신장 대체 요법이 필요한 환자의 산화 스트레스 지표로서 혈소판이 부족하고 풍부한 혈장의 크산틴 산화환원효소 활성

추상적인 배경: 크산틴 산화환원효소XOR(XOR)은 퓨린 대사에 관여하는 수산화효소입니다. XOR 활성은 다양할 수 있습니다. 동종이량체 단백질은 두 가지 다른 이소형 XD(항산화제)와 XO(산화촉진제)로 변환될 수 있습니다. 동반되는 산화 스트레스 및 염증만성 신장 질환(CKD), 투석, 신장 이식으로 인해 혈소판이 활성화되었습니다. 본 연구는 적용된 신장 대체 요법이 크산틴 산화환원효소 및 그 이소형 활성에 미치는 영향을 확인하는 것을 목표로 했습니다.

재료 및 방법: 연구군은 117명의 환자로 구성되었으며, 혈액투석- 30 환자, 복막투석 - 30 환자, 신장 이식 환자 - 27 및 보존적 치료 {{5}의 4개 군으로 나누어졌다. } 환자. 대조군은 30명의 건강한 자원자로 구성되었습니다. 결과: 연구 대상 그룹 내에서 혈소판 결핍 혈장(PPP)의 XOR 활동에 상당한 차이가 발견되었습니다(p=0.001). PPP의 모든 산화환원효소 이소형에 대한 신장 대체 요법 유형 사이에는 연관성이 있었습니다(p<0.001 all isoforms) and XD (p=0.008), XO (p<0.001) in platelet-rich plasma (PRP). A relationship was observed between the activity of all oxidoreductase isoforms in PPP and PRP, the type of renal replacement therapy the duration of dialysis, and the age of patients. The만성신장질환의 원인이는 PPP의 XD 및 XO 활동의 차이에도 반영되었습니다.

결론: CKD 환자에게 사용되는 신대체요법의 종류, 환자의 연령, 투석 기간, CKD 원인, 진행 단계는 XOR 및 그 이소형의 활성에 유의한 영향을 미칩니다.

키워드: 잔틴산화효소, 혈소판, 신장대체요법,만성 신장 질환, 항산화 효소

CISTANCHE가 작동하는 데 얼마나 걸리나요?

배경

잔틴 산화환원효소(XOR)는 퓨린 대사에 관여하는 수산화효소입니다. 이는 하이포잔틴이 잔틴으로, 잔틴이 요산(UA)으로 산화되는 것을 촉매합니다. XOR 활성은 다양할 수 있습니다. 동종이량체 단백질은 두 개의 서로 다른 동형으로 변환될 수 있습니다. 잔틴 탈수소효소(XD)는 건강한 조직에서 주로 발현되며, 잔틴 산화효소(XO)는 번역 후 XD 변형, 산화 시스테인 잔기 및 제한된 단백질 분해에 의해 생성되어 손상 시 세포와 조직에서 지배적인 역할을 합니다. ]. 언급된 isoform의 활동은 서로 반대됩니다 [4]. XOR은 NAD+가 있을 때 탈수소효소로 작용하고 산소 분자와 함께 산화효소로 작용합니다. 다양한 유형의 조직 손상에서 항산화제를 산화제로 신속하게 전환시키는 XOR의 능력은 신속한 선천적 면역 반응을 위한 필수 요소이며, 예를 들어 박테리아 또는 곰팡이 감염에 유익합니다[5].

XDO(잔틴 탈수소효소)와 산소의 반응 중간체는 NAD+ 및 O2와 모두 반응할 수 있지만 NAD+에 더 높은 친화력을 나타냅니다[6]. 이 중간체 isoform은 분리되지 않았지만 활성을 확인하면 XD에서 XO로의 변환을 추적하는 것이 쉬워집니다[7].

