Phellinus Vaninii의 항산화, 항멜라닌 생성 및 항주름 효과

연락처: ali.ma@wecistanche.com

1. 소개

자유 라디칼활성산소종(ROS)은 일반적으로 불안정하고 반응성이 높은 화학종입니다. 이들은 주로 호흡, 식균작용, 프로스타글란딘 합성 및 소포체 시스템의 미토콘드리아 전자 수송 시스템을 통해 인체 세포의 효소 및 비효소 대사 경로에서 파생됩니다[1]. 그러나 자유 라디칼과 ROS는 중금속, 담배 연기, 화학 물질 및 산업 오염 물질을 포함한 외인성 소스에 노출될 때도 생성됩니다[2]. 노화, 심혈관질환, 호흡기질환, 당뇨병, 류머티즘, 간질환 등 다양한 질병을 유발하는 것으로 보고되고 있다[3].

Xanthine oxidase(XO)는 hypoxanthine이 xanthine으로 산화되는 것을 촉매하고 더 나아가 xanthine을 요산으로 전환합니다. 통풍은 혈액 내 요산 농도가 상승하여 관절에 요산 결정이 침착되어 통증이 있는 염증을 유발하는 것이 특징이며 세계 인구의 5-30%가 통풍을 앓고 있으며 이는 다음과 같은 것으로 간주됩니다. 인간의 건강에 중요한 위험 요소가 됩니다[4,5]. 통풍 치료에는 일반적으로 혈장 요산 농도를 낮추는 XO 억제제가 사용됩니다[6]. XO 억제제인 ​​알로퓨리놀은 통풍 치료에 사용되어 왔지만 최근에는 새로운 XO 억제제인 ​​페북소스타트(febuxostat)가 개발되었다. 그러나 이 약은 간염, 신증, 알레르기 반응 등 많은 부작용이 있다[7]. 따라서 치료 활성이 좋고 부작용이 적은 새로운 XO 억제제에 대한 연구가 계속되고 있습니다.

Tyrosinase는 식물, 미생물 및 동물에 일반적으로 존재하는 속도 제한 구리 함유 산화 효소입니다. 티로시나제는 L-티로신이 3,{5}}디히드록시페닐알라닌(DOPA)으로 수산화되고 DOPA가 도파퀴논으로 전환되어 멜라닌 합성 경로에 관여합니다[8]. 멜라닌은 멜라노솜의 멜라닌 세포에서 생성되며 햇빛으로부터의 자외선(UV) 방사선의 유해한 영향으로부터 표피를 보호하는 데 중요한 역할을 합니다. 과도한 자외선 노출로 인한 멜라닌 합성 효소 활성 증가로 인한 피부 과색소침착은 기미, 백반증, 검버섯 등의 피부 질환을 유발할 수 있다[9,10]. 최근 티로시나제 억제제는 색소침착 문제 및 기타 멜라닌 관련 의학적 장애를 예방하는 데 중요한 역할을 하고 있습니다. 많은 여성들이 어두운 피부 패치를 밝게 하는 것을 선호하기 때문에 의료 및 화장품 산업은 피부 과색소침착을 치료하기 위해 티로시나제 억제제에 초점을 맞추었습니다[11]. 이러한 문제를 해결하기 위해 피부 미백제로 코직산(kojic acid), 알부틴(arbutin), 아젤라산(azelaic acid), 젠티스산(gentisic acid) 등 미생물과 식물에서 유래하는 유기화합물이 개발되고 있다[12]. 미백 화합물의 효능은 무세포 시스템에서 티로시나아제 억제에 의해 결정되거나 세포성 티로시나아제 억제에 의해 결정되며 식물 및 미생물의 새로운 티로신 억제제 공급원이 지속적으로 스크리닝되고 있습니다[13].

피부 노화는 생물학적으로 피할 수 없는 생물체의 과정이며 내적 요인과 외적 요인 모두에 의해 유발됩니다. 연령 의존적 노화 또는 시간적 노화라고도 불리는 내인성 피부 노화는 신체의 내부 생리적 요인에 의해 발생하는 반면, 외적 노화는 피부가 자외선에 노출, 담배 흡연, 대기 오염 등 다양한 외부 요인에 의해 발생합니다. 등. 이러한 요인은 주름, 색소 침착 및 피부 두께의 변화를 유발할 수 있습니다[14]. 피부는 표피, 진피 및 피하 조직으로 구성된 부드러운 외부 조직입니다. 피부의 가장 바깥 부분은 세포외기질(ECM)로 콜라겐과 엘라스틴으로 구성되어 있습니다. 콜라겐은 피부의 탄력, 강도 및 유연성을 제공합니다. 또한 피부의 구조적 골격을 유지하고 피부의 형태 형성에서 정상적인 세포 기능을 유지하는 중추적인 역할을 한다[16]. 엘라스틴은 ECM의 결합 조직에 존재하는 핵심 단백질이며 피부에 탄력을 제공합니다. 아연 의존성 엔도펩티다아제인 콜라게나아제는 ECM 성분, 특히 1형 콜라겐을 분해할 수 있습니다. 프로테아제 효소인 엘라스타제는 엘라스틴과 콜라겐을 분해하고 ECM의 결합 조직의 기계적 및 구조적 특성을 결정합니다[17]. 따라서 피부 처짐, 주름 등의 피부 노화를 예방하기 위한 약리학적 억제제의 개발이 요구되고 있다.

버섯은 여러 나라에서 수천 년 동안 좋은 식품 공급원이자 전통 민간 요법으로 사용되어 왔습니다. 그들의 자실체는 b-글루칸, 다당류, 폴리페놀, 플라보노이드, 테르페노이드 및 면역 자극, 항종양, 항고혈당, 항고혈당을 제공하는 기타 유기 화합물을 포함하여 의약 가치가 높은 생물학적 활성 대사 산물을 포함합니다. 콜레스테롤 혈증, 간 보호 및 염증 억제 활성 [18-20].

