) 손상입니다. 뇌허혈 후 재관류는 뇌출혈의 위험을 증가시키면서 신경혈관 손상을 유발하고 혈액뇌장벽을 손상시키는 과도한 활성산소종(ROS)을 생성합니다(Alluri et al., 2015). 여러 연구에서 BBB의 파괴가 허혈성 뇌졸중 발병의 주요 원인임을 확인했습니다(Cao et al., 2016b).

BBB는 주로 내피 세포, 혈관 주위 세포, 성상 세포, 뉴런 및 기저막으로 구성됩니다. BBB의 핵심 구성 요소는 긴밀한 접합으로 연결된 대뇌 미세혈관 내피 세포이므로 외인성 분자가 뇌로 들어가는 것을 제한합니다. 긴밀한 접합부(특히 occludin, claudin{0}} 및 zonula occludens-1(ZO-1))의 병리학적 변화는 허혈성 뇌졸중 동안 BBB 기능, 특히 장벽 투과성에 상당한 영향을 미칩니다(Liu et al. al., 2014; Hu et al., 2018; Liu et al., 2019). I/R 기간 동안 과도한 ROS는 뇌 뉴런의 직접적인 손상으로 이어지는 주요 요인 중 하나입니다(Ding et al., 2014). ROS 과잉 생산은 특정 접합부의 분해 및 BBB 파괴로 이어지며, 이는 외인성 분자가 BBB를 통해 뇌로 들어가게 하여 뇌 손상을 악화시킵니다(Cheon et al., 2016; Zhang QY et al., 2017). 따라서 항산화제에 의한 BBB 보호는 재관류 손상을 예방할 수 있는 잠재적인 방법으로 간주되었습니다.

BBB의 파괴 외에도 I/R은 신경혈관 손상과 신경세포 사망을 초래할 수 있습니다(Jung et al., 2010). 뇌졸중 동안 증가된 신경 세포 사멸은 산화 스트레스로 인해 발생할 수 있으며(Chi et al., 2018), 많은 연구에서 ROS가 뇌졸중 중증도와 신경 손상을 악화시키는 것으로 나타났습니다(Kondo et al., 1997; Crack et al., 2001; Crack et al., 2006). 임상 시험이 만족스러운 결과를 얻지는 못했지만 신경 보호는 여전히 급성 허혈성 뇌졸중의 치료를 위한 유망한 전략입니다(Moretti et al., 2015). 따라서 뇌졸중 치료에 효과적인 신경 보호 약물을 찾는 것은 뇌졸중 환자에게 이점입니다.

한의학(TCM)은 신체의 내부 불균형에 대해 중재하는 조치를 취합니다(Gaire, 2018). 허혈성 뇌졸중의 복잡한 병인으로 인해 TCM과 그 활성 성분의 다인성 효과는 뇌졸중 치료에 중요한 역할을 합니다. Cistanche Deserticola YC Ma는 몽골과 중국 북서부의 건조 또는 반건조 지역에 널리 퍼져 있으며 중국에서 1,{3}}년 이상 건망증 및 우울증과 같은 다양한 질병의 치료에 널리 사용되는 한의학 약초입니다. . 현대의약리학적 연구에 따르면C. 데저티콜라학습 및 기억 기능 향상, 신경 보호, 면역 강화, 항산화, 노화 방지 및 항피로 효과와 같은 여러 약리학적 활성을 나타냈습니다(Ko and Leung, 2007; Wang et al., 2012; Li et al., 2015). C. Deserticola의 화학적 분석은 주요 구성 성분이 페닐에타노이드 배당체, 이리도이드 배당체, 다당류 및 올리고당을 포함하는 것으로 나타났습니다(Jiang and Tu, 2009). 그러나 뇌 보호를 위한 C. Deserticola의 활성 성분은 명확하지 않습니다.C. Deserticola의 신경 보호 특성은 뇌졸중 및 우울증과 같은 인지 관련 질병과 알츠하이머병에서 치료 가능성을 암시합니다(Wang et al., 2017). 그러나 그 영향에 대한 연구는C. 데저티콜라활성 구성 요소와 작용 메커니즘을 포함하여 뇌졸중에 대한 것은 매우 제한적입니다. 현재 작업에서 우리는 대뇌 I/R 손상에 대한 C. Deserticola, 총 배당체(TG, 페닐에타노이드 배당체 및 기타 배당체), 다당류(PS) 및 올리고당(OS)의 세 가지 추출물의 보호 효과를 조사했습니다. 우리의 발견은 정확한 임상 적용에 기여할 수 있습니다.C. 데저티콜라허혈성 뇌졸중 치료를 위한 후보 약제를 제공합니다.