다양한 질병에서의 혈청 XOR 활성이 널리 조사되었습니다. 이 효소에 관심이 있는 이유는 그 작용의 이중성, 즉 항산화제를 생성하는 능력과 다른 한편으로는 활성 산소종 생성 때문입니다. XOR 활동의 증가는 바이러스성 간염, 감염성 단핵구증, 자가면역 질환, 폐렴, 정신분열증 및 제2형 당뇨병과 같은 병리학적 상태에서 발생합니다. XOR 활성의 증가는 신장 또는 간 이식 후 환자의 혈청에서도 관찰됩니다 [8]. XOR을 코딩하는 유전자는 신장 성숙과 신장의 지방 생성을 담당할 수 있으며 상피 세포가 중간엽 조직으로 전환되는 것을 방지할 수 있는 것으로 나타났습니다[9]. 그러나 우리의 최선의 지식으로 인해 신대체요법을 받는 환자의 혈소판 결핍 혈장(PPP) 및 혈소판 풍부 혈장(PRP)에서 XOR 활성을 조사한 발표된 보고서는 없습니다. 이 환자 그룹에서 XOR 활동의 중요성은 만성 신장 질환(CKD), 투석 및 신장 이식에 수반되는 산화 스트레스 및 염증으로 인해 발생하는 혈소판 활성화 증가와 관련이 있습니다. 게다가 투석이나 장기 이식 시 조직과 혈관이 손상되고, 혈소판은 조직 손상 부위에 가장 먼저 도달하는 세포로서 염증 과정과 치유의 초기 단계에 적극적으로 참여한다[10].

PRP와 PPP는 혈소판 농도가 다른 혈장 분율입니다. PRP와 PPP의 혈소판 함량은 각각 혈소판/ml 및 혈소판/ml입니다. PPP와 PRP는 인간의 전혈을 서로 다른 원심 속도로 반복적으로 원심분리 및 세척하여 얻습니다[11, 12].

항응고 혈액의 원심분리 부산물인 PPP는 정상 혈액보다 혈소판 농도가 낮습니다. PPP의 주요 성분은 피브리노겐, 피브로넥틴, 트롬빈입니다. PPP의 생물학적 효과는 지혈 및 응고에 참여하고, 세포 부착 벡터로 작용하고, 섬유아세포 및 상피 세포의 유사분열을 촉진하는 것입니다[13]. PPP는 PRP만큼 혈소판에 집중되어 있지는 않지만 PPP가 세포 성장과 생존을 유지할 수도 있다는 것이 입증되었습니다. PPP는 상처 치유 관련 세포 기능을 촉진하고 세포 이동과 섬유아세포의 증식을 가속화합니다[14, 15]. 혈소판 풍부 혈장은 정상 혈장보다 혈소판이 더 농축되어 있습니다(약 150~400×103개 세포/dL). 이는 문헌에서 PRP의 가장 일반적인 정의 중 하나입니다[16]. 현재까지 만성 신장 질환을 앓고 있는 환자의 혈소판 풍부 또는 불량 혈장에서 XOR 및 이의 이소폼 활성을 특징으로 하는 제한된 연구만 있었습니다. Tanet al. 반응성 산소종(ROS)에 의해 손상된 세포(만성 신대체요법의 경우)가 "누출" XOR 이소형을 보여 혈장 내 효소 수준이 증가하는 것으로 나타났습니다[17]. 이 메커니즘은 PPP에 비해 혈소판에서 XOR 및 해당 동형체의 낮은 활성을 설명합니다. 따라서 PPP와 PRP의 산화환원효소 활성은 매일 발생하는 세포 과정을 밝혀내는 데 도움이 될 수 있으므로 큰 관심을 끌고 있습니다. 이러한 조사는 또한 이 환자 그룹의 산화 스트레스의 심각성을 간접적으로 강조할 수 있습니다.