Phellinus vaninii는 일반적으로 'sanghuang'으로 알려져 있으며 담자균류, Aphyllophorales, Hymenochaetacae에 속하며 동아시아와 러시아에 분포한다[21]. Ph. baumi, Ph. gilvus, Ph. linteus, Ph. merrillii 및 Ph. pini를 포함하여 Phellinus 속에 속하는 여러 버섯 종은 잠재적인 의약 항산화제, 항당뇨병, 항고지혈증, 항균 및 항종양 활성 [22,23].

Ph. vaninii가 한국에서 이용 가능하게 되었지만 그 의학적 효과에 대한 보고는 소수에 불과하다[24]. 따라서 본 연구의 목적은 Ph. vaninii 자실체의 메탄올 및 온수 추출물의 항산화, 항잔틴 산화효소, 항멜라닌 생성 및 주름 개선 효과를 평가하는 것이다.

2. 재료 및 방법

2.1. 화학물질 및 시약

부틸화 히드록시톨루엔(BHT), 1,1-디페닐{2}} 피크릴-히드라지(DPPH), 디메틸 술폭시드, (DMSO) 크산틴 산화효소, 티로시나제, L-3,4-디히드록시페닐 -lalanine(DOPA), xanthine oxidase, allopurinol, kojic acid, arbutin, collagenase 및 porcine pancreatic elastase는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입했으며 기타 모든 화학 물질 및 용매는 다음 작업에 사용되었습니다. 연구 실험은 분석 등급이었습니다.

2.2. 버섯 추출물

Ph. vaninii의 자실체는 경기도농업기술원 버섯연구소에서 입수하였다. 자실체는 공기 건조(45도에서 48시간)하고 잘게 분쇄하였다. 메탄올 추출물(ME)을 제조하기 위해 80% 메탄올 400mL에 녹인 분말 20g을 25도에서 24시간 동안 오비탈 쉐이커(125rpm)에 보관했습니다. 용액을 여과지를 통해 여과하였다. 열수추출물(HE)을 얻기 위해 동량의 분말을 400mL의 탈이온수에 3시간 동안 끓인 후 여과지로 여과하였다. 그런 다음, 나머지 잔류물을 400mL의 80% 메탄올 또는 뜨거운 물로 각각 위에서 설명한 대로 두 번 추출했습니다. 그런 다음, 합한 추출물을 40도에서 증발 건조시키고, 나머지 물을 동결 건조기로 제거하였다.

시탕슈 추출물

2.3. 총 페놀 및 플라보노이드 함량

ME와 HE의 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 분석법을 약간 수정하여 결정되었습니다[25]. ME 및 HE의 1mL 분취량을 1mL의 10% Folin-Ciocalteu 용액에 첨가하였다. 용액을 와류시키고 25도에서 3분 동안 방치하였다. 그런 다음 2% 탄산나트륨 3mL(Na2CO3) 용액을 첨가하고 25℃에서 2시간 동안 유지하였다. 흡광도는 760nm에서 분광기로 측정하였다. 총 페놀 함량은 mg 갈산 당량(GAE)으로 표시되었습니다.

총 플라보노이드 함량은 약간 변형된 염화알루미늄(AlCl3) 비색 분석에 의해 측정되었습니다[26]. ME 및 HE의 분취량(1mL)을 1mL 탈이온수에 용해시켰다. 이 용액(1mL)을 95% 알코올 3.{7}}mL, 010% 염화알루미늄 0.2mL, 아세트산칼륨(1M) 0.2mL, 및 5.6mL의 탈이온수. 그 후, 반응 혼합물을 25도에서 40분 동안 인큐베이션하고, 415 nm에서 분광계로 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 mg 케르세틴 당량(QE)으로 표시되었습니다.

2.4. 세포 생존력 분석

2.4.1. 세포 배양

쥐 흑색종 B16-F10 세포주는 한국 서울에 있는 한국세포주연구재단 한국세포주은행에서 입수했습니다. 세포는 5% 대기 CO2가 있는 가습 인큐베이터에서 37도에서 10% 열 불활성화 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle's Media(DMEM)에서 배양되었습니다.

2.4.2. 세포 생존력

ME와 HE가 B{0}}F10 세포의 세포 생존력에 미치는 영향은 MTT assay로 추정하였다[27]. 세포(5 104개)를 24-웰 플레이트에서 배양하고 37도에서 24시간 동안 인큐베이션했습니다. 그런 다음, 세포를 다양한 농도의 ME 및 HE(25-750mg/mL)로 처리하고 48시간 동안 배양했습니다. 그런 다음, 각 웰에 200mL의 MTT 용액(0.5mg/mL)을 보충하고 암실에서 4시간 동안 인큐베이션했습니다. 생성된 유색 포르마잔 결정을 200mL의 DMSO에 용해시키고 마이크로플레이트 판독기로 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

2.5. 항산화 분석

2.5.1. DPPH 소거 활성

Ph. vaninii 자실체에서 ME와 HE의 라디칼 소거 효과는 약간의 변형이 있는 DPPH 분석[28]을 사용하여 결정되었습니다. 간단히 말해서, 1mL의 다양한 ME 및 HE 농도(0.125–2.0mg/mL)를 메탄올 중 1mL의 DPPH(0.1mM)와 혼합했습니다. 혼합물을 흔들고 25도에서 30분 동안 유지하였다. 흡광도는 517nm에서 분광광도계로 측정되었습니다. DPPH 라디칼 소거 효과는 다음 공식을 사용하여 계산되었습니다.

DPPH 라디칼 소거 활성 퍼센트=[ (Absc-Abss) / Absc ] × 100,

여기서 Absc는 비히클 대조군의 흡광도를 나타내고 Abss는 샘플의 흡광도를 나타냅니다. BHT는 참조 표준으로 사용되었습니다.

