증숙 및 건조 공정 중 Cistanche Deserticola 활성 화합물의 변환 메커니즘을 밝히기 위한 광범위 표적 대사체학 분석

Cistanche deserticola는 전통적으로 한약으로 가장 귀중한 식물 중 하나이며 최근에는 제약 및 건강 식품 산업에서 사용되었습니다. 찌기와 건조는 Cistanche deserticola 가공에서 두 가지 중요한 단계입니다.

불행하게도 열 처리 중 Cistanche deserticola의 화학적 조성 변화에 대한 포괄적인 이해는 제한적입니다. 이 연구에서는 초고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(UHPLC-MS/MS) 기반 광범위 대상 대사체학 분석을 사용하여 찌고 건조하는 과정에서 Cistanche deserticola 활성 화합물의 변환 메커니즘을 조사했습니다. 총 776개의 대사 산물이 열 처리 동안 Cistanche deserticola에서 확인되었으며, 그 중 77개의 대사 산물이 차별적으로 조절되었습니다(p < 0.05). 여기서 39개는 상향 조절(UR)되었고 38개는 하향 조절(DR)되었습니다. 47개(17 UR, 30 DR) 및 30개(22 UR, 8 DR)의 차등 대사산물은 찌는 과정과 건조 과정에서 각각 확인되었습니다.

화학약품의 가장 큰 변화는 찌는 과정에서 관찰되었다. 대사경로 분석 결과 찌는 과정에서는 페닐프로파노이드, 플라보노이드 생합성, 알라닌 대사가 관찰되었고, 건조 과정에서는 글리신, 세린, 트레오닌 대사, 티아민 대사, 불포화지방산 생합성이 관찰되었다. 열 처리 중 화학적 변경의 가능한 메커니즘은 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 경로 분석에서도 제공되었습니다. 또한, Cistanche deserticola의 외관 흑화는 아미노산의 대사와 관련된 건조 단계보다 찌는 단계에서 주로 발생했습니다. 모든 결과는 Cistanche deserticola 가공 중 활성 화합물의 형성이 주로 찌는 단계에서 발생했음을 나타냅니다.

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소개

Cistanche deserticola는 Orobanchaceae과에 속하는 가장 유명한 강장제 중 하나로 중국, 이란, 인도, 몽골 등 세계 열대 및 아열대 지역에 주로 분포한다(1-3). Cistanche deserticola는 신장 결핍, 발기 부전, 여성 불임, 병적 leucorrhea, 다량의 자궁 출혈 및 노인성 (4, 5)의 치료를 위해 가장 일반적으로 사용되는 약초 중 하나입니다. 현대 약리학적 연구에 따르면 Cistanche deserticola는 면역, 항피로, 항노화, 학습 및 암기 능력 향상의 효과가 있음이 밝혀졌습니다(6). 이러한 건강상의 이점으로 인해 줄기 괴경으로 만든 Cistanche deserticola 차는 영양 보충제로 개발되어 소비자들에게 점점 더 선호되고 있습니다. Cistanche deserticola의 활성 성분은 약용 기능을 담당합니다(7). 페닐프로파노이드(예: 페닐에타노이드 배당체), 플라보노이드, 다당류, 올리고당, 이리도이드 및 리그난과 같은 Cistanche deserticola의 일부 활성 성분은 이전 연구에서 보고되었습니다(6, 8).

부패하기 쉽고 계절적 특성으로 인해 신선한 Cistanche Deserticola의 연중 공급이 불가능하므로 가공된 Cistanche Deserticola가 주요 소비 형태가 됩니다. Cistanche deserticola의 품질은 기후, 서식지, 기주, 수확 시기, 가공 기술 및 식물의 위치와 같은 많은 요인에 따라 달라지며, 그 중에서 가공 기술이 특히 중요합니다(4). 찌기와 건조는 Cistanche deserticola 가공에서 두 가지 중요한 단계입니다. 일반적으로 수확한 Cistanche deserticola 뿌리줄기는 93ºC의 찜 보일러에서 30분 동안 찐 다음 60ºC에서 수분 함량이 습윤 기준(wb) 10%가 될 때까지 건조했습니다(9).

이전 연구에서는 찌는 것이 페닐에타노이드 글리코사이드, 수용성 당 및 다당류와 같은 Cistanche deserticola의 활성 성분 축적을 촉진할 수 있으며 외관 색상의 흑화를 동반할 수 있음을 보여주었습니다(9-11). 그러나 이전 연구의 대부분은 특정 특정 화합물에 초점을 맞추었고, 가공 중 모든 화합물의 변화와 대사체 전환 메커니즘에 대한 연구는 매우 드뭅니다. 따라서 다양한 처리 단계에서 Cistanche deserticola의 대사 산물 변화를 명확히 할 필요가 있습니다.