Berryet al. 또한 크산틴 산화환원효소가 간, 소장, 유선 및 내피 세포에 분포한다고 설명합니다. 세포하 국소화 방법을 통해 세포질과 세포막 모두에서 크산틴 산화환원효소의 존재가 입증되었습니다. 그들은 또한 혈장 잔틴 산화환원효소가 세포막의 잔틴 산화환원효소 음영 또는 세포질에서 누출로 인한 것일 수 있음을 나타냅니다. 이것이 혈소판과 혈장에 포함된 다른 혈액 세포의 효소 활성을 구별하기 위해 PPP와 PRP에서 XOR의 활성을 테스트하는 이유 중 하나입니다[18]. 항산화 효소의 활성을 바탕으로 어떤 유형의 신장 대체 요법이 환자를 산화 스트레스에 노출시킬 가능성이 적은지 결정할 수도 있습니다. XOR의 이중 특성으로 인해 신장 대체 요법의 유형과 XOR 동형체의 활성 사이의 관계를 이해하는 것은 신장 대체 요법의 유형을 선택하는 데 매우 흥미롭고 도움이 될 수 있습니다.

재료 및 방법

윤리적 승인 및 동의

슈체친의 포메라니안 의과대학 생명윤리위원회는 수행된 연구를 승인했습니다(KB-0012/36/11 없음). 대조군의 건강한 지원자를 포함한 모든 참가자에게 연구의 목적과 범위에 대한 정보를 제공하고 샘플 기증 및 결과 데이터 공개에 동의했습니다.

스터디 그룹

참가자는 147명이었습니다. 대조군은 건강한 지원자(NK) 30명, 만성 신장 질환(CKD) 환자 117명으로 슈체친 포메라니안 의과대학의 신장학, 행성 이동학, 내부 질환 클리닉에 다니고 있었습니다. 환자들은 받은 치료에 따라 4개 그룹으로 나뉘었습니다. 혈액투석 전후(HD A 및 HD B) 환자 30명, 복막투석(PD)을 받은 환자 30명; 신장 이식 전후(수술 후 5~7일) 환자 27명(TE, TE A); 30명의 환자가 보존적 치료(CT)를 받았습니다(CKD 2~5기). 시험군과 대조군의 성별, 연령, 투석기간, 만성신장질환의 원인과 단계, 크레아티닌 농도를 표 1과 2에 나타내었다.

견본

모든 연구 참가자로부터 혈액 샘플(K2EDTA(8ml), 3.8% 구연산삼나트륨(9:1; v/v) 및 혈청(8ml))을 채취했습니다. 혈액투석된 환자의 혈액은 동정맥루에서 채취되었습니다. 다른 모든 참가자에게는 말초 정맥 천자가 사용되었습니다. 샘플은 혈액투석 환자의 혈액투석 전(HD A)과 펌프 정지 후 약 10분(HD B)에서 채취되었습니다. 이식 환자의 혈액은 이식 전(TE)과 수술 후 5~7일(TE A)에 수집되었습니다. TE 그룹에 모집된 환자는 본 연구에서 혈액투석 또는 복막투석 환자 그룹에 속하지 않았습니다. 그들은 폴란드 전역에서 온 이식 자격을 갖춘 환자였습니다. 신장 이식 환자의 대다수는 이전에 분석을 받았습니다. K2EDTA와 응고된 혈액 시료를 20도에서 10분간 2600rpm으로 원심분리하여 혈장과 혈청을 각각 얻었다. 혈소판 풍부 혈장(PRP)과 혈소판 결핍 혈장(PPP)을 얻기 위해 구연산염으로 채취한 혈액을 1100 rpm 조건에서 20도에서 10분간 원심분리하였다. 생성된 PRP를 새 튜브로 옮기고 6000rpm에서 10분 동안 20도에서 원심분리했습니다. 혈소판 결핍 혈장(PPP)을 별도의 튜브로 옮겼습니다. 혈소판 펠릿을 두 번 헹구고 Tyroda 완충액(pH7.4)에 현탁시켰습니다. 혈장, 혈청, PPP 및 PRP는 분석이 수행될 때까지 -80도에서 동결되었습니다. 혈액투석 환자의 경우 헤파린 투여 전과 투석 후 평균 4~5시간 동안 혈액을 수집했습니다(헤파린 반감기 - 4 h). 이는 헤파린이 XOR 활동에 미치는 영향을 제거하기 위한 것입니다.