2.5.2. 지질 과산화 억제

Ph. vaninii 자실체에서 ME와 HE의 지질 과산화 억제 활성은 이전에 설명된 방법[29]을 약간 변형하여 평가했습니다. 간단히 말해서, 난황 균질물 250mL(증류수 중 10%), ME 및 HE 각각 50mL, 증류수 200mL를 시험관에 첨가했습니다. . 25ml의 FeSO4(0.07M)를 첨가하고 25℃에서 30분 동안 인큐베이션했습니다. 그런 다음, 1.1% 나트륨 도데실 중 750ml의 20% 아세트산(pH 3.5) 및 750ml의 0.8% 티오바르비투르산(TB) 25mL의 20% 트리클로로아세트산(TCA)과 함께 황산염(SDS)을 첨가하고 혼합물을 볼텍싱하고 100C에서 60분 동안 수조에서 인큐베이션했습니다. 25C로 냉각한 후, 3.0mL의 1- 부탄올을 각 튜브에 첨가하고 3000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 용액의 흡광도는 532 nm에서 분광 광도계로 측정되었습니다. 지질 과산화의 억제 효과는 다음 공식을 사용하여 계산되었습니다.

지질 과산화 억제(%)=[(Absc – Abss)/Absc] × 100,

여기서 Absc는 비히클 대조군의 흡광도를 나타내고 Abss는 테스트 샘플의 흡광도를 나타냅니다. BHT는 참조 표준으로 사용되었습니다.

2.5.3. 수산기 라디칼 소거 활성

Ph. vaninii 자실체에서 ME와 HE의 하이드록실 라디칼 소거 효과는 약간의 수정을 가한 공개된 방법[30]을 사용하여 측정되었습니다. 간단히 말해서, ME 및 HE의 다른 농도(0.125–2.0mg/mL)의 0.5mL를 10{ {34}}인산염 완충액(10mM, pH 7.4) 중 2.8mM {{11}데옥시리보오스 1mL, FeCl3(200μM)-EDTA(1.04μM)(1:1 v/v) 200mL, 100mL H2O2(1.0mM) 및 100mL의 아스코르브산(1.0mM). 1% TBA 1.0mL를 첨가한 후 100℃에서 20분간 배양한 후 deoxyribose 분해량을 측정하였다. 흡광도는 532nm에서 분광 광도계로 측정되었습니다. 히드록실 라디칼 소거의 억제 효과는 다음 공식을 사용하여 계산되었습니다.

수산화 라디칼 소거 ( 퍼센트 )=[(Absc – Abss) / Absc] × 100

여기서 Absc는 비히클 대조군의 흡광도를 나타내고 Abss는 테스트 샘플의 흡광도를 나타냅니다. BHT는 참조 표준으로 사용되었습니다.

2.6. 크산틴 산화효소 억제

Ph. vaninii의 자실체로부터의 ME 및 HE의 xanthine oxidase (XO) 억제 활성은 xanthine을 기질로 사용하여 약간 변형된 공개된 방법에 의해 측정되었다[31]. 다양한 농도의 ME 및 HE(0.5–8.0 mg/mL)의 1mL 분취량을 2.9mL의 인산염 완충액(pH 7.5)에 첨가하고 0 0.1mL의 크산틴 산화효소 용액({15}} 인산염 완충액 pH 7.5 중 0.1 단위/mL) 및 25C에서 15분 동안 사전 인큐베이션합니다. 그런 다음, 2mL의 기질 용액(완충액에 150mM 크산틴)을 첨가하여 반응을 시작했습니다. 혼합물을 25℃에서 30분 동안 인큐베이션하고 1mL 1N HCl을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 흡광도는 290nm에서 분광광도계로 측정하였다. 알로퓨리놀은 참조 표준으로 사용되었습니다. 크산틴 산화효소 억제는 다음 공식을 사용하여 계산되었습니다:

크산틴 산화효소 억제(%)=[(A–B)–(C–D) / (A–B) ] × 100,

여기서 A는 추출물이 없는 효소 활성이고, B는 추출물과 효소가 없는 A의 대조군입니다. C는 XO가 있는 추출물의 활성이고, D는 XO가 없는 추출물의 활성입니다.

2.7. 항 멜라닌 생성 효과

2.7.1. tyrosinase의 시험관내 억제

버섯 추출물의 티로시나제 억제 활성은 약간의 수정을 가하여 공개된 방법[32]을 사용하여 결정되었습니다. 간단히 말해서, 반응 혼합물은 40mL의 티로시나제(31단위/mL)를 다양한 농도의 ME 및 HE(0) 40mL에 첨가하여 제조했습니다. 125–2.0mg/mL), 40mL의 1.5mM L-티로신 및 80mL의 0.1M 인산 완충액(pH 6.8). 그 다음, 혼합물을 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 흡광도는 475nm에서 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다. 티로시나제 억제는 다음 공식을 사용하여 계산되었습니다.

티로시나아제 억제( 퍼센트 )=[(Absc – Abss) / Absc] × 100,

여기서 Absc는 비히클 대조군의 흡광도를 나타내고 Abss는 테스트 샘플의 흡광도를 나타냅니다. BHT는 참조 표준으로 사용되었습니다.

Cistanche는 티로시나제 억제제입니다.

2.7.2. DOPA 자가산화의 시험관내 억제

버섯 추출물의 L-DOPA 자동 산화 억제 활성은 약간 변형된 방법을 사용하여 결정되었습니다[33]. 간단히 말해서, 반응 혼합물은 40mL의 티로시나제(31단위/mL)를 다양한 농도의 ME 및 HE(0.125– 2.0 mg/mL), 37 C에서 10분 동안 사전 인큐베이션한 다음, 40mL의 2.5mM L-DOPA 용액(인산염 완충액 중) 및 80mL의 인산염 완충액(0.1M, pH)을 첨가하여 반응을 시작했습니다. 6.8) 암실에서 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 흡광도는 475nm에서 마이크로플레이트 판독기로 측정되었습니다. L-DOPA 자동 산화 억제의 백분율은 다음 공식을 사용하여 계산되었습니다.

