아드레날린성 차단제인 Carvedilol은 인간 멜라닌 세포 및 Ex Vivo 인간 피부 배양에서 CAMP/CREB 신호 전달 경로를 억제하여 멜라닌 합성을 억제합니다
Mar 20, 2022
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최명은1,†,유한주1,2,†,이하리2,3,문익준1,이우진1,송영섭3,*,‡, 장성은1
추상적인:카테콜아민은 G 단백질 결합 수용체를 통해 기능하여 다양한 세포에서 30, 50-환형 아데노신 모노포스페이트(cAMP)의 세포내 수준 증가를 유발합니다. 카테콜아민 생합성과 α-아드레날린 수용체는멜라닌 세포; 따라서 카테콜아민은 피부 색소 침착에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 그러나 비인간 피부의 멜라닌 생성을 매개하는 이들의 작용 및 기전은 아직 조사되지 않았다. 따라서 우리는 약한 1-차단 활성을 갖는 비선택적 차단제인 카베딜롤의 잠재적인 항멜라닌 생성 효과를 조사했습니다. Carvedilol은 정상 인간의 세포 생존 능력을 손상시키지 않으면서 멜라닌 함량과 세포 티로시나제 활성을 감소시켰습니다.멜라닌 세포뿐만 아니라 Mel-Ab 불멸화 마우스 멜라닌 세포에서. 카르베딜롤 하향조절된 소안구증 관련 전사 인자(MITF), 티로시나제, 티로시나제 관련 단백질(TRP)-1 및 TRP-2. Carvedilol 치료는 인광체-cAMPresponse element-binding protein(CREB)의 하향 조절로 이어졌습니다. 더욱이, forskolin 치료 시 cAMP 수치의 증가는 carvediol의 항멜라닌 생성 작용을 역전시켰습니다. 또한, 카베딜롤은 자외선을 조사한 인간 피부 배양에서 멜라닌 지수를 현저하게 감소시켰습니다. 종합하면, 우리의 결과는 카베딜롤이 인간의 멜라닌 생성을 효과적으로 억제한다는 것을 나타냅니다.멜라닌 세포및 cAMP/단백질 키나제 A/CREB 신호전달을 억제함으로써 생체외 인간 피부. 카르베딜롤의 멜라닌 생성 억제 효과는 피부에 잠재적으로 중요합니다.희게 함자치령 대표.
키워드:카르베딜롤; 아드레날린성 차단제;멜라닌 합성; cAMP/CREB 신호
1. 소개
광범위한 색소성 피부 질환은 환자에게 상당한 심리적, 사회적 영향을 미칩니다. 전신 및 국소 제제와 레이저 요법을 포함한 다양한 치료 양식이 개발되었습니다[1-3]. 그러나 그 결과는 종종 불만족스럽고 치료로 인한 염증 후 과색소침착(PIH) 및 저색소침착과 같은 부작용이 흔하다. 또한 치료에 비용과 시간이 많이 소요된다[4-6].
도파민, 에피네프린 및 노르에피네프린을 포함하는 카테콜라민은 신경 전달 물질 및 내분비 호르몬으로 작용하는 신호 분자입니다. 피부에서 카테콜아민의 생합성과 분해는 인간 케라티노사이트에서 일어나지만, 카테콜라민 합성은 멜라닌 세포에서 다소 다르다[7-9]. 카테콜아민은 G 단백질 결합 수용체(GPCR)를 통해 기능합니다. GPCR에 대한 카테콜아민의 결합은 ATP로부터 30개의 50-사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cAMP)를 합성하는 세포내 아데닐레이트사이클라제의 활성화를 유발합니다[10]. 두 번째 메신저 cAMP는 단백질 키나아제 A(PKA)의 R-서브유닛을 결합하여 활성을 발휘하여 cAMP 반응 요소 결합 단백질(CREB)의 인산화를 초래합니다. GPCR은 글루카곤, 부갑상선 호르몬, 세크레틴, 칼시토닌을 포함한 아민과 펩타이드에 의해 활성화됩니다[10].