Metabolomics는 일반적으로 샘플에서 검출된 모든 저분자(즉, 표적 및 비표적 화합물)의 정성 및 정량 분석에 적용됩니다(12). 식품 가공 중 다양한 화학 성분의 변화 분석은 식품 가공에서 화학 성분 변형 메커니즘에 대한 이해를 심화하는 데 도움이 됩니다(12). 최근 몇 년 동안 대사체학은 다른 부분(11)과 다른 Cistanche deserticola 종(13)의 구별을 위해 Cistanche deserticola 연구에도 적용되었습니다.

이 연구에서 대사체의 검출 방법은 대부분 표적 및 비표적 대사체학을 기반으로 했습니다. 그 중 Targeted Metabolomics는 표준 제품을 기반으로 데이터 정확도와 신뢰성이 높지만 대사 산물의 적용 범위가 제한적입니다. Targeted Metabolomics는 Metabolomics 연구의 중요한 부분으로, 샘플의 모든 구성 요소가 아니라 특정 대사체 그룹을 대상으로 특정 검출 및 분석하는 것입니다. 비표적 대사체학 기술은 기존 데이터베이스를 기반으로 대사체를 정성적으로 결정할 수 있지만, 화합물의 범위는 높지만 정확도는 낮습니다. 주요 대사산물은 표준 제품으로 확인해야 합니다(14). 광역 표적 대사체학은 비표적 및 표적 대사체 검출 기술의 장점을 통합하여 넓은 적용 범위, 높은 처리량 및 감도를 달성하는 새로운 기술입니다(15).

결과적으로 이 기술은 다양한 가공 방법에 의한 기능성 식품의 활성 성분(16), 다양한 방법으로 가공된 중국 밤나무의 플라보노이드 및 페닐프로파노이드 화합물(17)과 같이 가공 중 다양한 재료의 성분 변화 연구에 널리 사용되었습니다. , 황변 과정에서 쌀이 황변하는 메커니즘(18), 우롱차 제조 과정에서 특징적인 비휘발성 화학 물질의 형성 메커니즘(19). 따라서 Cistanche Deserticola 가공 중 활성 성분의 전환 메커니즘을 연구하기 위해 광범위 표적 대사 기술을 사용하는 것이 이론적으로 가능합니다.

따라서, 본 연구의 목적은 (1) 초고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(UHPLC-MS/MS)을 널리 표적화된 대사체와 결합하여 찌고 건조하는 과정에서 Cistanche deserticola의 화학적 변화에 대한 유용한 정보를 제공하는 것입니다. 접근하다; (2) 차등 대사 산물과 그 조절 규칙을 식별하고 가공 중 Cistanche deserticola에서 가능한 전환 경로를 밝힙니다. 따라서 본 연구는 고품질 Cistanche deserticola의 형성 메커니즘에 대한 이론적 참고 자료를 제공할 것으로 기대된다.

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재료 및 방법 재료 및 화학 물질

원료: 신선한 Cistanche deserticola 샘플은 중국 신장(Xinjiang) 성의 Hetian 지역에서 얻었습니다. 샘플은 동일한 크기로 신중하게 선택되었습니다(평균 길이, 직경 및 무게는 각각 11.7 ± 1.1 cm, 7.0 ± 1.1 cm 및 360 ± 8.9 g임). 샘플은 초기 수분 함량이 약 78.56% ± 3.47%인 어두운 환경의 실온에서 보관되었습니다. 실험 전에 Cistanche deserticola 샘플을 수돗물로 세척하여 표면의 먼지를 제거했습니다. 표면의 과도한 물은 압지로 제거하였다.

화학 물질: 메탄올, 아세토니트릴 및 포름산은 액체 크로마토그래피 질량 분석 등급(LC-MS)이며 Merck(Sigma Aldrich, MO, USA)에서 구입했습니다. 다른 분석 표준은 98% 이상의 순도를 나타냈다(Sigma Aldrich, MO, USA).

실험적 설계

이전 연구에서는 화학적 화합물이 Cistanche deserticola(1)의 세로 방향으로 고르지 않게 분포하는 것으로 나타났습니다. 따라서 각 샘플에서 동일한 초기 화합물 함량을 얻기 위해 본 연구에서는 선택된 모든 Cistanche deserticola를 신선한 그룹(A)에 대해 3등분으로 자르고 건조 그룹(B) 없이 찌고 스팀 그룹 후 건조했습니다. (C) 각각 세로 대칭축을 중심으로 세로 분할(20).

