FAIMS 3부로 뇌 조직의 하향식 단백질체학 강화
Aug 27, 2024
즉각적이고 명백한 관찰 중 하나는 존재비 백분위수가 높을수록 TDP로 식별될 확률이 높아진다는 것입니다. 즉, TDP는 대부분 매우 풍부한 단백질을 식별합니다.
나이가 들면서 기억력이 감퇴되는 것을 느끼는 사람들이 많습니다. 이는 특히 장기적인 정신적 스트레스, 수면 부족, 불균형한 식습관을 경험한 후에 흔히 나타나는 현상입니다.
하지만 기억력을 향상시키는 데 도움이 되는 한 가지 방법이 풍부한 단백질 섭취를 늘리는 것이라는 사실을 알고 계셨나요? 고농축 단백질에는 아미노산이 풍부해 뇌에서 신경전달물질이라는 분자를 합성할 수 있고, 신경세포의 성장과 활동도 촉진한다. 뉴런은 뇌의 가장 기본적인 단위이며 학습 및 기억 능력의 핵심입니다. 그러므로, 풍부한 단백질은 뉴런의 기능을 향상시켜 기억력을 향상시킬 수 있습니다.
연구에서는 또한 단백질과 기억 사이의 관계가 입증되었습니다. 예를 들어, 한 연구에서는 고단백 식단에 비해 저단백질 식단이 주의력과 기억력을 포함한 뇌 기능 저하를 초래한다는 사실을 발견했습니다.
따라서 기억력을 향상시키고 싶다면 닭고기, 생선, 쇠고기, 계란, 두부 등과 같은 단백질이 풍부한 식품을 식단에 추가하는 것이 좋습니다. 물론 균형에도 주의를 기울여야 합니다. 식단도 다양하고, 한 종류의 음식만 먹을 수는 없습니다.
즉, 풍부한 단백질은 우리의 기억력을 향상시키는 데 도움이 될 수 있습니다. 더 나은 기억력을 갖고 싶다면 식단부터 시작하여 가능한 한 많은 고단백 음식을 섭취하는 것이 좋습니다! 이는 우리가 기억력을 향상시켜야 함을 보여주는데, 시스탄체는 기억력과 학습에 매우 중요한 아세틸콜린과 성장인자의 수치를 높이는 등 신경전달물질의 균형도 조절할 수 있기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 또한 Cistanche는 혈류를 개선하고 산소 전달을 촉진하여 뇌가 충분한 영양과 에너지를 얻을 수 있도록 하여 뇌 활력과 지구력을 향상시킬 수 있습니다.
하향식 데이터 세트(FAIMS 유무에 관계없이)에서 식별된 유전자의 약 절반은 상향식 분석을 위한 풍부도 저장소의 상위 20% 내에 포함되었습니다(그림 6A). 반대로, 71개의 유전자는 하향식 데이터 세트("NA" bin)에서만 발견될 수 있습니다(그림 6A).
이들 유전자는 상대적으로 짧은 단백질을 나타내는 것으로 나타났습니다.<150 AA) and contained numerous basic Lys/Arg residues which, presumably, precluded their ability to be detected by bottom-up analysis.
예를 들어, 하향식 빈에는 H3C1, H4C1, H1-4 및 H2BC12와 같은 히스톤 단백질이 포함되어 있습니다. 예상대로 FAIMS는 "FAIMS 없음"보다 낮은 백분위수에서 식별을 향상시켜 깊이를 높일 수 있음을 발견했습니다. 관찰 가능한 프로테옴의
모든 백분위수에 걸쳐 FAIMS 대 "FAIMS 없음"의 비율을 결정함으로써 40번째 백분위수 미만의 식별이 눈에 띄게 증가하는 것은 -40~-50 범위의 CV 내에서 명백합니다(그림 6B).
그러나 유전자의 절대적인 수를 고려할 때 FAIMS의 이점에 대한 주요 기여는 모든 풍부 백분위수에 대한 식별 스펙트럼을 넓힌다는 것입니다.
FAIMS CV와 프로테오폼 전송 간의 관계
FAIMS를 사용하여 FAIMS CV와 프로테오폼 분자량 사이의 추세도 확인했습니다(그림 7). -50 CV에서 중간 프로테오폼 질량은 ~5 kDa이고 -20CV에서 ~15 kDa로 증가합니다.