아드레날린성 수용체 길항제는 -수용체 및 -수용체 길항제를 포함한다. -수용기 길항제는 비선택적, 1-선택적 및 2-선택적 제제로 하위 분류되는 반면 -수용기 길항제는 비선택적, 1-선택적 및 2-선택적 제제로 하위 분류됩니다. 에이전트의 선택적 차단 활동을 기반으로 합니다. 프로프라놀롤, 티몰롤, 나돌롤과 같은 1세대 비선택적 수용체 길항제와 달리 카베딜롤은 1-아드레날린 수용체({17}}AR)를 차단하여 혈관 확장 작용을 나타내는 3세대 비선택적 -차단제입니다. [11]. 따라서 카르베딜롤은 1-차단 활성이 약한 비선택적 차단제입니다[12]. 다른 차단제와 유사하게 고혈압과 울혈성 심장병을 조절하는 경구용 약물로 주로 사용된다[12]. 그러나 3세대 차단제는 혈관신생, 항산화, 항증식, 항비대 및 항세포자멸사 활성을 나타내므로 더 많은 해명이 필요합니다[11]. 피부과 분야에서 카베딜롤은 항산화 및 항염 작용으로 인해 종종 홍반 모세혈관확장성 주사비를 치료하기 위해 경구 제형으로 사용된다[13,14]. 또한, 카베딜롤의 항산화 활성은 자외선(UV)에 의한 피부 발암을 예방하여 자외선 관련 피부 질환을 관리하는 매력적인 약제가 됩니다[15-18]. 그러나 카베딜로라의 화학 예방 효과는 AR을 통해 직접 매개되지 않습니다. 정확한 기전은 비교적 알려지지 않았지만 cAMP/PKA 및 PKC-δ 신호전달 경로는 카베딜롤의 피부 전이 특성과 관련이 있을 수 있습니다.
색소침착 연구의 초기 단계에서 인간은멜라닌 세포노르에피네프린으로 세포외 유도 후 -1-AR 신호전달을 발현하는 것으로 밝혀졌습니다. 그러나 -AR은 아드레날린 신호로 자극한 후 발견되지 않았습니다.멜라닌 세포[8]. 반대로, Cillbro et al. 나중에 특정 기능적 2-AR 신호가 인간 멜라닌 세포에 존재하고 2-ARstimulation이 2-AR/cAMP 경로를 통해 색소 침착으로 이어진다는 것을 입증했습니다[7]. 따라서 catecholamine의 색소침착 조절의 역할이 제시되었으며 cAMP는 멜라닌 생성의 catecholamine 조절의 주축으로 여겨진다.
멜라닌 생성은 수많은 경로를 포함하는 복잡한 과정입니다. Tyrosinase, tyrosinase-related protein 1(TRP-1) 및 TRP-2(도파크롬 토토머라제(DCT)라고도 함)는멜라닌 합성[21]. 멜라닌 생성은 호르몬, 사이토카인, 신경전달물질, 성장인자, 미세분자를 포함한 수많은 요인에 의해 유도되거나 억제됩니다[21-23].
가장 중요한 양성 조절자는 멜라노코르틴{0}} 수용체와 그 리간드인 멜라노코르틴과 부신피질 자극 호르몬[23]입니다. 그러나 멜라닌 생성에 관여하는 기타 요인으로는 엔돌핀, 에스트로겐, 안드로겐, 비타민 D3, 카테콜아민 등이 있습니다[23]. 누적 증거에 따르면 멜라닌 생성의 기질 및 중간체인 L-티로신과 L-DOPA는 다른 세포 기능의 조절자 외에도 멜라닌 생성 경로의 유도제 및 양성 조절제 역할을 합니다. 또한 Jeff Howe et al. L-티로신에 의한 멜라닌 생성의 유도 및 조절은 카테콜아민과 같은 대사 산물에 의한 것이 아니라 L-티로신에 의한 아드레날린성 수용체의 직접적인 활성화에 의해 매개된다고 제안했습니다[25]. 그들의 연구에서 노르에피네프린과 에피네프린은 티로시나아제 활성을 자극했지만,멜라닌 합성L-tyrosine보다 상대적으로 낮았다[25].
카테콜라민은 피부 색소 침착 시스템에서 중요한 역할을 할 수 있습니다. 그러나 3세대 비선택적 차단제의 작용과 관련하여 멜라닌 생성에 미치는 영향은 아직 조사되지 않았습니다. 따라서 본 연구에서는 카베딜롤이 멜라닌 생성에 영향을 미치는지 여부를 조사하고 인간의멜라닌 세포생체 외 인간 피부 및 잠재적 용도희게 함제품.