그룹 B의 경우 예비 실험에 따라 샘플을 8분 동안 연속적으로 찐다. 신선한 Cistanche deserticolas의 찜 처리를 위해 펄스 진공 찜 장비 (중국 베이징, 중국 농업 대학에서 자체 개발)를 사용했습니다. 찐 샘플을 진공 동결 건조기(LGJ-25C, Si Huan Scientific Instrument Factory Co., Beijing, China)에서 건조시켰다. 히팅 플레이트와 콜드 트랩 온도는 각각 30과 -60ºC입니다. 그룹 C의 경우 샘플을 펄스 진공 장비를 사용하여 8분 동안 연속적으로 찌고 열풍 충돌 건조기(중국 베이징, 중국 농업 대학에서 자체 개발)에서 최종 수분 함량이 10%(wb)가 될 때까지 건조했습니다. Zou et al.의 연구결과를 참고하여 풍속과 온도는 각각 6m/s와 60℃로 설정하였다. (11). 모든 샘플은 추가 분석 전 7일 이내에 -20ºC에서 보관되었습니다.

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Cistanche Deserticola의 외관 색상 결정

각 열처리 전후의 Cistanche deserticola의 외관 색상은 색도계(SMY2000SF, Shengming Yang Co., Beijing, China)를 이용하여 측정하였으며 흑도는 L ∗ 값으로 특성화하였다.

샘플 준비 및 추출

대사체 추출은 이전에 Chen 등이 보고한 방법에 따라 수행하였다. (21) 약간의 수정이 있습니다. 간단히 말해서, 건조된 샘플을 지르코니아 비드와 함께 믹서 밀(MM 400, Retsch Company, Haan, Germany)을 사용하여 60Hz에서 2분 동안 분쇄했습니다. 그런 다음 각 샘플의 50 mg 분말(65 메쉬 체를 통해 걸러짐)을 정확하게 칭량하고 Eppendorf 튜브로 옮기고 1 ml 메탄올/물 혼합물(v:v=3:1)로 추출했습니다. 30초 동안 vortex한 후, 혼합물을 35Hz에서 4분 동안 두 번 균질화하고 얼음물 수조에서 15분 동안 초음파 처리한 다음 4ºC에서 밤새 흔들었습니다. 4ºC에서 12000rpm, 15분간 원심분리한 후 상등액을 모아 0.22-µm 멤브레인으로 여과한 후 추출액을 2ml 유리 바이알에 옮겨 보관하였다. UHPLC-MS/MS 분석까지 -80ºC에서.

UHPLC-MS UHPLC 조건에 의한 대사산물 분석

UHPLC 분리는 EXIONLC 시스템(Sciex Technologies, Framingham, MA, USA)을 사용하여 수행되었습니다. 분석 조건은 다음과 같다: 컬럼: Waters ACQUITY UHPLC HSS T3 C18(1.8µm, 2.1 × 100 mm); 용매 시스템: 이동상 A(물 중 0.1% 포름산) 및 이동상 B(아세토니트릴 함유). 그래디언트 프로그램: 0분에 98퍼센트 A/2퍼센트 B, 10분에 50퍼센트 A/50퍼센트 B, 11분에 5퍼센트 A/95퍼센트 B, 13.1분에 98퍼센트 A/2퍼센트 B, 그리고 98퍼센트 A/2퍼센트 B 퍼센트 A/2퍼센트 B, 15분. 유속: 0.40ml/분; 컬럼 온도: 40ºC; 주입량: 2μl; 자동 사출 온도: 4ºC.

ESI-QTRAP-MS/MS 조건

삼중 사중극자(QQQ) 선형 이온 트랩 질량 분석기(QTRAP, API 6500 QTRAP UHPLC-MS/MS)와 ESI 터보 이온 분무 인터페이스(Sciex Technologies, Framingham, MA, USA)가 장착된 QQQ 분광기가 MS에 적용되었습니다. 분석. 분석 조건은 다음과 같다: 이온 분무 전압: 플러스 5,500 V(양이온 모드)/-4,500 V(음이온 모드), 커튼 가스: 35 psi, 소스 온도: 400℃, 이온 소스 가스 1: 60 psi, 이온 소스 가스 2: 60psi, 디클러스터링 전위: ±100V. QQQ 스캔은 충돌 가스(질소)를 5psi로 설정한 다중 반응 모니터링(MRM) 실험으로 획득했습니다.

대사체의 정성 및 정량 분석

대사산물의 정성 및 정량 분석은 Liu et al. (18). 1차 및 2차 질량 분석 데이터는 자체 구축한 인간 대사체 데이터베이스(MWDB)(Metware Biotechnology Co., Ltd., 중국 우한) 및 공개 데이터베이스를 기반으로 정성적으로 분석되었습니다. 한편, 일부 물질에 대한 정성분석의 정확성을 확보하기 위해 Na plus , NH plus 4 , K plus , ion 등의 반복 신호에 의한 간섭과 상대적으로 큰 다른 분자 및 동위원소 신호에서 파생된 fragment ion의 반복 신호에 의한 간섭을 제거하였다. 신분증. 공개 데이터베이스(Mass Bank, KNApSAcK, HMDB, MoTo DB 및 METLIN)에 대해 대사체 구조 분석을 수행하였다.

