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쥐를 대상으로 한 알츠하이머병과 골다공증의 동시 실험 모델 구축

Yi Chena 외

요약

민족약리학적 관련성: 시스탄체 튜불로사골다공증 치료에 널리 사용되어온 귀중한 한약재로알츠하이머병. Echinacoside와 acteoside가 주성분이다.시스탄체 튜불로사연구 가치가 있는 약리학적 활성이 있는 것. echinacoside와 acteoside는 학습 및 기억 능력을 향상시키고 조골 세포의 증식과 분화를 촉진할 수 있다고 보고되었습니다.

연구 목적: Echinacoside 및 acteoside시스탄체 튜불로사항-골다공증 및 항-골에 대한 상당한 활성을 나타내었다.알츠하이머병, 이러한 효과는 쥐 모델에서 동시에 연구되지 않았습니다. 이 연구의 목적은 다음과 결합된 골다공증 모델을 확립하고 검증하는 것이었습니다.알츠하이머병inrats와 이 동시 모델에 대한 echinacoside와 acteoside의 이중 효과를 조사하기 위해.

재료 및 방법:난소 절제술(OVX), D-갈락토스 및 AlCl3를 사용한 모의 수술(D), D-갈락토스 및 AlCl3(OVX + D)를 사용한 난소 절제술의 세 가지 모델 그룹이 동시에 설정되었습니다. 약물 치료 그룹의 쥐는 난소 절제술을 받았습니다. 약물 처리군의 쥐에게 D-갈락토오스 복강내 주사와 AlCl3 위내 투여를 진행하면서 쥐에게 에키나코사이드(9{8}} mg/kg/d), 악테오사이드(9{10}} mg)를 경구 투여하였다. /kg/d), 양성대조군인 estradiol valerate(0.6mg/kg/d), donepezil HCl(0.8mg/kg/d). 8주간의 약물 처리 후, 6일간의 MWM(Morris Water Maze) 테스트를 먼저 수행하였다. 그런 다음 쥐를 희생시켜 혈액, 자궁, 대퇴골, 경골 및 뇌 조직을 채취하였다. 혈청은 생화학 검사에 사용되었습니다. 자궁은 조직 형태 측정에 사용되었습니다. 오른쪽 대퇴골은 각각 Micro-CT와 histomorphometry에 사용되었습니다. 생체 역학 테스트에는 오른쪽 경골을 사용했습니다. 아이스박스에 채집한 해마는 생화학 검사에 사용되었습니다. 관류에 의해 수집된 뇌는 조직 형태 측정에 사용되었습니다.

결과:Sham 그룹과 비교하여 OVX + D 그룹은 산화 손상을 유발하고 해마의 뉴런을 손상시키며 아세틸콜린의 가수분해 및 합성에 영향을 주어 학습 및 기억 능력을 현저히 감소시킬 수 있습니다. 한편, OVX + D 그룹에서 BALP 및 TRAP의 활성은 Sham 그룹에 비해 유의하게 증가했습니다(P < {{0}}.001).="" 또한,="" sham="" 그룹과="" 비교하여="" 평균="" 골밀도가="" 현저히="" 감소하였고(p="">< 0.05),="" ovx="" +="" d="" 그룹에서="" 소주골="" 질량="" 및="" 미세구조도="" 유의하게="" 파괴되었다.="" 또한="" 최대하중과="" 최대응력은="" sham군에="" 비해="" 유의하게="" 감소하였고(p="">< 0.01)="" 에너지="" 흡수도="" 크게="" 감소하였다.="" 에키나코사이드와="" 악테오사이드를="" 투여한="" 후="" 골다공증의="" 전형적인="" 병리학적="">알츠하이머병개선되었습니다.

결론: 골다공증과 결합된 모델알츠하이머병쥐에서 실현 가능하고 성공적으로 확립되었습니다. Echinacoside와 acteoside도 이 동시 모델에 상당한 영향을 미쳤으며 잠재적인 후보가 될 수 있습니다.시스탄체 튜불로사추가 연구를 위해 이중 효과가 있습니다.

키워드: 골다공증,알츠하이머병, 이중 효과,에키나코사이드, 악테오사이드, 시스탄체 튜불로사

시스탄체 튜불로사~을 위한알츠하이머병

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1. 소개

골다공증은 골량의 점진적인 손실과 미세구조의 파괴를 특징으로 하는 퇴행성 뼈 질환으로, 취약성 골절의 위험을 증가시킬 수 있습니다(Rachner et al., 2011).알츠하이머병(AD)는 임상에서 지속적인 정신 쇠퇴, 인지 장애 및 독립적 생활 능력 상실을 특징으로 하는 노인에서 흔한 신경 퇴행성 질환입니다(Reitz et al., 2011). α-아밀로이드 침착에 의해 유도된 노인성 플라크의 형성, 타우 과인산화에 의한 신경섬유 엉킴, 뇌의 신경 변성은 알츠하이머병의 전형적인 병리학적 특징이다(Serrano-Pozo et al., 2011). 표면적으로 OP와 AD는 서로 다른 병리와 임상적 특징을 가진 완전히 독립적인 질병입니다. 그러나 OP와 AD는 임상 실습에서 종종 동시 발생하는 것으로 관찰됩니다(Zhang et al., 2001; Lui et al., 2003; Luckhaus et al., 2009). 두 질병의 유병률은 특히 폐경 후 여성에서 연령에 따라 증가했습니다(Li et al., 2017; Stern, 2012). 알츠하이머병 진단을 받은 사람들은 OP의 위험이 증가한다는 증거가 점점 더 많아지고 있습니다(Zhou et al., 2014).