DOPA 자동 산화 억제(%)=[(Absc – Abss)/Absc] × 100,

여기서 Absc는 비히클 대조군의 흡광도를 나타내고 Abss는 테스트 샘플의 흡광도를 나타냅니다. Kojic acid를 참조 표준으로 사용했습니다.

2.7.3. 세포성 티로시나아제 활성

B{0}}F10 세포의 세포성 티로시나제 활성은 공개된 방법을 약간 수정하여 측정했습니다[34]. 세포(5 105 cells/well)를 96-웰 플레이트에서 배양했습니다. 다양한 농도의 샘플(25~500mg/mL)을 24시간 동안 처리한 후 흑색종 세포를 PBS로 세척하고 1% Triton X{16}}를 포함하는 0.1M 인산 완충액(pH 6.8)으로 용해했습니다. 세포를 10분 동안 얼음에 보관하고 용해물을 10분 동안 10g에서 원심분리했습니다. 그런 다음, 상층액의 단백질 함량은 BSA(소 혈청 알부민)를 표준으로 하여 Braford 방법으로 결정되었습니다. 티로시나아제 활성을 측정하기 위해 100mL의 세포 용해물 용액과 100mL의 2.5mM L-DOPA(동일한 인산 완충액 내)를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가했습니다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 흡광도를 마이크로플레이트 리더를 사용하여 475nm에서 측정하였다. 세포 티로시나제 활성은 다음 공식을 사용하여 계산되었습니다.

세포 티로시나제 활성(%) =(Abss/Absc) × 100,

여기서 Abss는 샘플의 흡광도를 나타내고 Absc는 대조군의 흡광도를 나타냅니다. 알부틴을 참조 표준으로 사용했습니다.

2.7.4. 세포 멜라닌 합성

다양한 농도의 버섯 추출물로 처리한 B{0}}F10 흑색종 세포의 멜라닌 함량 측정은 Hosoi et al.에서 발표한 방법을 사용하여 수행되었습니다. [35]. 세포(4 × 104 cells/well)는 DMEM의 96-well plate에서 배양되었습니다. 24시간의 배양 후, 세포는 0.4mM 멜라닌 세포 자극 호르몬(MSH)을 함유하는 ME 및 HE(25-500mg/mL)로 72시간 동안 처리되었습니다. 300mL의 Triton 100(1%, PBS)을 첨가하여 세포를 수확하고, 3000rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 그런 다음, 100mL의 1N NaOH와 200mL의 DMSO(10%)를 세포 펠렛에 첨가하고 60℃에서 1시간 동안 유지했습니다. 용액의 흡광도는 405nm에서 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정했습니다. ME와 HE가 멜라닌 합성에 미치는 영향을 확인했습니다. 알부틴을 참조 표준으로 사용했습니다.

Cistanche는 멜라닌을 억제합니다.

2.8. 주름 개선 효과

2.8.1. 엘라스타제 억제

ME와 HE의 엘라스타제 억제 효과는 이전에 보고된 방법으로 평가되었습니다[36]. 돼지 췌장 엘라스타제(PE–EC. 3.4.21.36)를 멸균수에 용해하여 3.33mg/mL 스톡 용액을 만들었습니다. 기질인 N-숙시닐-Ala-Ala-Ala-p-니트로아닐리드(AAAPVN)는 0.2M Tris-HCl 완충액(pH 8.{17}})에 용해되었습니다. 반응은 96-웰 마이크로플레이트에서 수행되었습니다. 각 웰에는 0.2M Tris-HCl 완충액 12{21}mL, Tris-HCl 완충액 중 버섯 추출물 5{28}}mL(0.125–2.0 mg/mL), 30 PE의 mL 및 1.6 mM AAAPVN의 50 mL. 시험 추출물을 기질을 첨가하기 전에 15분 동안 25℃에서 사전 인큐베이션하였다. 흡광도는 402nm에서 마이크로플레이트 리더로 측정하였다. 에스테라제의 억제율은 다음과 같이 계산되었습니다.

에스테라제 억제(퍼센트)=[(Absc – Abss)/Absc] × 100,

여기서 Absc는 비히클 대조군의 흡광도를 나타내고 Abss는 테스트 샘플의 흡광도를 나타냅니다. EGCG를 참조 표준으로 사용하고 증류수를 음성 대조군으로 사용했습니다.

2.8.2. 콜라게나제 억제

Ph. vaninii 자실체에서 ME와 HE의 콜라게나제 억제 효과는 이전에 보고된 방법[37]을 일부 수정하여 조사했습니다. Clostridium histolyticum의 Collagenase(ChC–EC.3.4.23.3)는 5{22}}mM의 1.44U/mL Tricine 완충액(pH 7.8)에 용해되었습니다. 기질인 4-페닐아조벤질옥시카르보닐-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg 트리플루오로아세테이트 염(PZ-펩티드)을 2.5mM 트리신 완충액에 용해시켰다. 25 마이크로리터의 버섯 추출물(0.125 ~ 2.0 mg/mL)을 50mL의 PZ-펩티드를 추가하기 전에 37C에서 15분 동안 155mL의 완충액에서 20mL의 효소와 함께 배양하여 37℃에서 60분 동안 반응시켰다. 1mL의 시트르산(3%)을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 그런 다음 에틸 아세테이트 5mL를 첨가하고 용액을 세게 흔든 후 10분 동안 방치하였다. 상층액의 흡광도는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 320nm에서 측정하였다. EGCG를 참조 표준으로 사용했습니다. 콜라게나아제의 억제는 다음 공식을 사용하여 계산되었습니다.