QQQ 질량 분석법의 MRM 모드를 사용하여 대사체 정량화를 수행했습니다. MRM 모드에서는 대상 물질의 전구체 이온(모 이온)과 분자량이 다른 다른 물질에 해당하는 배제 이온을 사중극자 로드를 사용하여 먼저 스크리닝하여 간섭을 초기에 제거했습니다. 그런 다음 전구체 이온은 충돌 챔버를 통과하여 이온화 후 많은 조각 철을 형성하며, 이는 QQQ에 의해 필터링되어 비표적 이온의 간섭을 제거하면서 원하는 특성을 가진 단일 조각 이온을 선택합니다. 마지막으로 여러 샘플의 대사체 질량 분석 데이터를 얻은 후 모든 물질의 질량 스펙트럼 피크를 통합하고 다른 샘플에서 동일한 대사체의 질량 스펙트럼 피크를 통합하고 Multi Quant 버전 3을 사용하여 보정했습니다.0 .2 (ABSCIEX, 콩코드, 온타리오, 캐나다). 상응하는 상대 대사체 함량은 크로마토그래피 피크 면적 적분으로 표시되었습니다.

데이터 처리 및 분석

대사 데이터는 직교 부분 최소 제곱 판별 분석(OPLS-DA) 및 계층적 클러스터 분석(HCA)을 사용하여 처리되었습니다. OPLS-DA는 각 그룹을 구별하는 데 사용되었습니다. 상관관계가 낮은 변수에 대해 다른 통계적 방법보다 더 민감합니다(17). OPLS-DA 모델은 순열 분석(200회)을 통해 검증되었습니다. 모델 매개변수(R2 및 Q2)가 모두 1에 가까울 때 모델이 안정적인 것으로 간주되었습니다.

대사 산물의 VIP(Variable Importance Projection) 값이 계산되었습니다. VIP 값이 1.0보다 크고 p-값이 0.05보다 작은 모든 대사산물은 Cistanche deserticola의 서로 다른 열 처리 단계 간의 각 쌍 비교를 위한 바이오마커로 선택되었습니다. 다양한 대사 산물의 스크리닝은 화산 플롯의 형태로 시각화되었습니다. R 패키지(www.rproject.org/)를 사용하여 서로 다른 샘플 간의 대사산물 축적을 분석했습니다. Venn 다이어그램은 프로그램 웹 기반 스마트 다이어그램 R(https://cloud.smartdraw.com/)에 따라 작성되었습니다. KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)(https: //www.kegg.jp/kegg/), Pub Chem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), Small Molecule Pathway Database(SMPDB)(https://smpdb.ca/) 및 HMDB(https://hmdb.ca/)는 차등 대사산물의 농축 분석 및 대사 경로 찾기에 사용되었습니다.

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결과 및 고찰 열처리 중 Cistanche Deserticola의 외관 색상 변화

신선한 것, 찐 것, 말린 것 사이의 Cistanche deserticola의 외관 색상의 차이는 그림 1에 대표적으로 표시됩니다. 신선한 것에서 건조된 것까지 가공 단계가 진행됨에 따라 샘플의 외관 색상이 황갈색에서 어두운 검정색으로 변했습니다. , 색상의 어두움이 점점 더 분명해졌습니다(해당 L * 값이 50.26에서 24.90으로 감소됨). Cistanche deserticola의 외관 변화는 주로 찌는 과정에서 발생했습니다. 당이 열 조건에서 아미노산과 반응하는 메일라드 반응(22)은 Cistanche deserticola의 처리된 뿌리 줄기가 어두운 색으로 나타나는 데 크게 영향을 미칩니다. 이전 연구에서는 Maillard 반응(23)에서 전구체가 착색제로 전환되고 어두운 색상의 물질을 생성하는 것으로 나타났습니다. Polygonum multiflorum (24) 및 Polygonatum cystoma (25)의 뿌리 줄기에 대한 이전 연구에서도 유사한 결과가 관찰되었습니다. 찐 샘플의 어두움은 건조 후에 더욱 짙어졌다. 이러한 현상은 건조과정에서 안료농도의 저하가 발생하였기 때문으로 추정된다.