재료 및 방법

화학물질 및 시약

Cistanche Deserticola의 줄기는 내몽골의 Alashan에서 구입했으며 저자 중 한 명이 확인했습니다(P.-F. Tu). TG, PS 및 OS는 이전에 보고된 방법에 따라 준비되었습니다(Gao et al., 2015). TG의 정량 분석은 앞서 설명한 대로 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 수행되었으며(Li et al, 2019), 그 크로마토그램은 그림 1에 나와 있습니다. TG의 주성분은 echinacoside, tubuloside A, acteoside, iso- 악테오사이드, 그리고 2'-아세틸락테오사이드; 그들의 함량은 각각 163.05 mg/g, 4.125 mg/g, 41.66 mg/g, 22.655 mg/g 및 12.045 mg/g입니다. PS 및 OS의 함량은 HPLC 및 페놀-황산 분석에 의해 각각 결정된 바와 같이 각각 69.42% 및 65.24%입니다(Zhang A. et al., 2018; Shi et al., 2019).

echinacoside(A0282), tubuloside A(A0942), acteoside(A0280), iso-acteoside(A0281) 및 2'-acetylacteoside(A0943)의 표준 참조는 Chengdu Must Biotechnology(중국 쓰촨)에서 구입했습니다. 모든 표준의 순도는 98% 이상입니다. Nissl 염색 H&E 키트는 Boster(중국 우한)에서 구입했습니다. Edaravone(T0407-1)은(는) Target Mol(중국 상하이)에서 구입했습니다. 토끼 항쥐 MAP{11}}(ab32454), Nrf{13}}(ab31163), PDGFRb(ab32570), Keap{16}}(ab66620) 및 마우스 항쥐 CD31(ab24590)을 구매했습니다. Abcam Inc(미국 메사추세츠주 케임브리지)에서. 토끼 항쥐 Claudin5(BS1069), ZO{24}}(BS9802M) 및 Occludin(BS72035)은 Bioworld Technology(중국 난징)에서 구입했습니다. Cell Signaling Technology Inc.(Boston, MA, USA)는 토끼 항쥐 시냅신{28}}(SYN,5297T), PSD95(3450T), a-평활근 액틴(a-SMA,19245T)의 공급원이었습니다. GAPDH(HRP{35}})는 Proteintech Group, Inc.(미국 시카고)에서 구입했습니다. 이차 항체는 Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Beijing, China)에서 공급했습니다. Hoechst 33258은 Beyotime(Jiangsu, China)에서 구입했습니다.

동물

Sprague-Dawley 쥐(수컷, 체중 250-300g)는 Vital River Laboratory Animal Technology(중국 베이징)에서 입수하여 12시간 명암 주기로 유지되는 에어컨 방에 수용했습니다. 모든 동물 실험은 동물 연구 ARRIVE 지침(Kilkenny et al., 2010; McGrath et al., 2010)에 따라 수행되었으며 Peking University Health Science Center의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(LA2019123)의 승인을 받았습니다.

동물 실험 프로토콜

이전에 설명한 대로 쥐에게 MCAO/R을 적용했습니다(Wang et al., 2018). 간단히 말해서, 좌총경동맥(CCA), 외경동맥(ECA), 내경동맥(ICA)을 노출시키고, 3-0 나일론 모노필라멘트 봉합사를 ECA에서 중앙에 도달할 때까지 ICA에 삽입했습니다. 대뇌동맥(MCA). MCA 폐색 1.5시간 후, 필라멘트를 제거하여 재관류를 시뮬레이션했습니다. 수술 중 모든 쥐의 체온은 37.0도를 유지하였다.

의약품 관리

래트를 SPSS 소프트웨어 버전 22.{1}}를 사용하여 무작위로 6개 그룹으로 분리했습니다(Jiang et al., 2014): 정상 그룹(NOR); 모델 그룹(MOD); 에다라본 그룹(양성 약물, 6mL/kg, EDI); TG 그룹(280 mg/kg, TG); PS 그룹(280 mg/kg, PS) 및 OS 그룹(280 mg/kg, OS). TG, PS 및 OS는 14일 동안 MCAO/R 투여 후 1일 1회 투여하였다. NOR 및 MOD 그룹은 생리식염수로 처리하였다. 동물 수는 표 1에 나와 있습니다.