콜라게나제 억제(백분율)=[(Absc – Abss)/Absc] × 100,

여기서 Absc는 비히클 대조군의 흡광도를 나타내고 Abss는 테스트 샘플의 흡광도를 나타냅니다. EGCG를 참조 표준으로 사용했습니다.

2.9. 통계 분석

모든 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 표현되었으며 통계 분석에는 SPSS V.13(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)이 사용되었습니다. 일원 분산 분석에 이어 Duncan의 다중 범위 검정을 사용하여 그룹 간의 평균을 비교했습니다. 5%에서 평균 간의 차이(p<.05) level="" were="" considered="" statistically="">

3. 결과 및 논의

3.1. 총 페놀류 및 플라보노이드 함량

ME 및 HE의 총 페놀 및 플라보노이드 함량은 표 1에 제시되어 있습니다. 그 결과 ME의 총 페놀 및 플라보노이드 함량은 각각 31.67 mg GAE/g 및 6.83 mg QE/g인 반면 HE의 총 페놀 및 플라보노이드 함량은 16.33 mg GAE/g 및 4.50mg QE/g. Vamanu와 Nita[38]는 Boletus edulis 자실체의 메탄올과 온수 추출물의 총 페놀 함량은 각각 18.96 mg GAE/g 및 17.22 mg GAE/g인 반면 Boletus aestivalis의 메탄올 추출물의 플라보노이드 함량은 Leccinum carpini 자실체는 각각 1.53mg CE/g 및 1.48mg CE/g이었습니다[39]. 우리의 결과는 버섯 추출물의 총 페놀 및 플라보노이드 함량이 위에서 언급한 버섯보다 높았으며 항산화 관련 anti-xanthine oxidase, anti-melanogenic 및 skin anti - 주름 활동.

3.2. 세포 생존력

Ph. vaninii 자실체의 추출물이 B{0}} F10 쥐 흑색종 세포에 대한 세포독성 효과를 나타내는지 확인하기 위해 세포를 다양한 농도의 ME 및 HE로 72시간 동안 처리하고 MTT로 세포 생존율을 결정했습니다. 시험. ME 및 HE 처리된 세포의 세포 생존율은 50~750mg/mL에서 각각 99.74~85.33% 및 100.67~88.33% 범위였습니다(그림 1). 세포 생존율은 버섯 추출물의 농도가 증가함에 따라 감소했습니다. 500mg/mL ME 및 HE 처리된 세포의 생존율은 각각 90.33% 및 91% 이상이었고 ME 및 HE의 IC50 값은 각각 4,410mg/mL 및 5,385mg/mL이므로 ME 및 HE는 그렇지 않았습니다. 테스트된 농도에서 B{25}}F10 흑색종 세포에 대한 세포독성. 따라서 다양한 농도의 버섯 추출물을 처리한 B{28}}F10 흑색종 세포의 세포 티로시나제 및 멜라닌 합성 활성을 수행하였다.

3.3. 항산화 활성

3.3.1. DPPH 라디칼 소거 효과

DPPH 라디칼 소거효과는 추출물 농도가 증가함에 따라 증가하였다. {{0}}.125–2.{17}} mg/mL에서 ME 및 HE의 라디칼 소거 활성은 각각 75.83%에서 95.17% 및 73.33%에서 94.33% 범위였으며 BHT , 양성 대조군은 우수한 소거 활성을 나타냈다(96.19-96.97%)(그림 2(A)). ME 및 HE의 DPPH 소거 활성은 0.125 ~ 0.5 mg/mL 범위의 농도에서 BHT보다 낮았지만 ME 및 HE에서 관찰된 억제 백분율은 1입니다.{{ 24}}–2.0 mg/mL는 BHT에 비해 통계적으로 유의하지 않았습니다. 이러한 결과는 메탄올과 뜨거운 물 추출물이 테스트된 더 높은 농도에서 좋은 라디칼 소거 활성을 가지고 있음을 시사합니다.

Pleurotus pulmonarius 자실체의 메탄올 추출물의 DPPH 소거 활성은 0.125~2.0mg/mL[4{17}}]에서 25.67~92.73% 범위로 보고되었습니다. . Mau et al. [41]은 Tricholoma giganteum, Grifola frondosa 및 Hericium erinaceus 버섯의 메탄올 추출물의 라디칼 소거 효과가 6.4mg/mL 농도에서 63.2%에서 67.8% 범위임을 발견했습니다. 따라서 우리의 실험 결과는 Ph. vaninii 자실체에서 ME 및 HE의 DPPH 소거 활성(0.125–2.0 mg/mL)이 자유 라디칼 및 ROS 손상으로부터 적절한 방어를 제공할 수 있음을 시사합니다.

그림 2.자실체의 메탄올과 열수추출물의 항산화 활성펠리누스 바니니.

3.3.2. 지질 과산화 억제

P. vaninii의 자실체에서 ME 및 HE의 지질 과산화 억제 활성은 {{1{{16}에서 44.99~66.{8}}8% 및 41.26~64.00% 범위였습니다. }}}.125-2.0mg/mL(그림 2(B))는 버섯 추출물의 농도가 증가하면 지질 과산화 억제가 증가함을 나타냅니다. 그러나 BHT의 지질 과산화 억제 효과는 2.0mg/mL에서 90.30%로 유의하게 높았다(p).<.001) than="" those="" of="" me="" and="" he.="" the="" ic50="" values="" of="" me="" against="" lipid="" peroxidation="" from="" wild="" and="" cultivated="" mushrooms="" including="" pleurotus="" ostreatus,="" termitomyces="" robustus,="" pleurotus="" sajor-caju,="" and="" auricularia="" auricula="" were="" 0.15,="" 0.43,="" 0.75,="" and="" 1.51mg/ml,="" respectively="" [42].="" the="" inhibi-="" tory="" effects="" of="" hot="" water="" extracts="" on="" lipid="" peroxida-="" tion="" of="" 14="" different="" edible="" and="" medicinal="" mushroom="" species="" collected="" from="" malaysia="" ranged="" from="" 33.33%="" to="" 57.18%="" at="" the="" concentration="" of="" 10="" mg/ml="" [43].="" in="" this="" study,="" the="" lipid="" peroxidation="" inhibitory="" activity="" of="" me="" and="" he="" from="" ph.="" vaninii="" ranged="" from="" 65.87%="" to="" 78%="" at="" 2.0mg/ml="" and="" their="" ic50="" values="" were="" 0.19="" mg/ml="" and="" 0.17="" mg/ml,="" respectively.="" these="" results="" suggest="" that="" me="" and="" he="" from="" ph.="" vaninii="" fruiting="" bodies="" possessed="" good="" inhibitory="" activity="" toward="" lipid="" peroxidation="" compared="" to="" the="" mushrooms="" described="" above.="" therefore,="" p.="" vaninii="" fruiting="" bodies="" could="" be="" a="" valuable="" antioxidant="">