미가공 및 열처리된 Cistanche Deserticola 샘플의 대사산물 개요

품질 관리(QC) 샘플(조사된 모든 샘플의 혼합물)의 총 이온 크로마토그램(TIC)과 동일한 샘플의 MRM 모드에서 화학 물질의 다중 피크 검출 플롯이 보충 그림 1에 나와 있습니다. 샘플의 다른 구성 요소. 그림 2에서 볼 수 있듯이 신선한 Cistanche deserticola 샘플에서 현재 연구(보충 표 1)에서 총 776개의 대사산물이 확인되었으며, 이는 40개의 아미노산 및 유도체, 33개의 페닐프로파노이드, 23개의 플라보노이드, 68 플라본, 67 테르펜, 67 페놀, 87 알칼로이드, 13 탄수화물, 28 뉴클레오티드 및 유도체, 5 알코올 및 폴리올, 3 퓨린 뉴클레오사이드, 15

카르복실산 및 유도체, 14종의 유기산 및 유도체, 12종의 식물호르몬, 28종의 기타 화학물질. 그 중 가장 큰 그룹은 아미노산과 유도체로 전체 대사체 조성의 30.26%를 차지했다. 또한, 에키나코사이드(echinacoside), 버바스코사이드(verbascoside) 등 10종의 페닐에타노이드 글리코사이드가 검출되어 페닐프로파노이드 그룹으로 분류되었다.

상이한 처리군 사이의 대사산물의 축적 패턴을 HCA로 분석하였다. 그림 3에서 볼 수 있듯이 Cistanche deserticola의 107개의 확인된 대사산물은 유클리드 거리 산술을 기반으로 히트 맵에 클러스터링되었습니다. 서로 다른 열처리 단계에서 확인된 대사산물은 덴드로그램에 따라 세 개의 클러스터로 모였습니다. 더 밝은 색상은 각 샘플에서 특정 대사 산물의 함량이 더 높다는 것을 나타냅니다. HCA의 열지도는 찌고 말린 샘플 사이의 것보다 신선한 샘플과 찐 샘플 사이의 풍부도에서 더 큰 차이를 보여, Cistanche deserticola의 대사 산물이 찜 및 건조 단계에서 다른 변형을 가질 수 있음을 나타냅니다. 찜 과정은 건조 과정보다 더 많습니다.

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다양한 열처리 단계에서 Cistanche Deserticola의 차등 대사산물 분석

Cistanche Deserticolas의 대사산물에 대한 각 처리의 영향을 더 잘 이해하기 위해, 쌍별 비교 그룹의 OPLS-DA 산포 점수가 그림 4A에 표시되어 있으며, Cistanche Deserticolas를 찐 후 신선하고 찌고 건조된 것이 상당히 달랐음을 보여줍니다. 또한 테스트 값이 높은 R2Y 및 Q2(보충 그림 2 참조)는 이 모델이 과적합 없이 매우 신뢰할 수 있음을 나타냅니다.

신선, 찜, 찜 후 건조된 Cistanche deserticola 사이의 대사산물 발현 수준을 스크리닝하기 위해 배 변화에 따라 식별된 모든 776개의 대사산물 중에서 화산 플롯의 분석을 추가로 적용하고 VIP 값과 결합하여 차등 발현을 스크리닝했습니다. 대사 산물. 유의미한 차등 대사산물은 VIP가 1보다 크거나 같은 0.5보다 크거나 같거나 같은 접힘 변화 점수라는 기준에 따라 선택되었습니다. 스크리닝 결과는 에 설명되어 있습니다. 그림 4B. 화산지도에서 각 점은 대사산물을 나타내고 흩어진 점의 색상은 최종 스크리닝 결과를 나타냅니다. 빨간색은 상당히 상향 조절된(UR) 대사물을 나타내고, 녹색은 상당히 하향 조절된(DR) 대사물을 나타내며, 회색은 미미하게 다른 대사물을 나타냅니다. 그림 4B에 나타난 바와 같이, 신선 대 찐 그룹에서 47개의 대사 산물(17 UR 및 30 DR), 찐 대 건조 그룹에서 30개의 대사 산물(22 UR 및 8 DR), 신선 대 건조 그룹에서 65개의 대사 산물 (29 UR 및 36 DR)은 유의한 차이가 있는 것으로 선택되었습니다. 생대조군과 찜군이 찜군과 건조군보다 유의하게 다른 대사체의 수가 더 많아, 찌는 과정이 건조 과정보다 대사체에 미치는 영향이 더 크다는 것을 알 수 있다.

Cistanche deserticola의 열처리 과정에서 생성된 차등 대사산물을 추가로 분류하고 비교했습니다. 이렇게 차등적으로 발현된 대사산물은 주로 아미노산과 그 유도체, 플라보노이드와 그 유도체, 페닐프로파노이드, 알칼로이드, 테르펜, 페놀, 뉴클레오티드와 그 유도체 등 21가지 부류로 분류되었다(표 1). 신선한 그룹과 찐 그룹에서 flavonoids(예: isoquercitrin, troxerutin, cyanidin 및 fisetin), phenylpropanoids(예: 클로로겐산 및 3-(3,4-Dihydroxy{ {5}}메톡시)-2-프로펜산), 뉴클레오티드 및 그 유도체(우라실 및 베타니코틴아미드 모노뉴클레오티드)는 유의미한 DR인 반면, 아미노산 및 그 유도체(예: N6-아세틸-L-라이신) , 1- Methy-L-histidine 및 L-Phenylalanine)은 상당히 UR이었습니다.