체중 및 수정된 신경학적 결함 점수(mNSS) 측정

체중은 ADVENTURE™ 디지털 체중계(OHAUS, New Jersey, USA)를 사용하여 14일째에 모니터링되었습니다. mNSS는 FJ Wang(Wang et al., 2018)이 설명한 방법에 따라 약간 수정하여 평가되었습니다.

2, 3, 5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) 염색

경색 부피는 이전에 설명한 대로 측정되었습니다(Wang et al., 2015). 간단히 말해서, 뇌는 7개의 동일한 간격의 관상 블록(2mm)으로 분할되었습니다. 이 섹션은 37도에서 15분 동안 2% TTC(Coolaber, Beijing, China)로 염색되었습니다. 경색 용적(퍼센트) =(동측 허혈 반구 용적 - 대측 허혈 반구 용적)/대측 허혈 반구 용적 × 100.

Nissl 및 H&E 염색

쥐를 깊게 마취시킨 후 두개골에서 뇌 전체를 신속하게 제거하고 4% 파라포름알데히드를 사용하여 고정하고 파라핀 왁스에 묻힌 다음 7μm 두께의 조각으로 절편했습니다. 섹션은 Nissl 및 H&E로 염색되었습니다. 이 연구에서는 광학 현미경을 사용하여 각 조직 표본에서 6개의 무작위 200 × 200 µm 필드를 캡처했습니다. Nissl의 시체 수는 IPP 소프트웨어 버전 6.0(Media Cybernetics, Bethesda, USA)으로 계산되었습니다.

에반스 블루 어세이

쥐에게 MCAO/R 후 2% EB(Coolaber Science & Technology Co., LTD)를 주사했습니다. 2시간 후, 쥐를 마취시킨 다음 전체 뇌를 신속하게 제거하고 아세톤에서 균질화시켰다. 상층액은 800 TS 흡광도 판독기(BioTek, USA)에 의해 620 nm에서 분석되었습니다.

Catalase(CAT), Superoxide Dismutase(SOD), Malondialdehyde(MDA), Glutathione Peroxidase(GSH-Px)의 활성 측정

모든 혈청 샘플을 4도에서 15분 동안 4,{1}} × rpm으로 원심분리한 다음 제조업체의 지침(Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd, 중국).

웨스턴 블로팅 분석

각 쥐로부터 채취한 뇌 조직(100 mg)을 RIPA 용해 완충액에 균질화하여 용해한 후 BCA 키트(Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.)를 이용하여 단백질 농도를 분석하여 단백질 농도를 검출하였다. 조직 전체 단백질을 10% SDS-PAGE 겔에 로딩하고 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼습니다. 막을 5% 탈지유를 사용하여 차단한 다음 4도에서 1차 항체와 함께 밤새 인큐베이션했습니다. 그런 다음 멤브레인을 2차 항체와 함께 인큐베이션했습니다. 웨스턴 블롯 분석은 Kodak Digital Imaging System(5200 Multi, Tanon, China)을 사용하여 분석되었습니다.

면역형광 분석

CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP{5}}, Nrf{6}} 및 Keap{7}}에 ​​대한 면역형광 염색을 수행했습니다. Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO{11}}, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP{14}} 및 Keap{15}}에 대한 1차 항체는 다음으로 희석되었습니다. 1:2{27}}각각 0과 1:100입니다. Alexa Flur 488 마우스 항토끼 IgG 및 로다민(TRITC) 염소 항토끼 IgG의 이차 항체는 둘 다 1:200으로 희석되었습니다. 핵은 Hoechst 33258에 의해 염색되었습니다. 이미지는 Vectra® Polaris™ Automated Quantitative Pathology Imaging System(PerkinElmer, USA)을 사용하여 캡처되었습니다. 단백질 발현은 IPP 소프트웨어 버전 6.0을 사용하여 분석되었습니다.

통계 분석

모든 데이터는 평균 ± SD로 설명되었습니다. 통계 분석을 위해 SPSS 소프트웨어 버전 22.{1}}를 수행했습니다. 다른 그룹을 비교할 때 일원 ANOVA가 사용되었습니다. P < 0.05는="" 통계적="" 차이로="">

결과

TG는 MCAO/R 쥐의 체중을 늘리고 뇌 손상을 줄입니다

TG, PS, Oss 및 EDI로 14일 동안 치료한 후, I/R 쥐의 체중, 신경학적 결함 및 경색 부피를 평가했습니다. 결과는 MOD 그룹의 체중이 크게 감소한 반면 TG, PS 및 EDI 그룹의 감소된 체중은 증가함을 보여주었습니다(그림 2A). 신경학적 결손 점수는 EDI 및 TG에 의해 상당히 낮아졌습니다(그림 2B). NOR 그룹 쥐의 뇌 절편은 진홍색이었고 경색이 없었지만 MOD 그룹의 쥐는 큰 동측 뇌경색을 보였다. TG 처리 후 경색 부피는 상당히 감소했습니다(그림 2C, D). PS 및 OS 처리는 위의 지표에 명백한 효과를 나타내지 않았습니다. 위의 데이터는 TG가 I/R 유발 뇌 손상을 현저하게 완화할 수 있음을 보여주었지만 PS와 OS는 그렇지 못했습니다.