로 멜라닌 형성을 억제허바 시스탠치
2. 결과
2.1. Carvediol은 멜라닌 생성을 억제합니다
정상인에 대한 카베딜롤의 세포독성멜라닌 세포(NHMs) 및 Mel-ab 세포는 WST 세포 증식 분석에 의해 평가되었습니다. 10 μM의 카베딜롤 농도는 NHM과 Mel-ab 세포 모두에 대해 세포독성을 나타내기 시작했습니다(그림 1A,B). 따라서 추가 평가에서 NHM에 세포 독성이 없는 8 μM의 카베딜롤을 사용했습니다.
카베딜롤 처리는 NHM의 생존력에 영향을 미치지 않으면서 용량 의존적 방식으로 멜라닌 함량을 감소시켰습니다(그림 1C). 멜라닌 함량은 96 hof 8 μM 카베딜롤 처리 후 28.36% 감소했습니다(그림 1C). 100 mg/mL 알부틴을 첨가하면 카르베딜롤보다 멜라닌 함량이 더 적게 감소했습니다(그림 1C). 카르베딜롤 처리 4일 후, 멜라닌 함량은 시간에 따라 감소했습니다(그림 1D). 그러나 카베딜롤로 전처리한 후 4일 동안 포스콜린(FSK)으로 치료하면 멜라닌 함량이 증가합니다(그림 1E).FSK는 NHM에서 2시간에 가장 큰 정도로 MITF의 전사를 증가시키고 cAMP를 통해 기능하는 것으로 믿어집니다 /PKA/CREB 경로(그림 1F).
2.2. Carvedilol은 MITF 및 표적 유전자의 발현을 억제하고 NHM에서 Phospho-CREB 수준을 감소시킵니다
카베딜롤이 멜라닌 축적을 감소시켰기 때문에 우리는 세포 티로시나제 활성을 조사했습니다. 카베딜롤을 사용한 치료는 NHM에서 용량 의존적 방식으로 세포 티로시나제 활성을 감소시켰습니다(그림 2A). 티로시나제 활성은 8 μM 카베딜롤 처리 96시간 후 28.48% 감소했습니다(그림 2A). 다음으로 우리는 카베딜롤이 티로시나아제 및 다운스트림 멜라닌 생성 유전자의 조절에 중요한 역할을 하는 MITF의 발현에 영향을 미치는지 여부를 결정했습니다. FSK 치료는 세포 내 cAMP 수준을 증가시키고 카베딜롤의 항멜라닌 생성 작용을 역전시켰습니다. Carvedilol은 72시간에 멜라닌 생성의 중심 전사 인자인 MITF의 단백질 수준을 유의하게 감소시켰습니다(그림 2B). 또한 카베딜롤 처리 후 티로시나제 및 TRP와 같은 표적 유전자의 발현이 감소했습니다(그림 2B). 이러한 결과는 카베딜롤이 MITF 신호전달을 하향 조절하여 멜라닌 생성을 억제한다는 것을 나타냅니다.
다음으로 우리는 phospho-CREB와 phospho-ERK의 발현 수준을 측정하여 MITF 전사를 조절하는 멜라닌 생성의 세포 내 신호 전달 경로를 조사했습니다. 카르베딜롤 치료 후 인산-ERK 수준은 시간이 지남에 따라 변하지 않았습니다. 그러나 phospho-CREB 수준이 감소했습니다(그림 2B). 이전 관찰과 일관되게, 우리의 결과는 카베딜로린이 cAMP/PKA/CREB 신호 전달 경로를 억제함으로써 멜라닌 생성을 억제한다는 것이 밝혀졌습니다. 더욱이, FSK 치료는 cAMP 수준을 증가시켜 카베딜롤의 항멜라닌 생성 작용을 역전시켰습니다.