골다공증과 골다공증의 관계를 연구하고 명확히 할 필요가 있다.알츠하이머병시험관 내 및 생체 내. 연구를 생체 내에서 수행하기 전에 적용 가능한 골다공증 또는 동물 모델을 선택하는 것이 중요합니다.알츠하이머병. 골다공증 모델은 레티노산의 위내 투여, 난소절제술, 글루코코르티코이드의 근육내 주사와 같은 여러 방법에 의해 확립될 수 있다(Wei et al., 2007; Komori, 2015). 특히, 쥐의 난소절제술에 의해 유도된 폐경후 골다공증 모델은 고전적이며 대부분의 연구에서 널리 사용되어 왔다(Miao et al., 2012; Liu et al., 2017). 산발성 알츠하이머병은 알츠하이머병의 주요 유형입니다. Sporadic의 동물 모델알츠하이머병은D-갈락토스 또는 -아밀로이드 주입, AlCl3의 위내 투여 등 다양한 방법에 의해 유도된다(Bagheri et al., 2011; Gao et al., 2015; Justin Themozhi et al., 2017). 또한, 의 접속 모델알츠하이머병난소절제술과 결합된 D-갈락토스의 장기간 복강내 주사에 의해 유도되는 것도 많이 연구되었습니다(Liu et al., 2010; Zhao et al., 2012). 골다공증과의 관련성을 밝히기 위해알츠하이머병, 골다공증과 결합된 모델의 확립이 필요하다.알츠하이머병골다공증에 대한 약물의 일반적인 메커니즘을 연구하고알츠하이머병.

시스탄체 튜불로사(쉥크) 와이트는 기생식물로 중국 북서부 사막에 주로 분포한다. 말린 즙이 많은 줄기는시스탄체 튜불로사(CT)는 중국 약전(2015)에서 Roucongrong의 중국 이름으로 Cistanches Herba라는 유명한 강장제로 사용됩니다. '사막의 인삼'으로 불리며 한방에서 허리와 무릎 통증, 여성 불임, 변비 치료에 널리 사용됩니다(Jiang and Tu, 2009). CT의 주요 활성 성분(Cistanche tubulosa)PhGs의 대표적인 화합물은 페닐에타노이드 배당체(PhGs), 에키나코사이드(ECH) 및 악테오사이드(ACT)입니다(Morikawaet al., 2014). 특히, ECH와 ACT는 일반적으로 CT에서 품질 관리를 위한 마커로 선택됩니다.(Cistanche tubulosa)신경 보호, 뼈 보호, 항산화, 노화 방지, 학습 및 기억 능력 향상과 같은 높은 함량과 다양한 약리 활성 때문입니다(Wang et al., 2012; Li et al., 2016). 그러나 ECH와 ACT가 골다공증에 미치는 영향알츠하이머병아직 쥐 모델에서 함께 연구되지 않았습니다. 따라서 이 연구의 목적은 다음과 같은 골다공증의 쥐 모델을 확립하는 것이었습니다.알츠하이머병다음 연구에서 에키나코사이드 또는 액테오사이드의 분자 메커니즘에 대한 추가 연구를 위한 실험적 증거를 제공하기 위해 이 동시 모델에 대한 에키나코사이드 및 액테오사이드의 효과를 탐구합니다.

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2 재료 및 방법

2.1. 동물

체중이 180~200g인 80{0}주령 암컷 Wistar 쥐(인증 번호: SCXK, 2018–0006)를 Sino-BritishSIPPR/BK Lab에서 구입했습니다. Animal Ltd(중국 상하이)와 중국약학대학 약학동물실험센터에서 키웠습니다.

2.2. 화학물질 및 시약

클로랄 수화물, 페니실린 G 나트륨, D-갈락토스, 염화알루미늄 6수화물, 에스트라디올 발레레이트, 도네페질 HCl은 Aladdin Industrial Corporation(중국 상하이)에서 구입했습니다. Echinacoside(HPLC94%)는 Wuhan Yuanchengcreate Technology Co., Ltd.(Wuhan, China)에서 구입했습니다. Acteoside(HPLC 98%)는 Baoji HerbestBio-Tech Co., Ltd.(Baoji, China)에서 구입했습니다. Bone-specificalkaline phosphatase(BALP), tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP), superoxide dismutase(SOD), malonaldehyde(MDA), acetylcholinesterase(AChE), cholineacetyltransferase(ChAT) ELISA 키트 구입 Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd.(중국 상하이). Universal 조직 고정액은 WuhanServicebio Technology Co., Ltd.(중국 우한)에서 구입했습니다.

2.3. 동물 모델 및 치료

모든 동물 실험은 중국약학대학 동물윤리위원회의 승인과 감독을 받았습니다. 쥐에게 온도 조절실(22±2도)에서 12시간 명암 주기로 유지하고 표준 펠릿 마초와 수돗물을 먹였습니다.

적응 일주일 후 난소절제술을 시행하여 골다공증 모델을 달성하였다(French et al., 2008). 수술이 끝난 후 감염을 예방하기 위해 상처 봉합부에 페니실린 G 나트륨을 1회 뿌렸다. 그런 다음 쥐에게 3주 동안 정상적으로 먹이를 주었습니다. 참고 문헌(Hua et al., 2007; Alawdi et al., 2017)에 따르면,알츠하이머병난소절제술과 결합된 D-갈락토스의 장기 복강내 주사 또는 AlCl3의 장기 위내 투여에 의해 유도될 수 있다. 결합된 골다공증 모델의 타당성을 연구하기 위해알츠하이머병, 난소 절제술의 세 가지 모델 그룹(OVX 그룹), 150 mg/kg/d D-갈락토스의 복강내 주사 및 30 mg/kg/d AlCl3의 위내 투여를 사용한 가짜 수술(D 그룹), 150 mg/kg의 복강내 주사를 사용한 난소 절제술 /d D-갈락토스 및 30 mg/kg/d AlCl3(OVX + D 그룹)의 위내 투여가 이 연구에서 설정되었습니다.

따라서 쥐를 3주 후에 무작위로 8개 그룹(각 그룹에 대해 n {{0}})으로 나누고 8주 동안 약물을 경구 투여했습니다. 가짜 그룹; OVX 그룹; D 그룹; OVX 플러스 D 그룹; 에스트라디올발레레이트 치료 그룹(EV 그룹, OVX + D + 0.6 mg/kg/d 에스트라디올발레레이트); 도네페질 HCl 처리 그룹(DPZ 그룹, OVX + D + 0.8 mg/kg/d 도네페질 HCl); 에키나코사이드 치료군(ECHgroup, OVX + D + 90 mg/kg/d 에키나코사이드); 악테오사이드 치료군(ACT 그룹, OVX + D + 90 mg/kg/d 악테오사이드). Human-Rat Equivalent Dose Conversion Principle과 관련 참고 문헌의 용량(Li et al., 2013; Gao et al., 2014)에 따라 본 연구에서 약물 치료군의 용량을 채택하였다.