이러한 질량 분포(그림 7)에 따르면 -50V 미만의 CV는 하향식 또는 미들다운 단백질체학 실험에 매우 적합한 것으로 나타나는 반면, -50V보다 큰 CV는 펩티도믹 또는 상향식 실험에 가장 도움이 될 수 있습니다.
관찰된 분자량 추세는 아마도 -20 CV 이상으로 확장된 것으로 추정됩니다. 그러나 우리는 프로테오폼 및 유전자 식별의 감소를 기반으로 검색을 -20 CV로 제한하여 실행당 프로테옴 시퀀스 범위의 수익이 감소했습니다.
FAIMS를 사용한 이전 연구에서는 +40 CV가 NIST mAb 중쇄(~51kDa)를 전송하기 위한 이상적인 전압이고 -20 CV가 해당 경쇄(~23kDa)에 가장 적합하다는 것을 발견했으며, 이는 이러한 아이디어를 뒷받침합니다. 우리가 관찰한 추세는 긍정적인 FAIMS CV로 확장됩니다.45
흥미롭게도, 단일 프로테오폼을 식별하는 많은 스펙트럼은 10V 범위(5165개 중 3599개) 내에서 발견되는 것으로 제한되었지만 -50에서 -20까지 전체 CV 범위에서 7개의 프로테오폼이 관찰되었습니다. 아마도 이는 특히 유비퀴틴(UBB), 미엘린 염기성 단백질 및 아실CoA 결합 단백질의 경우 샘플 내 풍부함이 높기 때문일 수 있습니다.
그러나 이러한 단백질 형태의 다양한 전하 상태는 양성자 이성질체화에 따라 여러 가지 기상 형태를 채택하여 이동성에 영향을 미칠 가능성이 있습니다.42
이 7가지 단백질 형태를 통해 우리는 CV 변조를 통해 전하 상태 포락선이 차등적으로 전송되는 방식을 조사할 수 있었습니다. 각 CV의 전하 상태 분포에 대한 프록시로서 각 CV에서 식별된 PrSM(Proteoform-spectrum-matches)을 기반으로 한 중앙 전하 상태를 사용하고 이 값이 -50 CV에서 시작하는 CV의 함수로 어떻게 변경되는지 추적했습니다.
그림 S3의 MS1 스캔은 중앙 PrSM 충전 상태가 UBB의 충전 상태 분포를 추적하는 방법을 보여줍니다. 이들 7개의 프로테오형 중 4개는 CV가 감소함에 따라 관찰된 중앙값 전하 상태가 증가하는 역관계를 따랐습니다(그림 8).
이러한 경향이 일반적으로 펩타이드와 소형 단백질에서 관찰되었다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 놀랍게도 세 가지 단백질형은 CV가 감소하면 관찰된 중앙 전하 상태가 감소하는 반대 관계를 보여주었습니다(그림 8).
두 그룹 사이의 평균 전구체 질량을 대략적으로 조사한 결과, CV가 감소함에 따라 더 큰 전구체가 더 높은 전하 상태를 선호할 가능성이 더 높다는 것을 알 수 있습니다.
이러한 관계를 더욱 검증하기 위해 우리는 보다 적당하지만 여전히 넓은 20-30 CV 범위(n=256 프로테오폼) 내에서 식별된 프로테오폼을 포함하도록 이 분석을 확장했습니다. 여기서 중간 전하가 1개 이상의 전하로 이동한 프로테오폼 전체 CV 범위는 해당 이동 방향에 따라 두 개의 서로 다른 그룹으로 분류되었습니다.
1회 미만의 전하를 이동한 것은 CV 변경과 관련하여 "중립"으로 간주되었습니다. 이전 결과와 유사하게, 더 큰 전구체는 관찰된 전하 상태와 CV 사이의 역관계와 연관될 가능성이 훨씬 더 높습니다(표 S2).
CV가 감소함에 따라 대부분의 프로테오폼은 더 높은 전하 상태(n=39)를 선호하는 프로테오폼에 비해 더 낮은 전하 상태(n=177)에서 전송하는 것으로 나타났습니다. Theremainder(n= 40)는 CV 변경과 관련하여 "중립"으로 간주되었습니다.
중립 그룹 내에서 비닝된 프로테오폼은 역그룹과 직접 그룹 사이의 평균 전구체 질량을 보여 주었으며, 이는 다시 한번 프로테오폼의 질량이 이 동작과 본질적으로 연결되어 있음을 시사합니다.