2.3. 생체 외 인간 피부 배양에서 멜라닌 지수 및 면역조직화학 염색
생체 외 인간 피부 배양 조직 절편의 표피 멜라닌 세포 밀도 및 멜라닌 지수는 각각 Melan-A 및 Fontana-Masson 염색에 의해 검출되었습니다. Carvedilol은 Melan-A의 수에 영향을 미치지 않았습니다.멜라닌 세포UVR 단독으로 처리된 표본과 비교하여 카베딜롤과 UV 방사선(UVR)으로 처리된 표본에서(그림 3A). HMB45( 플러스 ) 멜라닌 세포는 멜라닌 세포 활성이 UVR 처리 시 증가하고 카르베딜롤 처리 후 역으로 하향 조절되었음을 나타낼 수 있습니다(그림 3B). 그러나 멜라닌 함량은 UVR 단독 처리 표본에 비해 카베딜롤과 UVR로 처리된 표본에서 유의하게 감소했습니다(그림 3C). 멜라닌 지수를 계산하기 위해 UVR에 노출된 표본과 카베딜롤 플러스 UVR에 노출된 표본 사이의 전체 면적에 대한 Fontana-Masson의 염색 영역 비율을 계산하고 비교했습니다(그림 3D). 각 표본의 세포 용해물을 Western blotassay로 분석한 결과, 티로시나제, TRP1 및 DCT가 UVR에 의해 증가되고 카르베딜롤 처리에 의해 하향 조절됨이 밝혀졌습니다(그림 3E). 그 결과 카베딜롤은 멜라닌 지수와 멜라닌 생성 관련 단백질을 현저히 감소시켜 UVR 처리된 인간 피부에 대한 항멜라닌 생성 효과를 보였다.
3. 토론
멜라닌은 피부와 모발의 색을 담당하는 색소로 멜라노솜에서 합성된다.멜라닌 세포. 표피 멜라닌은 UVR에 대한 중요한 보호 역할을 하지만, 멜라닌 과잉 생성과 피부 축적은 PIH, 광노화 관련 색소 침착, 기미, 일광 흑색점과 같은 문제성 피부 과색소 침착 장애를 유발합니다[18,26]. 따라서 멜라닌 생성의 억제는 피부 미용 및 건강을 위한 의약 및 미용 치료의 초점이 되어 왔습니다. 새롭고 효과적인 항색소침착제를 확인하기 위해 상당한 노력을 기울였습니다. 그러나 특정 제제의 항멜라닌 생성 메커니즘은 현재 불확실하며 일반적으로 마우스 세포에서 평가되어 인간 피부 실험과 항상 일치하지 않는 결과를 산출합니다[27,28]. 또한, 멜라닌 세포의 멜라닌 생성은 각질 세포 및 기타 인접 세포에 의해 엄격하게 조절되기 때문에 공동 배양된 인간 세포 또는 생체 외 인간 피부는 효과적인 연구를 위한 보다 신뢰할 수 있는 실험 설정입니다.희게 함에이전트 [29]. 천연 또는 화학적으로 유도된 대부분의 피부 미백제는 피부 독성 또는 자극을 유발할 수 있으며, 이는 멜라닌 세포를 사용한 시험관 내 세포 생존 분석을 사용하여 어느 정도 예측할 수 있습니다. 우리 연구에서 카베딜롤은 적당한 용량으로 사용했을 때 세포 독성을 나타내지 않았습니다.
시탕슈 비엔페이
Hydroquinone 국소 크림은 원치 않는 저색소 침착 장애와 피부 독성을 유발할 수 있습니다[30-32]. 또한 일부희게 함화장품은 티로시나제 단백질의 분해를 통해 저색소침착을 유도함으로써 치명적인 결과를 초래합니다[33-35]. 미백제는 사용자에 따라 고용량으로 사용하여 과색소침착 병변의 미백을 극대화할 수 있습니다. 따라서 안전하고 건강한 피부 미백제를 찾기 위한 노력은 지속적으로 연구되고 있습니다.
따라서 본 연구는 정상 인간 세포와 생체 외 인간 피부에서 수행되도록 설계되었습니다. 또한, 카테콜아민의 확립된 G 신호전달 작용 메커니즘(세포의 cAMP 수준을 증가시킴)에 기초하여, 우리는 아드레날린성 차단제가 cAMP 수준을 감소시키고 UV-유도 피부 과색소침착의 주요 메커니즘인 UVR/cAMP/CREB 신호 전달 경로를 억제할 수 있다고 믿었습니다. [36,37]. 따라서 우리는 cAMP 수치를 감소시키는 아드레날린성 차단제가멜라닌 합성.