매주 각 쥐의 체중을 측정하였다. 8주간의 약물치료를 모두 마친 후 6일간의 Morris Water Maze(MWM) 검사를 먼저 시행하였다. 그 후, 각 그룹에서 6마리의 쥐를 희생시켜 재료를 수확하였다. 쥐에게 3.{4}}mL/kg 10% 염소수화물을 복강내 주사하여 마취하고 복부 대동맥에서 혈액을 채취했습니다. 혈액을 실온에 놓아 응고시키고 10분 동안 3500 r/min으로 원심분리하였다. 혈청을 1.5mL 원심분리 튜브(NEST Biotechnology)에서 수확하고 생화학적 테스트에 사용할 때까지 -80도에서 보관했습니다. 그런 다음 자궁, 대퇴골, 경골 및 뇌 조직을 수집했습니다. 자궁은 조직 형태 측정에 사용되었습니다. Micro-CT와 histomorphometry에 각각 우측 대퇴골을 사용하였다. 생체역학적 테스트를 위해 오른쪽 경골을 사용했습니다. 아이스박스에 채집한 해마는 생화학 검사에 사용되었습니다. 그 후, 각 그룹의 다른 3마리의 쥐에게 식염수와 보편적인 조직 고정제로 심장에서 관류하여 조직 형태 측정을 위해 뇌를 채취했습니다.

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2.4. Morris Water Maze(MWM) 테스트

쥐는 개입 8주 후 MWM 테스트에서 공간 참조 학습과 기억력 테스트를 받았습니다. MWM 테스트는 이전에 보고된 방법에 따라 수행되었습니다(Morris, 1984; Gao et al., 2016). 간단히 말해서, 연속 5일 동안 하루에 4번의 실험을 통해 쥐는 수영장 벽에 있는 다양한 시각적 신호를 사용하여 원형 수영장(직경 130cm, 높이 50cm)에서 숨겨진 잠긴 플랫폼(직경 11cm, 높이 29cm)을 찾도록 훈련되었습니다. ) 무독성 카본 잉크로 착색된 물로 채워져 있습니다. 수영장은 상상으로 4개의 사분면으로 나뉘었고, 4개의 시작 위치는 사분면의 교차점에 위치했습니다. 플랫폼은 사분면 중 하나의 중앙에 위치했으며 시험 중에 위치가 일정했습니다. 각 시도에서 쥐는 수영장의 벽을 향하도록 선택된 위치에 무작위로 배치되었습니다. 각 시도는 쥐가 플랫폼에 도달하거나 60초 후에 종료되었고 경과 시간은 탈진율로 기록되었습니다. 플랫폼에 도달하지 못한 쥐는 플랫폼으로 안내되었습니다. 각각의 숨겨진 플랫폼 실험 후, 쥐는 10초 동안 플랫폼에 남아 있었습니다. 1일 4회 시도의 평균 대기 시간을 훈련 결과로 계산했습니다. 6일째에 모든 쥐는 플랫폼이 없는 수영장에서 60초 동안 수영하는 프로브 시험을 받았습니다. 플랫폼 위치에서의 교차 시간과 목표 사분면에서의 이동 시간이 최종 결과로 기록되었습니다. 쥐는 수영장 바로 위의 천장에 장착된 카메라로 모니터링되었으며 모든 실험은 Beijing zhongshidichuang science and technology development Co., Ltd.(Beijing, China)에서 제공하는 MORRIS MAZE 프로그램을 사용하여 기록 및 분석되었습니다.

2.5. ELISA에 의한 생화학적 검사

제조사의 ELISA 키트 설명서에 따라 BioTekSynergy 2 multi-sine으로 BALP(bone-specificalkaline phosphatase) 활성, TRAP(tartrate-resistant acidphosphatase) 활성, SOD(superoxide dismutase) 활성 및 MDA(malondialdehyde) 함량을 테스트했습니다. 모드 마이크로플레이트 리더(BioTek, USA). 각 군의 해마 조직을 PBS(0.01 M, pH 7.4)로 세척하여 조직 표면에 남아 있는 혈액이나 불순물을 제거하였다. 한쪽 해마 조직의 무게를 잰 후 작게 자른다. 가능한 한. 해마 조직을 1:9(조직 중량: PBS 부피)의 비율로 균질화하였다. 균질물을 4도, 3000 r/min에서 15분 동안 원심분리하였다. 상등액을 채취하여 희석하여 BCA법으로 단백질 농도를 측정하였다. 그런 다음 해마 조직에서 아세틸콜린에스테라제(AChE) 활성, 콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT) 활성, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 활성 및 말론디알데히드(MDA) 함량을 ELISA 방법으로 테스트했습니다.

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2.6. 해마 조직 형태 측정법

뇌 조직(n=3/그룹)을 범용 조직 고정액으로 고정했습니다. 그런 다음 뇌 조직 샘플을 세척하고 구배 에탄올로 탈수하고 파라핀 왁스를 묻힌 다음 5 μm의 관상 섹션으로 슬라이스했습니다. 섹션을 헤마톡실린 및 에오신(HE)으로 염색했습니다. 이후 도립형광현미경(Nikon, Japan)을 이용하여 뇌조직의 관상면을 촬영하였다. 특히 해마에서 CA1, CA2, CA3, DG의 형태학적 변화가 관찰되었다.