TG는 MCAO/R 쥐의 조직병리학적 손상을 개선합니다

조직병리학적 손상에 대한 TG, PS 및 OS 처리의 일부 효과를 확인하기 위해 H&E 염색을 수행하여 병리학적 손상을 확인했습니다. NOR 그룹의 뇌의 조직 형태학적 구조는 규칙적으로 배열되었습니다. TG 그룹의 형태 변화는 MOD 그룹보다 미미했습니다. 그러나 PS 및 OS 처리 그룹은 형태 변화의 유의미한 개선을 나타내지 않았습니다(그림 3).

TG는 I/R 유도 쥐 후 신경 손상을 약화시킵니다

Nissl 염색은 허혈성 영역의 반음부에서 뉴런의 조직병리학적 변화를 보여주었다. 도 4에 도시된 바와 같이, 정상 뉴런은 명확한 핵소체 및 손상되지 않은 구조를 가졌다. MOD 그룹에서 뉴런은 세포간 공간이 확장되었습니다. nissl 시체는 사라지고 줄어들었고 깊게 얼룩졌습니다. 그러나 이러한 변화는 EDI, TG 및 PS 그룹에서 거의 관찰되지 않았습니다. 이러한 결과는 TG 및 PS가 허혈/재관류 유발 신경 손상을 상당히 약화시킬 수 있음을 보여줍니다.

TG는 I/R 처리된 쥐 후 BBB 장애를 약화시킵니다.

Evans blue assay는 BBB 투과성의 변화를 연구하는 고전적인 방법입니다. 실험 결과, MOD 그룹에서 증가된 Evans blue가 관찰된 반면, TG 및 EDI 처리 래트에서 Evans blue가 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다. 또한 PS와 OS 치료 그룹 간에는 유의한 차이가 없었습니다(그림 5). 이러한 결과는 TG가 BBB 중단을 상당히 약화시킬 수 있음을 시사했습니다.

TG는 I/R 손상된 쥐에서 혈관신생을 촉진합니다

보다 최근의 연구는 혈관신생이 급성 허혈성 뇌졸중 후 신경학적 기능 회복 및 예후 결과에 중요한 역할을 한다는 것을 보여줍니다(Yuen et al., 2015). 혈관 신생에 대한 TG, PS 및 OS의 효과를 평가하기 위해 CD31 및 a-SMA를 사용하여 모세관 수를 정량화했습니다. 면역형광 염색은 MOD 그룹이 정상 쥐와 비교하여 I/R 쥐의 허혈성 영역의 반감기에서 CD31(그림 6A, B) 및 a-SMA(그림 6C, D)의 발현에서 현저한 감소를 야기함을 보여주었습니다. . 이 결과는 I/R이 허혈성 반구의 피질 반음부에 혈관 손상을 일으킬 수 있음을 보여줍니다. 그러나, TG 및 EDI 처리는 CD31 및 a-SMA의 증가된 발현에 의해 나타난 바와 같이 모세혈관 밀도, 혈관신생 및 동맥신생을 현저하게 증가시켰다. 이러한 결과는 TG가 I/R 쥐의 허혈성 반감기에서 혈관신생을 촉진할 수 있지만 PS와 OS는 그렇지 못함을 시사합니다.