또한 안전한 개발을 위해희게 함에이전트, 멜라닌 생성 방지의 신뢰할 수 있고 재현 가능한 메커니즘을 병행하여 추구해야 합니다. 생리학적으로 가장 중요한 자극은 UV이며, UVR 신호 중에서 표피에멜라닌 세포, CREB 축은 인간 표피에서 멜라닌 생성의 조절을 위한 가장 확립된 경로이다[29]. UV에 노출되면 scAMP 생성, PKA 및 전사 인자 CREB가 차례로 활성화되고, 이는 차례로 MITF 및 다운스트림 표적 멜라닌 생성 유전자의 발현을 유도합니다[38,39]. PKA에 의한 CREB 인산화 외에도, 최근 연구에 따르면 CREB 전사 복합체에 대한 CREB 조절 전사 보조 활성화제(CRTC) 3의 모집도 cAMP 자극 MITF에 필요합니다. MITF는 의 규제에 가장 필수적인 역할을 수행멜라닌 합성멜라닌 생성 효소의 결과적인 전사[26,40,41]. 이 세포내 신호전달 과정에서 멜라닌 생성은 핵심 효소인 티로시나아제와 TRP{3}} 및 DCT와 같은 추가 효소 단백질에 의해 조절됩니다. 본 연구에서 카베딜롤은 CREB의 인산화를 효과적으로 감소시켰으며, MITF 전사를 억제하여 MITF와 tyrosinase 단백질을 감소시켰음을 나타냅니다(그림 4). MITF mRNA 유전자 조절이 다른 세포내 신호전달 분자와 보조 활성화제에 의해 복잡하게 조절되고 구제된다는 점을 고려할 때, MITF의 전사 수준 조절은 MITF의 생존 기능이 보존되고 구제되기 때문에 건강한 피부 미백 성분 탐색을 위한 유망한 전략이다[1,38,40]. 실제로, 우리가 FSK 유도 MITF 전사를 조사했을 때, MITF mRNA는 멜라닌 생성 및 세포 항상성에 대한 세포 생존에 대한 자체 피크 응답 곡선을 갖는 것으로 밝혀졌습니다. 의 생물학적 기능멜라닌 세포인간 멜라닌 세포의 다른 피드백 신호에 의해 본질적으로 조절되는 것으로 보입니다. 더욱이, 카베딜롤은 갑작스러운 것보다는 시간이 지남에 따라 세포 티로시나제 활성을 약화시키기 때문에 저색소침착의 부작용 위험이 더 낮습니다.
카테콜아민은 도파민, 에피네프린, 노르에피네프린을 포함하며 식이성 티로신으로부터 효소의 작용에 의해 합성된다[42]. 카테콜라민의 생합성과 분해는 교감신경과 뇌의 뉴런, 부신수질세포, 내피세포, 호중구, 단핵구 등 광범위한 세포에서 일어난다[43-45]. 인간 피부에서 카테콜아민 합성은 각질 세포에서 발생합니다. 반대로 멜라닌 세포는 노르에피네프린의 자가분비 합성을 위한 mRNA와 효소도 발현하지만 에피네프린은 발현하지 않는다[7,42]. 인간에서멜라닌 세포, -1-AR은 노르에피네프린에 대한 반응에서 중요할 수 있지만멜라닌 합성기능적 2-ARsignaling[7,8]의 영향도 받습니다. 흥미롭게도, 백반증 환자는 각질형성세포의 AR 밀도가 증가했습니다[46]. 비분절 백반증 환자의 소변과 혈장에서 노르에피네프린 수치의 증가가 발견되어 카테콜아민 대사가 백반증의 발병 및 진행과 관련될 수 있음을 암시합니다. [47]. 또한, 고전적인 스트레스 신경 전달 물질 외에도 멜라닌 세포는 코르티코트로핀 방출 인자 및 프로피오멜라노코르틴과 같은 신경 펩티드 및 호르몬을 생성합니다. 이 생성은 UVR 및 피부 신경내분비계 내에서 작용하는 기타 작용제에 의해 자극됩니다[48]. 따라서 카테콜아민의 작용과 멜라닌 세포 기능은 다양한 복잡한 경로에서 밀접하게 관련되어 있습니다. 또한 카베딜롤은 멜라닌 생성 경로의 화학 반응을 방해할 수 있으므로 이 가능성에 대해 더 연구해야 합니다. 대부분의 과색소침착 장애는 임상적으로 또는 피부가 어두운 환자에서 준임상적으로 PIH이기 때문에 Carvedilol은 항염증 효과가 동시에 있기 때문에 이점이 있을 수 있습니다. 피부를 통한 카르베딜롤의 침투는 시험관 내 및 생체 외 모두에서 연구되었기 때문에, 카르베딜롤은 국소 치료제로 개발될 수 있습니다.희게 함미래의 에이전트[49–51].