2.7. 자궁 조직 형태 측정 및 형태 측정

선택한 자궁(n {0}}/그룹)을 범용 조직고정액으로 고정했습니다. 그런 다음 자궁 조직 샘플을 세척하고 구배 에탄올로 탈수하고 파라핀 왁스를 묻힌 다음 5 μm의 횡단면으로 슬라이스했습니다. 섹션은 hematoxylin andeosin(HE)으로 염색되었습니다. 자궁의 횡단면을 관찰하고 사진을 찍었습니다. 5개의 시야를 무작위로 선택하고, Image-Pro Plus 6.0 소프트웨어를 사용하여 자궁 횡단면의 직경과 자궁 점막 상피 두께를 측정했습니다. 고유판(lamina propria)에 있는 자궁선의 수도 세었습니다.

2.8. 마이크로 CT(Cistanche tubulosa)

선택된 우측 대퇴골(n=3/그룹)은 SkyScan 1176 micro X-ray를 사용하여 물체와 소스 사이의 거리가 121mm이고 카메라와 소스 사이의 거리가 171mm인 위치에서 스캔되었습니다. 컴퓨터 단층 촬영(Micro-CT) 스캐너(Bruker, 독일). distalgrowth plate는 기준 표면으로 선택되었습니다. 기준 표면 아래 1mm의 거리에서 1.8mm 두께 영역이 관심 볼륨(VOI, 100개 레이어)으로 선택되었습니다. 결과 회색조 이미지는 뼈 재구성(65kV, 385μA)에서 17.76μm의 픽셀 크기를 가졌습니다. 피질골에서 소주를 선택하기 위해 반자동 윤곽 형성 방법이 사용되었습니다. 직접 3D 측정 방법을 사용하여 골 용적(BV/TV), 골표면 밀도(BS/TV), 소주 분리(Tb. Sp), 소주 수(Tb. N), 소주 두께(Tb. Th), 구조 모델의 백분율을 평가했습니다. CT를 사용하여 동일한 VOI에 대한 index(SMI), trabecular pattern factor(Tb.Pdf) 및 평균 골밀도(mean BMD)(Cistanche tubulosa)분석 프로그램(Bruker, 독일). 적응형 렌더링 알고리즘을 사용한 VOI의 3D 시각화는 CTvol 소프트웨어(Bruker, Germany)로 수행되었습니다.

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2.9. 뼈 조직 형태 측정

선택한 오른쪽 대퇴골(n=3/그룹)을 만능 조직 고정액으로 고정한 다음 10% EDTA-2Na 용액에서 3주 동안 석회를 제거했습니다. 석회화된 샘플을 세척하고, gradientethanol로 탈수하고, 파라핀 왁스를 묻힌 다음, 5μm의 세로 단면으로 슬라이싱했습니다. 절편을 hematoxylin과 eosin(HE)으로 염색하였다. 대퇴골의 세로 단면을 촬영했습니다. 각 그룹의 뼈 조직 구조, 특히 소주 뼈 구조가 관찰되었습니다.

2.10. 생체역학 시험

무작위로 선택된 오른쪽 경골(n=4/그룹)은 만능 시험기(SHIMADZU, Japan)를 사용하여 3점 굽힘 시험을 위해 평가되었습니다. 이 샘플의 직경은 2.16-2.38mm(d) 범위에서 버니어캘리퍼스로 측정되었습니다. 그런 다음 시료를 두 레일 사이의 거리가 25mm(L)인 두 개의 지지 크로스바에 놓고 시료의 생리학적 곡률이 위쪽을 향하도록 했습니다. 하중의 로드 로드는 시료의 중앙에 위치하고 일정한 속도로 떨어뜨렸습니다. 시편이 파손될 때까지 1.5 mm/min. 힘(F)과 변위 데이터는 시험기와 인터페이스된 컴퓨터에 자동으로 기록되었고 하중-변형 곡선이 동시에 그려졌습니다. 최대 하중(N) 및 에너지 흡수(mJ) 값은 동시에 재료 테스트 소프트웨어 TRAPEZIUM X에 의해 기록되었습니다. 최대 응력(MPa) 값은 다음 공식에 따라 계산되었습니다. 응력(σ)=굽힘 모멘트(M)/단면 계수(Z) =(8 × L × F)/(π × d3).

2.11. 통계 분석

모델 그룹의 결과는 Sham 그룹과 비교되었고, 약물 처리 그룹의 결과는 OVX + D 그룹과 비교되었습니다. 데이터는 일원 ANOVA를 사용한 후 Graph Pad Prism 5.0 소프트웨어를 사용한 Bonferroni의 다중 비교 테스트를 사용하여 분석되었습니다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현하였고, P값이0.05 미만이면 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

3. 결과

3.1. 체중

8주간의 전체 치료 기간 동안 각 그룹의 쥐의 주간 체중은 그림 1에 나와 있습니다. Sham 그룹과 비교하여 OVX + D 그룹의 쥐의 체중은 증가했으며, 특히 처음 4개 그룹에서 유의한 차이가 있었습니다. 주(P < 0.05).="" ev와="" ech를="" 처리한="" 후="" 쥐의="" 체중은="" ovx="" +="" d군에="" 비해="" 분명히="" 감소했습니다(p="">< 0.05,="" p=""><>

3.2. 인지 능력 평가

3.2.1. 습득 단계의 학습 능력 평가

5일째 획득 단계에서 각 그룹의 쥐들의 대표적인 수영 궤적을 Fig. 2에 나타내었다. 획득 단계 5일 동안 각 그룹의 탈출 잠복기를 표 1에 나타내었다. OVX + D 그룹과 DPZ 그룹 간의 지연 시간, ACT 그룹은 각각 유의한 차이를 보였다(P < 0.05).="" 둘째="" 날부터="" sham="" 그룹의="" 탈출="" 대기="" 시간이="" 크게="" 단축되었으며="" 평균="" 대기="" 시간은="" ovx="" +="" d="" 그룹보다="" 훨씬="" 낮습니다.="" dpz="" 그룹에서는="" 3일째에="" ovx="" +="" d="" 그룹에="" 비해="" 지연="" 시간이="" 크게="" 감소했습니다(p="">< 0.{11}}5).="" sham="" 그룹과="" 비교하여="" d="" 및="" ovx의="" 지연="" 시간="" 4일째에="" d="" 그룹이="" 분명히="" 늘어났습니다(p="">< 0.01,="" p="">< 0.001).="" 또한,="" ovx="" +="" d="" 그룹과="" 비교하여="" ev,="" dpz="" 및="" ech의="" 대기="" 시간,="" act="" 그룹은="" 유의하게="" 단축되었습니다(p="">< 0.05,="" p="">< 0.01,="" p="">< 0.001).="" 5일차에도="" ovx+d="" 그룹의="" 대기="" 시간은="" sham="" 그룹보다="" 여전히="" 유의하게="" 높았고(p="">< 0.05),="" ev="" 및="" ech="" 그룹의="" 대기="" 시간은="" ovx+d="" 그룹에="" 비해="" 현저히="" 단축(p=""><>