3.3.3. 수산기 라디칼 소거 효과

Ph. vaninii의 ME 및 HE의 수산기 라디칼 소거 효과는 0.125~2.{19}} mg/mL 농도에서 75.60~98.19% 및 65.21~97.55% 범위였습니다. BHT의 비율은 각각 79.89%에서 92.66% 사이였습니다(그림 2(C)). 그러나 Ph. vaninii의 ME 및 HE의 IC50 값은 각각 0.115 mg/mL 및 0.119인 반면 IC5{{4{{46} }}} BHT의 값은 0.111mg/mL로 ME와 HE의 수산기 라디칼 소거 효과가 BHT보다 약간 낮았다. 따라서, Ph. vaninii의 ME 및 HE는 시험된 농도에서 비교적 우수하고 필적할만한 히드록실 라디칼 소거 활성을 가졌다. 이 실험에서 ME와 HE에서 더 높은 수산기 라디칼 소거 활성이 발견됨은 추출물이 시험 용액에서 수산기를 제거하여 2-데옥시리보스의 분해를 효과적으로 방지함을 나타냅니다. Pleurotus pulmonarius의 자실체에서 추출한 메탄올 추출물은 2.0mg/mL에서 95.13%의 수산기 라디칼 소거 효과가 있는 것으로 보고되었습니다[40], 이는 Ph의 ME(98.18%) 및 HE(97.55%)보다 낮습니다. 시험된 농도에서의 바니니. Hypsizigus ulmarius 버섯의 자실체에서 추출한 메탄올 추출물의 수산기 소거 효과는 1.0mg/mL에서 76.67%로 보고된 반면[44] ME와 HE는 83.{43}}%와 77.17%로 보고되었습니다. 0.25mg/mL. 종합하면, 우리의 결과는 Ph. vaninii에서 ME와 HE의 하이드록실 라디칼 소거 효과가 위에서 언급한 버섯 추출물보다 더 우수함을 시사합니다. 따라서 Ph. vaninii의 ME 및 HE는 ROS 관련 문제를 예방하는 데 사용할 수 있는 강력한 하이드록실 라디칼 제거제입니다.

3.4. 크산틴 산화효소 억제

Ph. vaninii의 ME와 HE의 xanthine oxidase 저해 활성은 농도가 증가함에 따라 증가하였다. {{0}}.5 ~ 8.{27}}mg/mL에서 ME와 HE의 xanthine oxidase 억제는 각각 61.15%에서 88.99%, 34.13%에서 84.56% 범위였습니다. 그러나 참조 표준물질인 알로퓨리놀은 테스트한 동일한 농도에서 89.73~97.23%의 우수한 XO 억제 활성을 나타냈습니다(그림 3). ME와 HE는 낮은 농도에서 중간 정도의 XO 억제 활성을 나타내었지만 버섯 추출물은 더 높은 농도에서 XO를 유의하게 억제했습니다. Ph. gilvus 자실체의 메탄올 및 온수 추출물에 의한 XO 억제는 0.5~8.0mg에서 28.60%에서 86.20% 및 36.53%에서 97.07% 범위로 보고되었습니다. /mL 각각 [45], XO에 대한 ME 및 HE의 억제 효과가 Ph. gilvus의 억제 효과와 유사함을 나타냅니다.

폴리페놀계 화합물의 한 종류인 플라보노이드는 식물과 균류의 가장 흔한 2차 대사산물로서 크산틴 산화효소 억제 활성을 갖는 것으로 보고되었다[46]. 따라서 ME 및 HE에서 검출된 더 높은 페놀 및 플라보노이드 농도는 크산틴 산화효소의 억제에 기여했을 수 있습니다.

3.5. 피부 미백 효과

3.5.1. 시험관내 티로시나제 억제

Ph. vaninii의 자실체로부터의 ME 및 HE의 티로시나아제 억제 활성은 0.125–2에서 55.83%에서 96.16%, 30.29%에서 92.74% 범위였습니다.{{ 17}} mg/mL, 각각(도 4(A)), 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 그러나 참조 표준인 kojic acid는 {{2{{30}}}}.125–2.0mg/mL에서 98.74~99.61%의 우수한 tyrosinase 저해 활성을 보였습니다. 결과는 ME가 좋은 효과를 나타내는 반면 HE는 테스트된 농도에서 중간 효과를 나타냄을 시사합니다. Alamet al. [47]은 P. 살모네오스트라미네우스의 자실체에서 추출한 메탄올과 뜨거운 물 추출물에 의한 티로시나아제 억제율이 0.125-1.0mg/mL에서 각각 20.90~63.29%, 15.25~49.25%라고 보고했다. tyrosinase에 대한 Ph. vaninii의 활성은 P. 살모네오스트라미네우스 자실체의 활성보다 높았다.