TG는 I/R로 손상된 쥐에서 단단한 접합 단백질의 발현을 증가시킵니다

BBB 파괴는 뇌 수분 함량과 조직 팽창을 증가시켜 뇌 손상을 유발할 수 있습니다. 밀착 접합 단백질은 BBB의 중요한 구조적 구성 요소입니다(Tenreiro et al., 2016; Jiang et al., 2018). 뇌졸중 후 TG, PS 및 OS 처리가 BBB 무결성에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 면역형광 분석을 통해 ZO-1, claudin-5 및 occludin의 발현을 수행했습니다. 그 결과 claudin-5, occludin 및 ZO-1의 발현이 MOD 그룹에서 눈에 띄게 감소함을 나타냈다. 그러나 TG 투여 14일 후에는 상당히 증가하였다. PS 및 OS 그룹은 이러한 단백질 발현에서 유의한 변화를 나타내지 않았습니다(그림 7). 이러한 데이터는 TG가 밀착 접합 단백질 발현을 조절할 수 있고 I/R 손상 후 BBB 무결성을 유지할 수 있음을 나타냅니다. TG는 I/R로 부상당한 쥐의 모세혈관에 대한 혈관주위세포의 범위를 증가시킵니다. 따라서, 우리는 TG, PS 및 OS 처리에 의해 혈관주위세포 범위가 증가할 수 있는지 여부를 테스트했습니다. 면역형광 강도 분석 결과 PDGFRb와 CD31 발현이 MOD군에서 극적으로 감소하는 것으로 나타났다. I/R 쥐에 대한 TG 투여는 PDGFRb 및 CD31의 발현 강도를 유의하게 회복시키거나 심지어 증가시켰지만 PS 및 OS 처리군에서는 차이가 관찰되지 않았습니다(그림 8). 따라서, TG의 치료는 혈관주위세포의 범위를 상당히 증가시킬 수 있습니다. 이러한 발견은 TG가 I/R 후에 BBB의 무결성을 유지할 수 있음을 추가로 확인했습니다.

TG는 I/R 손상 쥐의 신경 리모델링 촉진

수많은 연구에 따르면 뇌졸중 후 신경 발생은 기능 회복을 크게 향상시킬 수 있습니다(Grefkes and Ward, 2014; Zhang et al., 2019). Synaptophysin(SYN), postsynaptic density 95(PSD-95) 단백질 및 microtubule-associated protein 2(MAP-2)는 피질의 허혈성 반감기에서 신경 가소성을 조사하기 위한 마커로 사용되었습니다. I/R 손상된 쥐의 신경발생에 대한 TG, PS 및 OS 처리의 효과를 평가하기 위해 SYN, PSD95 및 MAP{8}} 발현에 대한 면역형광 및 웨스턴 블롯을 수행했습니다. 그림 9 및 10에서 볼 수 있듯이 재관류 14일 후 I/R 쥐의 SYN, PSD95 및 MAP{12}} 발현 수준은 NOR 쥐에 비해 감소한 반면 TG 및 PS 치료는 유의하게 증가할 수 있었습니다. 그들의 발현 수준을 조절합니다. OS군은 MOD군에 비해 유의한 변화가 없었다. 데이터는 TG 및 PS 치료가 I/R 손상 후 신경 리모델링을 극적으로 촉진할 수 있음을 나타냅니다.

TG는 I/R로 부상당한 쥐에서 Nrf-2 및 Keap-1 식을 변경합니다.

산화 스트레스는 I/R 손상의 주요 병원성 메커니즘입니다(Ya et al., 2018; Yu et al., 2018). 연구에서는 Nrf{2}}가 항산화 반응의 마스터 조절자임을 확인했습니다(Thompson et al., 2015). I/R 손상 후 Nrf-2 및 Keap{5}} 매개 산화 반응을 조사하기 위해 Keap-1의 세포질 발현과 핵 전위를 평가했습니다. 한편, I/R 손상된 쥐의 뇌 조직에서 Nrf-2의 발현도 분석하였다(도 10 및 11). 면역형광 분석에 따르면 Nrf{10}}는 NOR 그룹에서 주로 세포질에 위치하는 것으로 나타났습니다. TGs 그룹에서 세포질 국재화에서 Nrf{11}}의 발현은 하향 조절되었지만 핵에서는 상향 조절되었으며 감소된 Keap{12}} 발현도 관찰되었습니다. 데이터는 TG의 뇌 보호가 Nrf{13}} 및 Keap{14}}의 변조와 관련될 수 있음을 보여주었습니다.

TG는 I/R 부상당한 쥐의 뇌 조직 산화 스트레스를 약화시킵니다

TG의 항산화 효과를 확인하기 위해 I/R 손상 쥐에서 SOD, CAT, GSH-Px 및 MDA의 활성을 평가했습니다. Figure 12에서 MOD군에서 MDA의 함량이 현저히 증가함과 동시에 정상 쥐에 비해 SOD, CAT, GSH-Px의 활성은 감소하였다. 반대로, TG 처리는 MDA의 함량을 유의하게 감소시키고 SOD, CAT 및 GSH-Px의 활성을 증가시켰다. 이러한 결과는 TG의 항산화 활성을 더욱 확인시켜 주었다.