3.2.2. 프로브 시험에서 기억 능력 평가

프로브 실험에서 각 그룹의 쥐들의 대표적인 수영 궤적을 Fig. 3에 나타내었다. Fig. 4와 같이 Sham 그룹과 비교하여 OVX, D, OVX의 목표 사분면에서 횡단 시간과 수영 시간을 비교하였다. 플러스 D 그룹은 크게 감소했습니다(P < 0.05,p="">< 0.01).="" ovx+d="" 그룹과="" 비교하여="" ev,="" dpz="" 및="" ech,="" act="" 그룹의="" 교차="" 시간은="" 분명히="" 증가했습니다(p="">< {{1{12}}}}.05,="" p="">< 0.01)="" 및="" 대상="" 사분면에="" 있는="" 시간="" ev="" 및="" dpz="" 그룹의="" 비율도="" 크게="" 증가했습니다(p="">< 0.05,="" p=""><>

3.3. 혈청의 생화학적 분석

그림 5A 및 B에서 볼 수 있듯이 Sham 그룹과 비교하여 OVX 및 OVX + D 그룹에서 BALP 및 TRAP의 활성이 유의하게 증가했습니다(P < 0.001="" ),="" 이는="" 난소절제술에="" 의한="" 고회전성="" 골다공증의="" 전형적인="" 특징이었다.="" ev,="" dpz,="" ech="" 및="" act="" 그룹에서="" balp="" 및="" trap의="" 활성은="" ovx="" +="" d="" 그룹과="" 비교하여="" 분명히="" 감소했습니다(p="">< 0.05,="" p="">< 0.01,="" p=""><>

난소절제술, D-갈락토스의 복강내 주사, AlCl3의 위내 투여는 산화적 손상을 일으킬 수 있습니다(Muthusami et al., 2{{1{12}}}}05; A. Prakash et al., 2 013). 그림 5C와 같이 난소절제술에서 D-갈락토스의 복강내 주사와 AlCl3의 위내 투여는 산화적 손상을 일으킬 수 있다(Muthusami et al., 20{{2{22}}}}5; A. Prakash et al., 2013). 도 5C 및 D에 나타난 바와 같이, OVX, D, OVX + D 그룹의 SOD 활성은 Sham 그룹보다 유의하게 낮았고(P < 0.05,="" p="">< 0.001),="" ovx,="" d="" 및="" ovx의="" mda="" 함량은="" ovx="" +="" d="" 그룹은="" sham="" 그룹과="" 비교하여="" 유의하게="" 증가했습니다(p="">< 0.05,="" p="">< 0.001).="" ovx+d군에="" 비해="" ev,="" dpz,="" ech,="" act="" 처리="" 후="" sod="" 활성이="" 유의하게="" 증가하였고(p="">< 0.01,="" p="">< 0.001),="" 특히="" ev군에서="" mda="" 함량이="" 어느="" 정도="" 감소하였다.="" (p=""><>

3.4. 해마의 생화학적 분석

그림 6A에서 볼 수 있듯이 OVX + D 그룹의 AChE 활성이 Sham 그룹보다 분명히 높았으며(P < 0.05),="" 이는="" ovx="" +="" d="" 그룹의="" 학습="" 및="" 기억="" 능력을="" 나타냅니다.="" ovx="" +="" d="" 그룹은="" 뇌에서="" 아세틸콜린의="" 가수분해를="" 촉진하여="" 감소할="" 수="" 있습니다.="" ovx="" +="" d="" 그룹과="" 비교하여="" 약물="" 치료="" 그룹,="" 특히="" ev="" 그룹에서="" ache="" 활성이="" 어느="" 정도="" 감소했습니다(p="">< 0.01).="" 그림="" 6b에서="" 보는="" 바와="" 같이="" sham="" 그룹과="" 비교하여="" ovx,="" d,="" ovx="" plus="" d="" 그룹의="" chat="" 활동은="" 분명히="" 감소했습니다(p="">< {{1{12}}}}.01,="" p="">< 0.001)="" 뇌에서="" 아세틸콜린="" 합성이="" 느려="" 학습="" 및="" 기억="" 능력에="" 영향을="" 미칠="" 수="" 있음을="" 나타냅니다.="" ovx="" +="" d="" 그룹과="" 비교하여="" ev,="" dpz="" 및="" ech,="" act="" 그룹의="" chat="" 활성이="" 유의하게="" 증가했습니다(p="">< 0.05,="" p="">< 0.01,="" p=""><>

산화 손상은 해마에서도 발생할 수 있습니다(Dileket al., 2010; Yang et al., 2013). 도 6C 및 D에서 보는 바와 같이 Sham 그룹과 비교하여 OVX, D 및 OVX + D 그룹의 SOD 활성은 유의하게 감소하였다(P < 0.01,="" p="">< 0.="" 001),="" mda="" 함량은="" 분명히="" 증가했습니다(p="">< 0.01,="" p="">< 0.001).="" ev,="" dpz,="" ech="" 및="" act="" 처리="" 후,="" ovx="" +="" d="" 그룹에="" 비해="" sod="" 활성이="" 유의하게="" 증가하였고(p="">< 0.001)="" mda="" 함량이="" 유의하게="" 감소하였다(p=""><>