그러나 찐 그룹과 건조 그룹에서 이러한 유형의 차등 대사체의 발현 경향은 정반대였습니다. 일부 아미노 및 그 유도체(예: N,N-디메틸글리신), 뉴클레오티드 및 그 유도체(예: 2'-데옥시우리딘; 데옥시우리딘)는 유의미한 DR인 반면, 대부분의 페놀(예: 메틸 갈레이트 및 4'-프레닐옥시레스베라트롤), 플라보노이드(예: isoquercitrin 및 cyanidin), 페닐프로파노이드(verbascoside) 및 테르펜(예: terpinolene 및 furanone)은 UR이 상당히 많았습니다. 이러한 결과는 Cistanche deserticola의 화학 조성이 열 처리 중에 변환되었으며, 이는 주로 플라보노이드, 페닐프로파노이드 및 아미노산의 변환에 반영되며 이러한 구성 요소의 변환 메커니즘은 다른 처리 단계에서 다릅니다.

증숙 및 건조 공정 동안 고온의 사용은 이전에 가수분해, 산화환원, 이성체화, 치환 및 기타 대사산물의 열물리적 및 화학 반응을 촉진하는 것으로 밝혀졌습니다(26). 이 연구에서 플라보노이드 및 페닐프로파노이드와 같은 대사 산물이 상응하는 신선한 것과 비교하여 찐 Cistanche Deserticola에 상당히 축적되어 플라보노이드 및 페닐프로파노이드의 합성으로 이어지는 일부 주요 생리 및 대사 활동이 다음과 같을 수 있음을 나타냅니다. 높은 온도와 습도에서 활성화됩니다. 이 결과는 Peng et al.의 보고서에서도 뒷받침될 수 있습니다. (10) 찐 후 PhGs(페닐프로파노이드에 속함)의 함량이 증가한 것을 발견한 사람. 그러나 증기 처리 후 건조된 샘플에서 이러한 성분의 축적은 상당한 감소를 나타냈으며, 이는 장기 건조 과정에서 이러한 열에 민감한 성분의 열 분해에 기인할 수 있습니다. 이전 연구에서는 플라보노이드 글리코시드가 열 조건에서 당체와 플라보노이드 아글리콘으로 분해될 수 있으며 건조 과정 중 플라보노이드 손실이 온도와 건조 시간에 의해 합성적으로 영향을 받는다는 것을 보여주었습니다(26, 27). 아미노산 및 그 유도체(N6-Acetyl-L-lysine, 1-Methy-L-histidine 및 phenylalanine)의 상향 조절은 찜 처리 중 고온 촉진 단백질 분해에 기인합니다. 또한 N,N-Dimethylglycine, L-Kynurenine, glycine, serine, threonine 등 일부 다른 아미노산과 그 유도체도 DR인 것으로 관찰되었다. 이러한 아미노산 함량의 감소는 환원당이 아미노산과 반응하여 5-HMF를 생성하는 열 유도 메일라드 반응과 관련이 있을 수 있으며, 이는 Cistanche deserticola에서 검은 외관 생성에 기여합니다(22). .

열 처리 중 cistanche deserticola의 단면 외관 색상 변화 결과는 이 가설을 추가로 확인했습니다. 따라서 찌는 동안 Cistanche deserticola의 검게 변하는 것은 아마도 아미노산의 대사와 관련이 있을 것입니다. 다양한 열처리 단계에서 Cistanche deserticola의 일반적이고 배타적인 대사산물을 구별하기 위해 벤 다이어그램을 사용했습니다. 그림 4C에서 볼 수 있듯이 공통 및 고유 대사 산물이 서로 다른 비교 그룹 사이에 존재합니다. 신선군과 찜군 사이에는 21개의 공통 대사체가 관찰되었으며, 생군과 건조군, 찜군과 건조군에서는 각각 5개와 10개의 대사체가 공통적으로 관찰되었다. 따라서 열 처리 단계인 찌기와 건조 과정에서 Cistanche deserticola에서 총 23개와 17개의 배타 대사산물(p < 0.05)이 관찰되었습니다. 이 결과는 Cistanche deserticola 처리 중 대사 산물의 전환에 특히 증기 처리가 중요하다는 것을 확인했습니다.