논의

많은 연구에 따르면 TCM은C. 데저티콜라학습, 기억 및 면역 능력 향상과 같은 광범위한 생물학적 활성을 가지고 있습니다(Dong et al., 2007; Jiang and Tu, 2009; Wang et al., 2017; Xia et al., 2018). 그러나 신경 보호를 위한 C. Deserticola의 활성 성분은 아직 명확하지 않습니다. 현재 작업은 활성 구성 요소를 스크리닝하는 것을 목표로 합니다.C. 데저티콜라MCAO/R 모델에서 허혈성 뇌졸중에 대해 C. Deserticola의 세 가지 추출물(TG, PS 및 OS)을 사용하여 MCAO/R 쥐에 대한 효과와 가능한 메커니즘을 평가했습니다.

뇌졸중은 흔한 급성 뇌혈관 질환입니다. 역학 연구에 따르면 뇌졸중은 여성보다 남성에게 더 흔합니다(Sealy-Jefferson et al., 2012; Guzik and Bushnell, 2017). 따라서 우리의 실험에서는 수컷 쥐를 테스트에 채택했습니다. 우리의 결과는 I/R 유도가 산화 스트레스와 경색 부피를 가속화하여 BBB를 파괴하고 신경 및 뇌혈관 손상으로 이어진다는 것을 입증했습니다. 스크리닝 후, TG는 경색 부피를 감소시키고 신경 리모델링 및 혈관신생을 촉진하는 것으로 밝혀졌습니다. 또한, TG는 I/R 손상 후 BBB 무결성을 유지하는 것으로 관찰되었습니다. 반대로 PS 및 OS는 I/R 손상을 크게 완화하지 않습니다. 따라서 TG는 주요 활성 분획으로 간주됩니다.C. 데저티콜라Nrf{0}}/Keap{1}} 경로 활성화를 통해 잠재적으로 신경 리모델링, 혈관신생 및 BBB 무결성을 촉진함으로써 신경 보호를 위한 것입니다.

증가하는 증거는 효과적인 측부 순환의 확립이 경색 및 허혈성 반음부의 형성을 방지하는 데 상당히 중요하며, 허혈성 뇌졸중의 초기 단계에서 중요한 치료임을 나타냅니다(ElAli, 2016; Iwasawa et al., 2016). 허혈성 경색 후 혈관 내피 세포와 평활근 세포의 증식은 측부 순환의 확립을 결정합니다. 그러나 허혈 모델은 공통적인 현상이 있습니다. 즉, 산화 스트레스가 뇌 미세혈관에 널리 존재합니다. 연구 데이터에 따르면 많은 항산화제가 BBB의 기능과 혈관신생의 특성을 방해할 수 있습니다(Mentor and Fisher, 2017). CD31 및 a-SMA는 각각 혈관 내피 세포 및 평활근 세포의 마커입니다(Saboor et al., 2016). 위 추출물이 세포 증식에 ​​미치는 영향을 조사하기 위해C. 데저티콜라, 우리는 대뇌 허혈성 반음부 균질액에서 CD31 및 a-SMA의 발현을 조사했습니다. 우리의 데이터는 TG가 CD31 및 a-SMA의 발현을 현저하게 향상시키는 것으로 나타났습니다. 그러나 PS군과 OS군에서는 유의한 차이가 없었다. 따라서 우리는 TG가 CD31 및 a-SMA의 발현을 증가시켜 혈관신생을 촉진함으로써 뇌 손상을 감소시킬 수 있는 반면 PS 및 OS는 뇌 손상으로부터 그러한 보호를 제공하지 않을 수 있다고 추론했습니다. 이러한 결과는 TG만이 대뇌 I/R 손상을 예방할 수 있음을 추가로 확인했습니다.