3.5. 해마 조직 형태 분석

도 7a에 도시된 바와 같이, Sham 그룹의 해마 뉴런은 균일하게 염색되었다. 한편, 뉴런의 형태학적 특징은 명백한 핵소체로 명확하였다. 그것들의 배열도 다수의 온전한 구조로 깔끔하고 조밀하다. OVX, D 및 OVX + D 그룹에서는 Sham 그룹과 비교하여 해마의 뉴런 수가 크게 감소했습니다. 뉴런이 무질서하게 배열되었고 공극이 확대되었습니다. 특히 D군과 OVX군과 D군에서는 해마에서 더 적은 수의 뉴런이 발견되었고 그 분포가 흩어져 있었다. D군과 OVX+D군에서도 신경원과 괴사성 신경세포의 핵융해와 형태학적 특징이 뚜렷하지 않았다. 도 7B에 나타난 바와 같이, 약물 중재 후 해마의 뉴런 수는 EV, DPZ, ECH 및 ACT 그룹이 OVX + D 그룹보다 유의하게 많았다. 동시에 신경원 사이의 정렬은 비교적 질서정연하였고 핵비축과 괴사가 있는 신경원의 수도 감소하였다.

3.6. 자궁 습윤 중량 및 자궁 조직 형태 및 형태 측정 분석

그림 8에서 보는 바와 같이 OVX와 OVX+Dgroup의 자궁 습윤 중량은 Sham 그룹보다 유의하게 낮았다(P < 0.05,p="">< 0.="" 01).="" ovx="" +="" d="" 그룹과="" 비교하여,="" ev="" 그룹의="" 자궁="" 습윤="" 중량은="" estradiolvalerate의="" 효과="" 하에서="" 분명히="" 증가했습니다(p="">< 0.01).="" 또한="" dpz="" 그룹과="" ech="" 그룹의="" 자궁="" 습윤="" 중량도="" 어느="" 정도="">

도 9a에 도시된 바와 같이, Sham 그룹의 자궁은 벽이 두꺼운 근육 기관이고 자궁 점막 상피는 단층기둥 상피였다. 고유판은 자궁선과 혈관에 분포되어 있습니다. 근육층은 평활근의 다발 조각으로 구성되어 있으며 근섬유가 촘촘하게 배열되어 있습니다. OVX 및 OVX + D 그룹에서 자궁은 내강 협착과 함께 유의하게 축소되었습니다. 자궁내막과 근육층은 Sham 그룹보다 현저히 얇았습니다. 또한 자궁선의 수가 감소하고 근육 섬유가 가늘어졌습니다. 도 9b에 도시된 바와 같이, OVX + D군과 비교하여, 자궁 조직 형태는 EV, DPZ, ECH 및 ACT로 치료한 후 어느 정도 개선되었다. 특히 EV군에서는 자궁이 상당히 꽉 차 있었고 자궁내막과 근육층이 두꺼워진 것이 눈에 띄었다. 또한, 자궁선의 수가 증가하고 근육 섬유가 넓어졌습니다.

각 그룹의 자궁에 대한 형태학적 분석 결과는 그림 10A–C에 나와 있습니다. Sham군에 비해 OVX군과 OVX군과 D군에서 자궁경, 자궁점막상피두께, 자궁샘의 수는 유의하게 감소하였다(P < 0.01,="" p="">< 0.001).="" ev="" 치료="" 후="" ovx="" +="" d군에="" 비해="" 자궁경,="" 자궁점막상피두께,="" 자궁샘의="" 수가="" 현저히="" 증가하였다(p="">< 0.001).="" 또한="" ech와="" act에서도="" 자궁경,="" 자궁점막상피두께,="" 자궁선의="" 수가="" 증가하는="" 경향을="">

3.7. 마이크로 CT 분석

원위 대퇴골 절개의 2차원 이미지는 그림 11A에 표시된 Bruker DataViewer 소프트웨어에 의해 획득되었습니다. CTvol 소프트웨어로 수행한 후, 각 그룹의 원위 대퇴 해면골의 VOI 영역에 있는 소주골의 3차원 이미지를 도 11B에 나타내었다. 또한 평균 BMD, BV/TV, SMI, Tb. N, Tb. Sp, Tb.Th, BS/TV 및 Tb. CTAn 소프트웨어로 분석한 Pf도 표 2 및 표 3에 나와 있습니다.

위의 그림과 같이 Sham군에 비해 OVX+D군에서 소주수와 소주면적이 현저히 감소하였다. 한편, 다양한 섬유주 매개변수의 정량화에서도 평균 BMD, BV/TV, Tb가 나타났습니다. N, Tb.Th, BS/TV는 OVX + D 그룹에서 유의하게 감소했습니다(P < {{0}}.05,="" p="">< 0.01).="" smi,="" tb.="" sp,="" tb.="" ovx="" +="" d="" 그룹의="" pf는="" 분명히="" 증가했습니다(p="">< 0.01).="" ovx="" +="" d군과="" 비교하여="" 소주="" 미세구조는="" ev="" 및="" ech="" 치료="" 후="" 어느="" 정도="">

3.8. 뼈 조직 형태 분석

각 그룹의 원위 대퇴골의 해면골의 소주 구조는 Fig. 12에 나타내었다. Sham 그룹은 두껍고 네트워크로 연결된 많은 소주를 가졌다. Shamgroup과 비교하여 OVX 및 OVX plus D 그룹의 소주는 현저히 감소하고 얇아졌습니다. 특히, OVX plus D 그룹의 소주는 크게 파괴되어 대부분이 네트워크에 연결되지 않았습니다. 또한 D 그룹의 소주도 분명히 얇아졌습니다. EV 및 ECH 처리 후 소주는 OVX + D 그룹과 비교하여 유의하게 증가하고 두꺼워지고 망상이 되었습니다. EV 그룹의 형태학적 특징은 Sham 그룹과 유사했다. 한편, DPZ 및 ACT 그룹의 소주 구조도 어느 정도 개선되었습니다.