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차등 대사산물의 강화 분석 및 KEGG 경로 영향 분석

또한, 니코티네이트 및 니코틴아미드 대사, 페닐프로파노이드 생합성 및 플라보노이드 생합성과 같은 이 두 쌍별 비교 사이의 일부 대사 경로가 중첩되었지만, 이들의 농축 수준은 두 쌍별 비교에서 매우 달랐습니다. 이러한 결과는 Cistanche deserticola의 찌는 과정과 건조 과정 사이의 대사 산물의 전환 경로가 상이하며, 대사 경로의 차이는 열 처리 동안 차별적으로 배타적인 대사 산물의 존재 차이를 설명할 수 있음을 시사합니다. 이러한 생화학적 변화는 열 처리 단계가 Cistanche deserticola 구성에 미치는 영향을 이해하는 데 사용될 수 있습니다.

4가지 대사 경로(페닐프로파노이드 생합성, 플라보노이드 생합성, 알라닌 대사 및 글리신, 세린 및 트레오닌 대사)가 열처리 중 Cistanche deserticola의 주요 활성 성분의 전환을 특성화하는 주요 대사산물로 선택되었습니다(그림 5b1,b2). 현재 연구는 페닐프로파노이드와 플라보노이드가 축적되었지만 신선하고 건조한 샘플에 비해 찐 Cistanche deserticola에서 아미노산이 분해되었음을 나타냅니다. 페닐프로파노이드 생합성 경로는 플라보노이드 생합성 경로의 상류에 있습니다. 유사한 결론이 Liu et al. (18) 쌀이 황변하는 과정에서 페닐프로파노이드의 축적 수준이 정상 쌀에 비해 현저하게 증가했다고 보고했습니다. Phenylpropanoids는 계피산에서 파생되며, 그 전구체는 페닐알라닌으로 가열될 때 페닐알라닌 암모니아-분해효소(PAL)의 활성을 활성화하여 합성할 수 있습니다(28).

이전 연구에서는 페닐프로파노이드 경로가 식물 방어에 중요한 무기인 쿠마린, 플라본, 이소플라본, 플라보놀의 생합성을 유도하고(29), 찌는 과정에서 강한 열 스트레스로 인한 세포 사멸을 방지하기 위해 페닐프로파노이드가 경로는 고온으로 인한 생물학적 스트레스로 인해 향상될 수 있습니다(30, 31). 플라보노이드는 페닐프로파노이드에서 파생된 주요 2차 대사산물이며(32), 플라보노이드가 축적되면 제거하는 자유 라디칼에 의한 산화적 손상으로부터 식물을 보호할 수 있습니다(33). 신선하고 건조한 Cistanche deserticola와 비교할 때, 찐 Cistanche deserticola에서 플라보노이드의 더 높은 생합성은 반응성 산소 종(ROS)을 보호하는 찌는 과정 동안 강화된 열 스트레스와 관련이 있을 수 있습니다(34, 35). 그림 5b3 및 b4에서 볼 수 있듯이 아미노산 대사는 Cistanche deserticola의 열처리에서 중요한 역할을 했습니다. 한약재에서 발견되는 증숙 후 alanine, glycine, serine, threonine의 함량 변화는 Maillard 반응의 발생을 나타내는 데 사용되었습니다(36).

그럼에도 불구하고 Cistanche deserticola 찜의 복잡한 과정으로 인해 외관의 흑화, 활성 화합물 및 대사 바이오 마커와 같은 Cistanche deserticola 찜에 대한 종합적인 평가가 추가로 조사되어야 합니다.

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결론

본 연구에서는 UHPLC-MS/MS 기반의 광범위한 표적 대사체학 접근법을 사용하여 Cistanche deserticola의 다양한 열처리 단계에서 활성 화합물의 형성 메커니즘을 연구했습니다. 현재 결과는 페닐프로파노이드 및 플라보노이드와 같은 일부 주요 대사 산물의 생합성이 찌는 과정에서 크게 향상되었음을 보여줍니다. 찐 Cistanche deserticola의 아미노산 발현 수준이 향상되어 1차 대사 산물과 2차 대사 산물 사이의 변환을 나타냅니다. 또한 Cistanche deserticola의 외관 흑화 현상은 건조 단계보다 증숙 단계에서 주로 발생하는데, 이러한 특성은 아미노산 대사 경로와 관련이 있다. 그러나 상기 대사체의 수준은 건조 과정에서 현저하게 감소하였으며, 이는 활성 화합물의 형성이 주로 Cistanche deserticola의 열처리 중 증숙 단계에서 발생했음을 시사합니다. 우리가 아는 한, 열 처리 중 활성 화합물 변화의 메커니즘과 Cistanche deserticola 흑화에 대한 결정적인 기여를 밝히기 위해 광범위하게 표적화된 대사체학 방법이 사용된 것은 이번이 처음입니다. 그러나 열처리 중 활성 화합물의 생합성과 외관의 흑화 사이의 관계를 더 잘 이해하려면 추가 조사가 필요합니다.