허혈성 뇌졸중은 신경 가소성의 손상 또는 뇌 영역의 리모델링으로 인한 뇌허혈의 결과로 생각할 수 있습니다. 대부분의 뇌졸중 환자는 신경학적 결손을 겪는다. 신경 발생을 활성화하는 것은 뇌졸중 환자가 신경 기능을 향상시키는 유망한 전략입니다(Cramer and Chopp, 2000). 신경발생은 뇌 I/R 손상 후 신경 기능 회복에 직접 참여합니다(Zhang et al., 2019). 이전 연구는 TG가 해마 피라미드 세포의 생존율을 향상시키고 신경 발생을 유도할 수 있음을 보여줍니다(Lian et al., 2017). 산화 스트레스는 파킨슨병, 뇌졸중 등과 같은 많은 질병에서 뉴런의 손실을 유발합니다(Duan and Si, 2019; Singh et al., 2019). Nrf-2는 주로 SOD, MDA, CAT 및 g 글루타밀 시스테인 리가제 등을 포함하여 프로모터 영역에서 신경 보호와 관련된 많은 유전자를 전사합니다(Satoh et al., 2006). 시냅스 형성 및 신경 전달과 밀접한 관련이 있는 SYN, PSD-95 및 MAP-2 단백질은 허혈성 반음부 영역에서 연구 신경 가소성의 마커로 간주될 수 있습니다. 연구 후 우리는 TG를 사용한 치료가 PSD95, SYN 및 MAP{10}}의 발현을 크게 증가시킬 수 있다는 것을 발견했으며, 이는 TG의 뇌 보호가 I/R 동안 향상된 신경 가소성과 상관관계가 있음을 나타냅니다. 다만, PS군은 물론 OS군에서도 뚜렷한 차이가 없는 점은 아쉽다. 이러한 결과는 TG가 대뇌 I/R 손상 후 신경 가소성을 향상시킬 수 있음을 나타냅니다.뇌졸중 환자에 대한 영상 연구에 따르면 BBB 기능 장애는 허혈성 뇌의 두드러진 특성으로 생각할 수 있습니다(Bang et al., 2007). 세포질 단백질, 막횡단 단백질 및 모세관 내피 세포 간의 접합부 접착 분자로 구성된 TJ는 BBB 무결성을 유지하는 데 매우 중요합니다(Ye et al., 2019). 그 중 ZO-1, claudin-5 및 occludin은 TJ에서 가장 중요한 단백질입니다. 많은 증거에 따르면 허혈에 의해 유발된 BBB의 투과성 증가는 일반적으로 ZO{4}}, claudin{5}} 및 occludin의 변경과 상관관계가 있음을 나타냅니다(Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu et al., 2017; Liu et al., 2018). 이 연구에서 결과는 TG가 MCAO로 유도된 뇌 조직에서 ZO{10}}, claudin{11}} 및 occludin 단백질의 발현을 크게 증가시킬 수 있지만 PS나 OS는 그렇지 않다는 것을 보여주었습니다. BBB는 대뇌 내피 세포로 구성되며 혈관주위세포와 밀접하게 연관되어 있습니다(Nyul-Toth et al., 2016). Pericytes는 BBB 무결성에 필수적입니다(Bell et al., 2010). 허혈성 뇌졸중은 급성기에 혈관주위세포의 죽음과 뇌 내피 세포의 분리를 유발하여 미세혈관을 불안정하게 만들고 BBB 특성을 변경합니다(Zechariah et al., 2013). 우리의 데이터는 TG가 모세혈관의 혈관주위세포 범위를 증가시키고 ZO{17}}, claudin{18}} 및 occludin의 발현 수준을 증가시킬 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 현상은 TG가 대뇌 I/R 손상 후 BBB 무결성을 효과적으로 보호할 수 있음을 입증했습니다. 요약하면, TG는 혈관신생 촉진, 신경 가소성 개선, BBB의 완전성 유지와 같은 여러 방식으로 뇌 손상을 약화시킬 수 있습니다.

그런 다음 우리는 TG 뇌 보호의 기본 메커니즘을 탐색하기 위해 신호 전달 경로를 조사했습니다. I/R 손상의 과정은 다인자적이며 따라서 수많은 메커니즘이 발병에 관여합니다. 산화 스트레스는 BBB 구조 손상, 혈관 내피 기능 장애 및 허혈성 신경 손상의 악화(Xiong et al., 2015; Caglayan)와 같은 I/R 유발 뇌 손상(Suda et al., 2013)에 기여하는 근본적인 위험 요소입니다. et al., 2019; Priestley et al., 2019). 따라서 산화 스트레스는 I/R 유발 뇌 손상에서 매력적인 치료 표적이 되었습니다. 핵인자 E2-관련 인자-2(Nrf{9}})에 의해 매개되는 2상 효소는 뉴런이 산화 스트레스로부터 자신을 보호하는 중요한 수단으로 간주되어 왔습니다(Suzuki 및 Yamamoto, 2015; Ya et al., 2018). 많은 증거에 따르면 I/R 중 Nrf{12}}의 활성화는 신경 보호의 잠재적 치료 표적이 됩니다(Ding et al., 2015; Zhang R. et al., 2017). 내인성 항산화 방어의 중요한 조절자인 Nrf{15}}는 헴 옥시게나제 1(HO{17}}) 및 NAD(P)H 퀴논 산화환원효소 1(NQO1)과 같은 기타 항산화 효소의 수준을 매개합니다. SOD, CAT, GSH 및 MDA(Siow et al., 2007; Ding et al., 2014). 또한 Nrf{22}}는 혈관신생에서 중요한 조절자 역할을 합니다. 본 연구는 Nrf{23}}가 혈관 발달 과정에서 크게 향상되고 활성화될 수 있음을 보여줍니다(Wei et al., 2013).