3.9. 생체역학 분석

3점 굽힘 시험 결과는 Table 4와 같다. Sham군과 비교했을 때 OVX에서 최대하중과 최대응력이 현저히 감소하였다(P < 0.05,="" p="">< 0.01).="" 및="" ovx="" +="" dgroups="" 및="" 에너지="" 흡수도="" 크게="" 감소했습니다.="" ev와="" ech="" 치료="" 후="" 최대하중,="" 최대응력,="" 에너지흡수율은="" ovx+d군에="" 비해="" 어느="" 정도="">

4. 토론

골다공증에 대한 역학조사에 따르면 여성 환자의 수가 남성보다 많고 고령자 및 폐경기 여성에게서 자주 발생하는 것으로 나타났다(Chen et al., 2016). 골다공증은 노인의 건강에 심각한 영향을 미치며 심각한 질병 중 하나로 전 세계의 사회 문제(Deal, 2009; Roy et al., 2011; Bessette et al., 2011). 의 역학조사알츠하이머병의 발생률과 유병률을 보여주었다.알츠하이머병특히 65세 이상의 고령자에서 발생하며, 연령이 증가함에 따라 기하급수적으로 증가했습니다(Sosa Ortiz et al., 2012). 더욱이, AD의 유병률은 남성에 비해 여성에서 유의하게 더 높았다(Mielke et al., 2014). 최근 추정치는 알츠하이머병 진단을 받은 개인의 거의 3분의 2가알츠하이머병여성이었다(Hebert et al., 2013). 현저하게, 알츠하이머병의 세계적 만연은 사회에 상당한 부담을 주었다(Reitzand Mayeux, 2014).

폐경 후 골다공증을 유발하는 주요 원인이 에스트로겐 결핍이라는 연구 결과가 보고되었습니다(Klein-Nulendet al., 2015). 골 회전율을 크게 가속화하고 골 흡수율이 골 형성 속도를 초과하여 골량 손실, 골밀도 감소 및 골 강도 감소를 초래할 수 있습니다(Tella and Gallagher, 2014). 또한, 폐경 후 여성은 인지 장애 또는 치매의 위험이 증가하는 것으로 나타났습니다(Rocca et al., 2007). 일부 연구에 따르면 에스트로겐은 노화 동안 해마 기능 유지(Han et al., 2013), 해마에서 콜린 아세틸트랜스퍼라제 활성 증가(Gibbs and Aggarwal, 1998), 아밀로이드-베타 응집 감소 등 알츠하이머병 치료에 중요한 역할을 한다는 것이 입증되었습니다. (Nilsen et al., 2006).

골다공증 연구에 적용 가능한 쥐 모델을 선택하는 것이 중요했습니다.알츠하이머병. 난소절제술에 의한 골다공증 모델은 골다공증 연구에서 널리 채택되어 왔다(Zhao et al., 2011; Liu et al., 2018). 알츠하이머병의 발병기전은 다양하지만 연구에 따르면 산화 스트레스와 알루미늄 노출이 알츠하이머병의 중요한 원인인 것으로 나타났습니다(Xiao et al., 2011; Bhattacharjee et al., 2014). D-갈락토스는 일종의 환원당 생체내입니다. 체내 정상치보다 훨씬 높을 경우 갈락토오스 산화효소에 의해 더 이상 대사되지 않는 알데히드로 산화되어 뇌에 크게 축적되어 결과적으로 신경세포의 산화 스트레스와 세포사멸을 유발할 수 있다(Cui et al., 2006). 알루미늄은 혈액-뇌 장벽을 쉽게 통과할 수 있으며 뇌에 명백한 신경 독성이 있습니다(D. Prakash et al., 2013). 그것은 세포 외 신경 세포 침착을 유발하고 활성 산소 종(ROS)의 생성을 유도하여 산화 스트레스 및 신경 손상을 유발할 수 있습니다(Walton, 2013). 많은 연구에 따르면 D-갈락토스를 AlCl3 동물, 특히 설치류와 함께 치료하면 학습 및 기억 능력이 크게 손상될 수 있습니다(Chiroma et al., 2018). 대뇌 피질과 해마에서 A 1-42의 발현과 축적을 유도할 수 있습니다(Yang et al., 2014). 또한 연구에 따르면 난소 절제술과 D 갈락토스의 장기 복강 내 주사가 알츠하이머병과 관련된 시냅스 손실, 성상 세포 손상, 세포 내 A 축적 및 신경섬유 엉킴과 같은 병태생리학적 변화를 초래할 수 있으며, 이는 이중으로 작용할 수 있습니다. AD에 대한 부상 모델(Su et al., 2010).

본 연구에서는 OVX군, D군, OVX+D군의 3개 모델군을 각각 설정하여 D-갈락토스 복강내 주사와 AlCl3 위내 투여를 병행한 난소절제술이 골다공증의 병리학적 특징을 더 잘 나타낼 수 있음을 확인하였다. 그리고알츠하이머병동시에.

여러 가지 방법이 결합된 골다공증 모델을 평가하는 데 사용되었습니다.알츠하이머병. 학습과 기억은 뇌의 높은 수준의 활동 중 일부입니다.알츠하이머병다양한 정도의 인지 장애를 유발할 수 있습니다(Albert et al., 2011). 설치류의 학습 및 기억력 검사는 신경과학 분야에서 인지행동과 기전을 연구하는 일반적인 방법이다(Kwon et al., 2011). 우리 연구에서는 쥐의 학습 및 기억 능력을 평가하기 위해 Morris Water Maze(MWM) 테스트를 사용했으며, 이는 설치류의 신경생물학 및 신경약리학 연구에서 널리 사용되어 왔습니다(Gacar et al., 2011). MWM 테스트 결과, OVX + D 그룹의 탈진율이 유의하게 증가하고 OVX + D 그룹의 표적 사분면에서 교차 시간 및 수영 시간이 Sham 그룹에 비해 현저히 감소한 것으로 나타났습니다. 이는 쥐의 인지 능력이 OVX 플러스 D 그룹에서는 심각한 손상을 입었습니다. 학습과 기억에 중요한 뇌 영역인 해마는 AD의 초기 단계에서 특히 손상되기 쉽습니다. (Mu and Gage, 2011). 해마의 생화학적 분석에 따르면 AChE 활성은 분명히 더 높았고 ChAT 활성은 Sham 그룹보다 OVX + D 그룹에서 훨씬 낮았습니다. OVX + D 그룹은 뇌의 아세틸콜린 감소로 인해 손상될 수 있습니다. 또한, 산화적 손상은 OVX + D 그룹에서 SOD 활성의 감소와 MDA 함량의 증가로 인해 해마의 정상적인 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. 해마의 조직형태 분석 결과, OVX+D 군은 sham 군에 비해 신경세포 수가 현저히 감소하고 신경세포가 무질서하게 배열되어 있어 해마의 신경세포 손상이 심한 것으로 나타났다.