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차등 대사산물의 강화 분석 및 KEGG 경로 영향 분석

신선하고 가공된 샘플의 차등 대사산물(p < 0.05)은 분자 상호 작용, 반응 및 관계 네트워크에 대한 지식과 농축 결과를 포함하는 KEGG, HMDB 및 PubChem 온라인 데이터베이스에 매핑되었습니다. 자세한 대사 경로는 보충 표 2 및 그림 5에 나와 있습니다. 그림 5a1 및 a2에서 볼 수 있듯이 경로 영향은 페닐프로파노이드 생합성, 플라보노이드 생합성, 알라닌 대사, 리보플라빈 대사, 타우린 및 하이포타우린 대사, 니코티네이트 및 니코틴아미드의 강화를 나타냅니다. Cistanche deserticola의 찌는 동안 대사. 반면 증숙 후 건조 과정에서 대사산물의 대사경로는 글리신, 세린, 트레오닌 대사, 티아민 대사, 피리미딘 대사, 불포화지방산 생합성 등이 주를 이뤘다. 또한, 니코티네이트 및 니코틴아미드 대사, 페닐프로파노이드 생합성 및 플라보노이드 생합성과 같은 이 두 쌍별 비교 사이의 일부 대사 경로가 중첩되었지만, 이들의 농축 수준은 두 쌍별 비교에서 매우 달랐습니다. 이러한 결과는 Cistanche deserticola의 찌는 과정과 건조 과정 사이의 대사 산물의 전환 경로가 상이하며, 대사 경로의 차이는 열 처리 동안 차별적으로 배타적인 대사 산물의 존재 차이를 설명할 수 있음을 시사합니다. 이러한 생화학적 변화는 열 처리 단계가 Cistanche deserticola 구성에 미치는 영향을 이해하는 데 사용될 수 있습니다.

KEGG 주석 및 농축 분석을 기반으로 4가지 대사 경로(페닐프로파노이드 생합성, 플라보노이드 생합성, 알라닌 대사 및 글리신, 세린 및 트레오닌 대사)가 열 처리 동안 Cistanche deserticola의 주요 활성 성분의 전환을 특성화하는 주요 대사산물로 선택되었습니다. 처리(그림 5b1,b2). 현재 연구는 페닐프로파노이드와 플라보노이드가 축적되었지만 신선하고 건조한 샘플에 비해 찐 Cistanche deserticola에서 아미노산이 분해되었음을 나타냅니다. 페닐프로파노이드 생합성 경로는 플라보노이드 생합성 경로의 상류에 있습니다. 유사한 결론이 Liu et al. (18) 쌀이 황변하는 과정에서 페닐프로파노이드의 축적 수준이 정상 쌀에 비해 현저하게 증가했다고 보고했습니다. Phenylpropanoids는 계피산에서 파생되며, 그 전구체는 페닐알라닌으로 가열될 때 페닐알라닌 암모니아-분해효소(PAL)의 활성을 활성화하여 합성할 수 있습니다(28).

신선하고 건조한 Cistanche deserticola와 비교할 때, 찐 Cistanche deserticola에서 플라보노이드의 더 높은 생합성은 반응성 산소 종(ROS)을 보호하는 찌는 과정 동안 강화된 열 스트레스와 관련이 있을 수 있습니다(34, 35). 그림 5b3 및 b4에서 볼 수 있듯이 아미노산 대사는 Cistanche deserticola의 열처리에서 중요한 역할을 했습니다. 한약재에서 발견되는 증숙 후 alanine, glycine, serine, threonine의 함량 변화는 Maillard 반응의 발생을 나타내는 데 사용되었습니다(36). 그럼에도 불구하고 Cistanche deserticola 찜의 복잡한 과정으로 인해 외관의 흑화, 활성 화합물 및 대사 바이오 마커와 같은 Cistanche deserticola 찜에 대한 종합적인 평가가 추가로 조사되어야 합니다.

결론

데이터 가용성 진술

연구에 제시된 원래 기여는 기사/보충 자료에 포함되어 있으며 추가 문의는 해당 작성자에게 문의할 수 있습니다.

저자 기여

ZA는 실험 설계를 수행하고, 실험을 수행하고, 데이터를 생성하고, 이 원고를 작성했습니다. YZ는 대사체학 분석을 수행했습니다. XL은 통계 분석을 제공했습니다. WS는 데이터 처리 및 조사를 수행했습니다. 자금 조달, 전체 프레임 워크 및 쓰기 검토는 YL에 의해 완료되었습니다. 모든 저자는 기사에 기여했으며 제출된 버전을 승인했습니다.

자금 조달

이 작품은 광동성 과학기술부(No. 2018B020241003)의 재정적 지원을 받았습니다.

보충 자료

이 기사의 보충 자료는 온라인에서 찾을 수 있습니다: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnut.2021. 742511/full#supplementary-material

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이해 상충:

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