페놀 화합물은 페놀 고리와 카르복실산을 포함하는 방향족 산 화합물입니다. 플라보노이드는 폴리페놀 화합물 그룹입니다. 그들은 많은 식물과 버섯 종에서 발견됩니다. 폴리페놀은 티로시나아제의 기질로 간주되며 티로시나아제 억제제의 가장 큰 그룹입니다. 여러 폴리페놀이 티로시나제 효소의 활성 부위에 결합하여 티로시나제를 억제하여 기질과 같은 상호작용에 의해 효소를 비가역적으로 비활성화시키는 것으로 보고되었습니다[48]. 일부 플라보노이드는 또한 티로시나제에서 구리 이온의 킬레이트화에 의해 티로시나제에 대한 억제 효과를 입증했습니다[49].

따라서 tyrosinase에 대한 ME와 HE의 억제 효과는 버섯 추출물에 존재하는 폴리페놀 화합물과 플라보노이드 때문일 수 있습니다. ME 및 HE의 항산화 효과는 또한 티로시나제 활성 억제에 기여할 수 있습니다.

3.5.2. DOPA 자가산화 억제

L-DOPA는 멜라닌 생성 동안 멜라닌의 전구체 중 하나입니다. L-DOPA는 티로시나제 수산화효소에 의해 L-티로신으로부터 합성됩니다. 티로시나아제는 또한 L-DOPA를 도파퀴논으로 전환시켜 결국 멜라닌을 생성할 수 있습니다. P. vaninii의 시험관 내 L-DOPA 자동 산화 억제 활성은 그림 4(B)에 요약되어 있습니다. ME와 HE에 의한 L-DOPA 자동 산화 억제는 0.125~2.{22}}mg/mL에서 각각 38.25%~78.46% 및 29.68%~44.77% 범위였습니다. kojic acid는 테스트된 농도에서 86.14 ~ 98.72%의 탁월한 L-DOPA 억제 활성을 나타냈습니다. 결과는 ME와 HE가 L-DOPA 자가산화를 적당히 억제함을 보여주었다. 그러나 ME와 HE는 L-tyrosinase를 tyrosinase의 기질로 사용한 경우보다 L-DOPA를 기질로 사용한 경우 L-DOPA의 자가산화 억제 활성이 더 낮았다. tyrosinase는 tyrosine hydroxylase와 L-DOPA oxidase에 대해 두 개의 다른 결합 부위를 사용하기 때문에 우리의 실험 결과는 멜라닌 생성 동안 두 개의 다른 기질에 대한 티로시나제의 선택적 효과를 시사합니다.

3.5.3. 세포성 티로시나아제 활성

세포내 티로시나제 활성은 Ph. vaninii의 자실체에서 다양한 농도의 ME 및 HE로 세포를 처리한 후 결정되었습니다. B{0}} 흑색종 세포의 티로시나제 활성에 대한 ME 및 HE의 효과 범위는 25-500ug/mL에서 각각 96.94%~61.14% 및 98.12%~84.16%인 반면, 알부틴은 다음의 티로시나제 활성을 나타냈습니다. 시험된 농도에서 98.52 ~ 58.12%(그림 5(A))로 알부틴의 티로시나제 억제가 ME 및 HE보다 높음을 나타냅니다. 결과는 또한 ME의 tyrosinase 활성이 H보다 높았고 ME와 HE의 농도가 증가하면 세포 내 tyrosinase 활성이 감소한다는 것을 보여주었습니다. 500ug/mL에서 ME 및 HE의 시험관 내 티로시나제 억제 효과는 각각 84.39% 및 45.64%였지만 B16-F10 흑색종 세포에서 세포성 티로시나제 억제는 38.{25}}% 및 15.24%, 동일한 농도에서 각각 시험한 결과, tyrosinase 억제를 담당하는 버섯 추출물 인자가 세포에 효과적으로 침투할 수 없음을 나타냅니다. Huang et al. [50]은 Agaricus brasiliensis의 자실체에서 추출한 메탄올 추출물의 세포성 티로시나제 활성이 B16-}흑색종 세포에서 100–500 ug/mL에서 95.75% –67.12%라고 보고하여 세포성 티로시나제 활성을 시사합니다. Ph. vaninii의 균은 시험된 동일한 농도에서 A. brasiliensis보다 약간 높았다.

B{0}}F10 흑색종 세포에서 관찰된 세포 내 티로시나제 활성 감소 및 멜라닌 생성 감소가 버섯 추출물의 세포독성 때문인지 평가하기 위해 MTT 분석을 수행했습니다. MTT assay에서 ME와 HE를 처리한 B{2}}F10 흑색종 세포는 50~500mg/mL에서 각각 105~90.33%, 107~91%의 세포 생존율을 나타내어 버섯 추출물이 테스트된 농도에서 B{11}F10 흑색종 세포에 독성이 없었습니다(그림 1).

3.5.4. 멜라닌 합성 활성

B16-F10 흑색종 세포의 멜라닌 합성 억제와 이전 실험에서 검출된 우수한 세포성 티로시나제 억제 활성이 관련이 있는지 확인하기 위해 흑색종 세포에 의한 멜라닌 생성을 추가로 조사하였다. ME 및 HE로 처리된 B{4}}F1{36}} 흑색종 세포의 멜라닌 합성은 25-500 mg/mL에서 각각 71.18%에서 27.61% 및 78.54%에서 50.53% 범위였습니다. 알부틴에 의한 멜라닌 합성은 테스트된 농도에서 73.50%에서 35.16% 범위였습니다(그림 5(B)). 연구 결과에 따르면 알부틴에 의한 멜라닌 합성 억제는 HE보다 높지만 ME보다 낮았다. 버섯 추출물의 농도가 증가하면 B{23}}흑색종 세포에서 멜라닌 합성이 감소했습니다. 그 결과 ME에 의한 B{25}}F10 흑색종 세포의 멜라닌 합성 억제는 arbutin보다 유의하게 높았지만 HE에 의한 멜라닌 생성 억제는 arbutin보다 유의하게 낮았다. Cha and Kim[51]은 동충하초 발효 추출물이 B{37}}F10 흑색종 세포에서 1.0–3.0 mg/mL에서 66–47%의 멜라닌 합성 활성을 나타냄을 보여 멜라닌 합성 억제 활성을 시사했습니다. Ph. vaninii의 자실체 추출물의 함량이 동충하초의 발효 추출물보다 높았다. 따라서 연구 결과는 버섯 추출물이 시험관 내 티로시나아제 활성과 L-DOPA 자가 산화를 억제할 뿐만 아니라 B{44}} 흑색종 세포에서 티로시나아제 활성과 멜라닌 생성을 감소시키는 것으로 나타났습니다. 종합하면, 우리의 연구 결과는 Ph. vaninii 자실체의 ME와 HE가 햇빛의 자외선으로 인한 피부 색소 침착에 대한 보호의 잠재적인 새로운 항멜라제겐 공급원으로 간주될 수 있음을 시사합니다.