본 연구에서 골다공증의 형성은 혈청 생화학, Micro-CT, 골 조직 형태학 및 생체 역학적 검사에 의해 평가되었습니다. 혈청 내 BALP 및 TRAP의 활성은 골 형성 및 골 흡수의 대표적인 지표입니다(Rufus et al., 2013). Sham 그룹과 비교하여 OVX 및 OVX + Dgroups에서 BALP 및 TRAP의 활성이 유의하게 증가했는데, 이는 난소 절제술로 인한 고회전성 골다공증의 전형적인 특징이었다. 한편, OVX+D 그룹의 쥐에서도 SOD 활성 감소와 MDA 함량 증가에 대한 산화 손상이 발생하여 골다공증 진행을 더욱 가속화시켰다. Micro-CT는 고해상도의 조직학적 검출과 결합된 비침습적 영상의 특징을 가진 일종의 기술로 뼈 영상 및 뼈 매개변수 연구에 특히 적합합니다(Ito, 2011). Micro-CT 분석 결과, Sham 군에 비해 OVX + D 군에서 골밀도의 감소, 골질량의 큰 손실, 소주의 미세구조 파괴가 나타났다. 뼈 조직 형태학은 또한 OVX + D 그룹에서 섬유주가 유의하게 파괴되었음을 보여주었습니다. 골다공증은 골절 위험을 증가시킬 수 있으며 뼈 생체역학적 검사는 뼈 강도를 감지하는 데 사용할 수 있습니다(Mears et al., 2010). 경골의 3점 굽힘 테스트에서 OVX + D 그룹의 골강도가 Sham 그룹에 비해 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다. 또한, 자궁 조직 형태 및 형태 분석 결과, 에스트로겐 결핍에 대한 가짜 그룹과 비교하여 OVX + D 그룹에서 자궁이 현저히 수축하고 자궁 내막이 분명히 얇아졌으며 자궁 땀샘의 수가 감소한 것으로 나타났습니다.

시스탄체 튜불로사면역 조절, 항산화, 노화 방지, 신경 보호 및 조골 세포 성장 촉진의 효과가 있는 한의학에서 잘 알려진 강장제입니다(Li et al., 2016). 에키나코사이드(Echinacoside)와 악테오사이드(acteoside)는시스탄체 튜불로사, 그리고 그들의 다양한 약리학적 효과는 깊이 연구할 가치가 있습니다(Fu et al., 2018).

우리의 현재 실험에서 에키나코사이드 또는 악테오사이드가 골다공증 쥐 모델에 미치는 영향알츠하이머병은추가로 공부했습니다. 골다공증과 알츠하이머병, 특히 에키나코사이드에 뚜렷한 효과를 보였다. 결과는 에키나코사이드가 아세틸콜린 합성을 촉진하고 해마의 뉴런을 보호함으로써 학습과 기억력을 크게 증가시키고 인지 기능 장애를 개선할 수 있음을 나타냅니다. 한편, 에키나코사이드와 액테오사이드는 BALP 및 TRAP의 활성을 감소시켜 골 흡수를 유의하게 감소시킬 수 있습니다. 또한 골량의 손실을 방지하고 섬유주의 미세 구조를 개선하여 평균 골밀도 및 골강도를 증가시킵니다. 또한 echinacoside와 acteoside도 자궁 상태를 개선하는 경향을 보였다. 에키나코사이드와 악테오사이드는 에스트로겐 유사 효과가 있는 것으로 보고되었습니다(Wang et al., 2014). 우리의 이전 연구는 또한 새로운 종류의 식물성 에스트로겐으로서 echinacoside가 쥐의 난소 절제술 후 골다공증을 효과적으로 예방하고 골 흡수를 억제할 수 있음을 보여주었습니다(Li et al., 2013). 이러한 결과에 따르면 echinacoside 또는 acteoside는 에스트로겐 신호 전달 경로 또는 에스트로겐과 관련된 다른 경로에 의해 영향을 미칠 수 있습니다. 다음 연구에서는 에키나코사이드 또는 액테오사이드의 여러 용량을 설정하여 용량-효과 관계를 밝히고 관련 신호 전달 경로를 추가로 연구하여알츠하이머병.

시스탄체 튜불로사~을 위한알츠하이머병

5. 결론

쥐 모델과 결합된 골다공증알츠하이머병은우리 연구에서 실현 가능하고 성공적으로 확립되었습니다. 한편, 에키나코사이드 및 악티오사이드로부터시스탄체 튜불로사이 동시 모델에서 학습 및 기억 능력 향상, 뼈 대사 조절, 산화 손상 감소 및 뉴런 보호의 상당한 효과를 보여주었습니다. Echinacoside와 acteoside는 이중 효과를 가진 잠재적인 후보가 될 수 있으며 다음 연구에서 분자 기전에 대한 추가 연구를 위한 실험적 증거를 제공합니다.

저자의 기여

이천이 원고를 썼다. Yi Chen, Ying-Qi Li 및 Jia-Yi Fang이 실험을 수행했습니다. Yi Chen이 데이터를 분석했습니다. Fei Li와 PingLi가 연구를 설계하고 원고를 수정했습니다.

경쟁적 이해관계 선언

저자는 이 원고에 대해 경쟁적인 이해 관계가 없으며 결과에 영향을 미칠 수 있는 이 작업에 대한 상당한 재정적 지원이 없음을 선언합니다.

출처: Yi Chena, et al의 '쥐의 알츠하이머병과 결합된 골다공증의 동시 실험 모델 및 Cistanche tubulosa의 echinacoside와 acteoside의 이중 효과'

---Journal of Ethnopharmacology 257(2020) 112834