혈소판이 부족한 혈장 및 혈소판에서의 크산틴 산화환원효소 활성

Perkin Elmer UV/VIS Lambda 40P 분광 광도계를 사용하여 측정을 수행했습니다. 소멸 변화는 30도에서 5분 동안 340nm(XD) 및 302nm(XDO, XO)에서 기록되었습니다. 효소 활성은 요산과 NADH의 형성(A340 및 A302의 증가)으로 측정되었으며 mU×mL-1(밀리리터당 밀리유닛)로 표시되었습니다. 초기 반응 속도를 고려하여 효소 활성을 계산했습니다. 요산 형성은 302nm(이소형 XDO 및 XO)에서 측정되었는데, 그 이유는 흡광도가 여전히 높은 반면 NAD+ 농도의 변화는 기여하지 않기 때문입니다. NADH+ H+ ε340=6.22× 103 [L∙mol−1 cm−1 ]에 대한 소멸 계수를 사용하여 크산틴 산화환원효소 NADH+ H+의 이소형 활성을 계산했습니다: ε302=2.30× 103 [ L∙mol−1 cm−1 ] [7, 19–22].

풀 사이즈 테이블

P * - HD, PD 및 CKD 그룹 간의 차이에 대한 통계적 유의성, 정성적 변수에 대한 TE 및 C 정확한 Fisher 테스트; 정량적 변수의 경우 - 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 및 P ** - HD, PD 및 CKD 그룹 간의 차이에 대한 통계적 유의성과 정량적 변수 일원 분산 분석에 대한 정성적 변수에 대한 TE 정확한 Fisher 테스트 또는 DM - 당뇨병성 신장병증; HA - 고혈압; GIK - 사구체 염증 신장; ADPKD - 다낭성 신장 질환은 상염색체 우성 유전입니다. NS - 통계적으로 유의미한 차이가 없습니다.

풀 사이즈 테이블 연구(평균±SD)

P * - HD A, HD B, PD 및 CKD 그룹 간의 차이에 대한 통계적 유의성, 정량적 변수에 대한 TE 및 C - Kruskal Wallis ANOVA, 일원 분산 분석 또는 스튜던트 t-검정 P ** - HD A 간의 차이에 대한 통계적 유의성 , Kruskal Wallis의 ANOVA 정량 변수 또는 ANOVA 일원 분석에 대한 HD B, PD 및 CKD 및 TE 그룹 Kt/V - 투석 지수(시간 t에서 클리어런스 K에 의해 정제된 부피 분율 V) NS 통계적으로 유의미한 관계가 발견되지 않았습니다.

통계 분석 분포를 평가하기 위해 KS 테스트(Kolmogorov-Smirnov)를 사용했는데, 일부 변수(PRP에서 XD 및 XDO 이소형의 활성)의 경우 매개변수의 비정규 분포를 보여주었습니다. 정량적 데이터를 분석하기 위해 Exact Fisher 및 Chi-square 테스트가 사용되었습니다. 일변량 시스템에 대한 스튜던트 t-검정 및 ANOVA 분석을 사용하여 정규 분포를 갖는 변수의 경우 관련(쌍) 변수와 관련되지 않은(비쌍) 변수 간의 차이를 평가했습니다. 비정규 분포를 갖는 변수의 경우 Kruskal-Wallis ANOVA 분석을 수행하여 매개변수 간의 차이를 평가하고 짝을 이루지 않은 데이터에 대한 Mann-Whitney U 비모수 검정 또는 쌍을 이룬 데이터에 대한 Wilcoxon 테스트를 수행했습니다. 연구된 매개변수 간의 관계에 대한 다요인 평가를 결정하기 위해 선형 다중 회귀 모델이 사용되었습니다. 결과의 통계적 분석은 Statistica 12(StatSoft)를 사용하여 수행되었습니다.