3.6. 피부 주름 개선 작용

3.6.1. 엘라스타제 억제

프로테아제인 엘라스타제는 ECM에서 발견되는 엘라스틴의 분해를 담당합니다.

엘라스타제는 엘라스틴뿐만 아니라 콜라겐, 피브로넥틴 및 ECM 단백질과 같은 기타 기질을 절단할 수 있습니다. 그러나 자연적 조건하에서 엘라스타제 활성은 상처 후 외래 단백질의 분해에 필수적이다[52]. 주름, 처짐, 주근깨 등 피부 노화를 지연시키기 위해서는 ECM 관련 단백질의 분해를 막아 피부 탄력 저하를 막아야 한다. Ph. vaninii의 자실체에서 ME 및 HE의 에스테라제 억제율은 0.125–2.{17}}mg/mL에서 37.23%에서 71.24%, 28.99%에서 64.65% 범위였습니다. 반면 EGCG는 테스트된 농도에서 17.93~45.31%의 에스테라제 억제를 나타냈습니다(그림 6(A)). ME 및 HE의 엘라스타제 억제율은 EGCG에 비해 우수한 것으로 간주될 수 있습니다. Kim et al. [53]은 송이버섯 균사체 추출물이 1{39}}0mg/mL에서 81.4%의 엘라스타제 억제 활성을 보였다고 보고했으며, 이는 Ph. vaninii의 ME 및 HE의 억제 효과를 나타냅니다. elastase는 T. matstake 추출물보다 낮았다. Choi and Lee [54]는 1.0 ~ 3.0mg/mL에서 21.5%에서 35.47%, 17.57%에서 25.{37}}% 범위의 Coriolus versis-color 자실체의 메탄올 및 온수 추출물에 의한 엘라스타제 억제를 보여주었습니다. , 각각 ME 및 HE의 엘라스타제 억제가 C. versis-color 자실체보다 높음을 시사한다. 결과는 버섯 추출물이 엘라스틴과 콜라겐 분해를 방지하는 주름 개선 잠재력을 가지고 있음을 시사합니다.

3.6.2. 콜라게나제 억제

콜라게나아제는 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 젤라틴 및 라미닌과 같은 세포 및 ECM 내에서 발견되는 다양한 분자를 절단할 수 있는 금속단백분해효소입니다. 이 실험에 사용된 콜라게나제인 박테리아 콜라게나제(Clostridium histolyticum, ChC)도 ECM을 분해합니다[55]. 따라서 세균성 콜라게나아제를 이용하여 버섯 추출물의 항콜라게나아제 활성을 시험하였다. Ph. vaninii의 자실체에서 ME 및 HE의 콜라게나제 억제 활성은 41.{13}}4%에서 63.{16}}2% 및 26.40%에서 47.33 사이였습니다. 퍼센트는 각각 0.125–2.0 mg/mL에서(그림 6(B)), EGCG는 테스트된 농도에서 콜라게나제 17.93에서 45.31퍼센트를 억제했습니다. 결과는 ME가 우수한 억제제인 ​​반면, HE는 시험된 농도에서 중간 정도의 억제 효과를 나타냈다는 것을 시사한다. Chenet al. [56]은 Phellinus linteus의 자실체에서 추출한 에탄올과 뜨거운 물 추출물에 의한 콜라게나아제 억제가 0.05-1.0 mg/mL에서 각각 3.4~6.8%, 33.4~89.6% 범위에 있다고 보고했는데, 이는 Ph. vaninii의 ME는 Ph. linteus 자실체의 열수 추출물보다 높았습니다. ME와 HE는 콜라게나아제의 우수한 억제를 나타내므로 추출물은 ECM과 콜라겐을 광노화로 인한 분해로부터 보호할 수 있습니다. 백차, 녹차, 뽕나무 껍질, 은행 등의 식물에서 대부분의 엘라스타제 및 콜라게나제 억제 활성이 입증되었지만[57,58], 자실체 추출물에서 엘라스타제 및 콜라게나제 억제 활성이 보고된 것은 이번이 처음이다. Ph. vaninii에서 유래되었으며 새로운 주름 방지제 공급원일 수 있습니다.

결론적으로 바니니의 자실체 추출물은 우수한 항산화 활성, 항잔틴 산화효소, 티로시나아제, 멜라닌 합성, 엘라스타아제 및 콜라게나아제 억제 활성을 나타냈다. xanthine oxidase, tyrosinase 및 melanin 합성 억제 활성은 통풍 및 피부 색소 침착을 조절하기 위한 천연 공급원으로 사용될 수 있으며 엘라스타제 및 콜라게나아제의 억제는 피부 주름 관련 장애 치료에 좋은 공급원이 될 수 있습니다. Ph. vaninii 자실체 추출물에서 항잔틴 산화효소, 항티로시나제 및 주름개선 활성을 제공하는 인자를 결정하기 위해서는 추가 연구가 필요하다.

Cistanche는 피부 미백 성분입니다.

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