그러나 염기성/산성 아미노산 조성 및 지방족 지수와 같은 다른 1차 서열 기반 매개변수는 유의미한 상관관계가 없었습니다(표 S2).
가스상으로 도입되는 단백질은 변성된 것으로 추정되지만, 쌍극자 모멘트 또는 충돌 단면과 같은 기본 단백질과 일반적으로 연관된 요인은 이 현상에 대해 더 나은 예측 가치를 가질 수 있습니다.64-66 우리의 결과는 CV가 다양한 단백질을 필터링하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 질량, 그리고 단백질의 전하 상태 봉투가 FAIMS를 통해 어떻게 차별적으로 전달될 수 있는지도 알아봅니다.
TDP 실험에서 단백질 단편의 유용성
놀랍게도, 우리가 확인한 상당수의 단백질형은 더 큰 단백질의 단편이었습니다. 우리는 확인된 고유한 프로테오폼의 25%만이 파생된 단백질 서열의 절반 이상을 덮고 있음을 발견했습니다.
이 25%의 평균 질량은 11.4kDa이고 나머지 75%의 평균 질량은 5.7kDa입니다. 여러 요인이 이 관찰에 기여할 수 있으며 그 중 일부는 FAIMS와 무관합니다.
예를 들어, 이러한 단편 자체는 세포 "분해"의 일부로 정상적인 항상성 조건에서 생성되거나 사후 간격 및 시료 취급 중에 도입된 다양한 예방 조치에도 불구하고 생성된 단백질 분해 절단 산물일 수 있습니다.
중추신경계 조직은 일반적으로 훨씬 더 큰 전구체 단백질에서도 파생되는 "신경펩티드"로 알려진 신호 전달 펩티드의 풍부한 공급원입니다.68
확립된 신경펩티드 데이터베이스(NeuroPedia)와 우리의 프로테오형 식별을 상호 참조함으로써 우리는 바소스타틴-1, 세크토뉴린, 콜레시스토키닌-58 데스노노펩티드, 신경펩티드 y 및 많은 비정규 서열 변종을 포함한 여러 가지 신경펩티드를 식별할 수 있었습니다. 알려진 신경펩티드 생산 유전자에서 유래되었습니다.
생물학적 요인 외에도 특정 기기 매개변수도 단백질 단편의 관찰에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어 소스 내 낮은 "단편화" 전압(10~20V)은 일반적으로 부가물을 제거하고 단백질 이온을 탈용매화하는 데 사용할 수 있는 반면, 더 높은 전압은 생산원에 의한 해리.
그러나 해리에 대한 아미드 결합의 민감성은 매우 다양하며 단백질의 크기가 증가함에 따라 Xaa-Pro와 같은 불안정한 아미드 결합을 포함할 가능성도 커집니다. 이를 통해 As b- 및 y-이온이 우연히 생성될 수 있습니다. 낮은 소스 전압에서도 조각 이온이 기기에 유입될 가능성을 줄이기 위해 소스 전압을 적용하지 않기로 결정했습니다.
단백질이 FAIMS에서 생성된 전기장을 통과할 때 단편화 현상에 취약할 수도 있습니다. 그러나 이러한 조각은 모 이온과 동일한 이동성을 가질 것으로 예상되지 않으며 이는 전구체 이온에 비해 조각의 크기에 따라 달라질 수 있다는 주의 사항이 있습니다.
마지막으로, 더 작은 단백질 형태의 관찰에 편향될 수 있는 몇 가지 요인을 지적할 가치가 있습니다(<∼15 kDa). First and foremost is the signal spreading that occurs as the size of a proteoform increases.74
이러한 신호 확산은 주로 각 전하 상태의 전하 상태 봉투 및 동위원소 분포에 기인할 수 있습니다. 우리의 실험 설정에는 샘플 준비의 최종 여과 단계로 크기 3K MWCO 필터를 사용하는 것이 있었는데, 이 경우 더 작은 아밀로이드 베타 프로테오폼이 존재하는 경우 효율적으로 캡처할 수 있도록 선택되었습니다.