이전에 설명한 바와 같이(Jiang and Tu, 2009), TG는 echinacoside, tubuloside A, acteoside, iso-acteoside 및 2'-acetylacteoside와 같은 많은 생리 활성 화합물을 함유하고 그 중 일부는 뇌 I/R 후 신경 보호 기능을 나타냅니다. 부상(Peng et al., 2016). Echinacoside는 항산화, 항노화, 신경보호, 항염, 반흔화 촉진, 간보호, 골형성 촉진, 항종양 활성 등 많은 약리학적 효과를 가지고 있다(Yu et al., 2016; Li et al., 2018, Zhang Y. et al., 2018, Ji et al., 2019, Xu et al., 2019). 최근 에키나코사이드는 중추신경계에서 강력한 항산화제로 확인되었습니다(Lu et al., 2016). Echinacoside는 허혈성 뇌 손상에서 MDA 함량을 줄이고 SOD 및 GSH Px의 활성을 개선할 수 있으며 분자 도킹 분석은 echinacoside가 Keap{14}}에 결합하여 Nrf{15}} 핵 전위(Li et al., 2018). Xia에 대한 연구는 악테오사이드가 경색 부피와 뇌 수분 함량을 감소시켜 산화 스트레스를 완화함으로써 MCAO/R 쥐의 신경학적 결손을 개선할 수 있음을 보여주었습니다(Xia et al., 2018). 다른 연구에서는 iso-acteoside가 H2O 처리된 V 세포에서 세포 항산화 효소, SOD 및 CAT의 활성을 증가시킬 수 있음을 보여주었습니다(Chae et al., 2005). TG에 포함된 활성 화합물에 대한 위의 보고를 바탕으로 TG가 항산화 경로를 통해 허혈성 뇌졸중을 예방할 수 있다고 추론할 수 있습니다.

Li는 Nrf2/ARE 경로를 통해 PC12 세포에 대한 H2O 유도 세포자멸사에 대한 페닐에타노이드 배당체(PhG)의 신경보호 효과에 대해 보고했습니다(Li et al., 2018). 이러한 PhG는 Nrf2 핵 전위를 유발하고 H2O{6}}, NQO1, 글루타메이트-시스테인 리가아제 촉매 소단위(GCLC) 및 글루타메이트-시스테인 리가아제 변형 소단위(GCLM)의 발현을 증가시켜 크게 억제되었습니다(Li et al., 2018 ; 공 등, 2019). 따라서 이러한 발견은 Nrf{12}}/ARE 경로가 신경 세포에 대한 PhG 매개 보호 효과에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다. 유사하게, 이 연구에서 우리는 TG가 I/R 쥐에서 MDA 수준을 감소시키고 SOD, CAT 및 GSH-Px 수준을 증가시킬 수 있음을 발견했습니다. 한편, TG는 핵에서 Nrf2 발현을 상향 조절하고 세포질에서 상응하는 발현을 하향 조절하며 Keap{16}} 발현을 크게 감소시킬 수 있습니다. 따라서 Nrf{17}}/Keap{18}} 경로는 TG 매개 신경 보호 효과에 관여할 수 있습니다. 이 경로의 추가 검증은 미래에 산소-포도당 결핍/재산소화 손상 모델을 사용하여 시험관 내 세포 배양에서 수행될 것입니다. 더구나,C. 데저티콜라추출물은 우리 연구에서 14일 동안 지속적으로 투여되었습니다. 성인 신경 발생은 재관류 14일 동안 신경 보호 효과의 해석에 영향을 미치므로 CT의 신경 보호 효과를 탐색하는 현재 실험 설계에서 신경 발생을 배제할 수 없습니다. 이것이 우리 연구의 한계입니다.

결론적으로 TG는C. 데저티콜라이는 I/R 손상 쥐에서 BBB의 완전성을 유지할 뿐만 아니라 혈관신생 및 신경발생을 향상시킬 수 있지만 PS 및 OS는 그렇지 않습니다. 효과는 Nrf{0}}/Keap{1}} 경로의 활성화에 의해 조정될 수 있습니다.