사중극자 조정, 전기역학적 포획, Orbitrap 셀의 잔류 가스 분자와의 충돌을 포함하여 일반적인 도구적 요인도 작은 단백질형에 대한 편향을 생성할 수 있으며, 이로 인해 더 큰 분자에 대한 과도 현상이 더 빨리 감쇠됩니다.75 이러한 편향이나 정확한 기원에 관계없이 조각 중 프로테옴에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
이러한 단편은 단백질 항상성 장애가 일반적으로 병리와 연관되어 있는 신경퇴행성 질환의 맥락에서 특히 유용합니다.76,77
실제로, 타우 조각은 종종 신경독성이 있고 AD와 같은 타우병증의 진행에 역할을 하는 것으로 밝혀졌습니다. 일반적으로 우리가 관찰하는 조각은 트립신 펩타이드보다 훨씬 크며, 특정 단백질에 대한 조각이 많은 경우도 있습니다. , 우리는 상당한 서열 적용 범위를 관찰합니다.
이는 그림 9A, B에 표시된 대로 ~50 kDa 튜불린알파-1B 사슬(TUBA1B) 및 ~70 kDa 시냅신-1(SYN1)에 대한 적용 범위를 제공하는 단편을 검사하여 예시됩니다. 복잡한 샘플의 TDP에서 전체 길이 형태로 관찰하기 어려운 단백질.
신경퇴행성 질환과 관련된 단백질형의 식별
하향식 분석과 함께 FAIMS를 활용하면 267개의 고유한 스플라이스 변형과 96개의 TrEMBL 항목을 포함한 여러 고유한 Swiss-Prot 스플라이스 변형 및 TrEMBL 항목을 식별할 수 있습니다(표 S3).
특히, 우리는 신경 세포 접착 분자1(NCAM1)에 대한 대체 ORF 이소형(A{0}}A0D9SF30)을 명확하게 식별하는 여러 PrSM을 관찰합니다. 우리는 또한 여러 신경퇴행성 질환, 특히 α-synuclein과 PARK7에서 역할이 알려진 유전자로부터 유래된 단백질형을 관찰했습니다.
이 두 경우 모두에서 우세한 단백질형은 전체 길이의 서열을 포함합니다. 흥미롭게도 α-시누클레인, 시누클레인 및 (적지만) β-시누클레인 PrSM의 대부분은 C-말단 근처에서 ~177 Da의 알려지지 않은 질량 이동을 포함하는 것으로 밝혀졌습니다(그림 S4A에 표시된 대로 변형이 알려지지 않은 전체 길이의 α-시누클레인 스펙트럼). .
이러한 질량 이동은 공개 데이터베이스 검색에서 이전에 관찰되었으며 일반적으로 Asp 또는 Gluresidues에서 발견됩니다.78 변형의 평균 및 단일동위원소 질량과 밀접하게 일치하는 잠재적인 설명은 3개의 철 원자와 7개의 수소 원자의 손실로 구성됩니다( Unimod 가입 #1971 기반).
-synuclein의 a242+ 조각 이온의 동위원소 피크(그림 S4B)를 알려지지 않은 변형에 속하는 것으로 생각되는 앞서 언급한 요소를 포함하는 시뮬레이션 스펙트럼(그림 S4C)과 비교하면 두 동위원소 분포 간의 유사성을 보여줍니다. 많은 동위원소 피크가 서로 2ppm 이내에 정렬되어 있습니다.
또한 가장 왼쪽의 동위원소 피크는 자연적으로 발생하는 철 동위원소에 고유하며 이러한 피크의 부재는 3철 원자를 포함하지 않고 스펙트럼을 시뮬레이션할 때 쉽게 명백해지며(그림 S4D), 이 알려지지 않은 변형이 구성되었을 가능성이 매우 높다는 것을 강력히 암시합니다. 제안된 요소 중
이전 연구에서는 또한 다양한 금속 이온에 대한 α-시누클레인의 높은 친화력을 설명했으며, 이 변형을 포함하는 것으로 관찰된 영역은 결합에 관여하는 것으로 알려진 잔기, 특히 119DPDNEA124모티프(그림 S5)와 겹칩니다.
우리의 데이터는 또한 -synuclein과 -synuclein의 C 말단 영역이 동일한 알려지지 않은 질량 이동을 갖는 여러 스펙트럼이 이들 단백질 내의 유사한 서열과 일치됨에 따라 금속 결합에서 유사한 역할을 가지고 있음을 시사합니다.
미토콘드리아 단백질 PARK7에 대해 우리는 단일 활성 부위 Cys 잔기 C106에서 ~116.0 Da 질량 이동을 확인했습니다(그림 S6). 유사한 델타 덩어리 석시닐화에 대한 한 가지 잠재적인 설명은 미토콘드리아 스트레스에 기인하고 Michael이 Cys 티올 그룹에 푸마르산염을 첨가함으로써 형성되는 변형입니다.82
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