전신 카베딜롤 투여는 서맥, 현기증, 저혈압, 두통 및 현기증을 유발할 수 있습니다. 카베딜롤의 국소 도포는 일반적으로 전신 증상을 일으키지 않으나, 아토피 피부염 환자와 같이 피부 장벽에 결함이 있는 환자에게 도포할 경우 이러한 증상에 주의해야 한다. 또한, 카베딜롤을 복용할 때 드물게 습진, 가려움증, 태선 발진이 보고되었습니다. 카베딜롤을 국소용으로 사용할 때 이러한 피부과적 부작용과 접촉성 피부염도 고려해야 합니다.희게 함에이전트.
결론적으로, 우리는 카베딜롤이 인간의 멜라닌 생성을 효과적으로 감소시킴을 보여주었습니다.멜라닌 세포및 cAMP/CREB/MITF 경로를 억제함으로써 생체 외 인간 피부에 효과적인 미백제로서의 가능성을 시사합니다. 인간 멜라닌 세포에서 카베딜롤에 의한 아드레날린 수용체의 기능적 관여에 대한 추가 조사가 뒤따라야 합니다.
4. 재료 및 방법
4.1. 재료
Carvedilol, 3,{1}}디히드록시-L-페닐알라닌(L-DOPA), 콜레라 독소(CT) 및 12-Otetradecanoylphorbol{6}}아세테이트(TPA)는 Sigma-Aldrich Co에서 구입했습니다. (St. Louis, MO, USA). Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)과 Dulbecco의 phosphate-buffered saline은 WelGENE(대구, 한국)에서 구입했습니다. 태아 소 혈청(FBS), 항생제-항진균제 및 트립신-EDTA는 Gibco(Grand Island, NY, USA)에서 구입했습니다. Medium 254(CascadeBiologics, Portland, OR, USA) 및 FSK([3R-(3,4a,5,6,6a,10,10a,10b)]-5-(Acetyloxy)-3-ethenyldodecahydro{ {24}},10,10b-트리히드록시-3,4a,7,7,10a-펜타메틸{34}}H-나프토[2,{37}}b]피란{38}}원 ) Tocris Bioscience (Bristol, UK)에서 구입했습니다.
4.2. 세포주 및 세포 배양
Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 얻은 1차 NHM을 Human Melanocyte Growth Supplement(Thermo Fisher)가 보충된 배지 254(Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)에서 유지했습니다. 마우스 유래 자발적 불멸화 멜라닌 세포주인 Mel-ab 세포는 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 입수하고 10% FBS, 페니실린-스트렙토마이신, 100nM TPA 및 1nM이 보충된 DMEM에서 유지하였다. CT. 모든 세포는 5% CO2의 가습 환경에서 37℃로 일상적으로 유지되었습니다.
4.3. 항체 및 웨스턴 블롯
세포를 차가운 PBS로 한 번 세척하고 단백질 용해 완충액(1{10}} mMTris 및 5mM EDTA, pH 7.4에서 1% SDS)에 용해시킨 다음 98℃에서 10분 동안 배양했습니다. 단백질 시료를 8% SDS-polyacrylamide gel 전기영동으로 분리하고 니트로셀룰로오스 멤브레인(GE Healthcare Life Sciences, Chicago, IL, USA)에 블랏팅한 후 Tween 20 0.5% 및 BSA 5%를 함유하는 Tris-buffered saline으로 차단하였다. 면역 블로팅을 실시합니다. Tyrosinase와 TRP{14}} 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Dallas, TX, USA)에서 구입했으며 MITF는 Abcam(Cambridge, UK)에서 구입했습니다. -tubulin(Gentex, Holland, MI, USA)을 내부 로딩 대조군으로 사용했습니다.
4.4. 멜라닌 함량
카베딜롤의 세포독성 효과를 제조사의 지시에 따라 Ez-Cytox Cell Viability Assay Kit(Dogen-Bio Co., Ltd., Seoul, Korea)를 사용하여 평가하였다. Mel-Ab 세포와 NHM을 6-well plate에 접종하였다. 밀도는 각각 6 × 105 및 3 × 105cells/well입니다. 세포에 그림과 같이 3~5일 동안 카베딜롤을 처리하였다(d). 멜라닌 함량을 측정하기 전에 위상차 현미경으로 세포를 관찰하고 사진을 찍었다(Olympus, Tokyo, Japan). 세포를 100℃에서 30분 동안 550μL의 1N NaOH에 용해시키고 13,{16}} rpm에서 5분 동안 원심분리했습니다. 상층액의 흡광도는 마이크로플레이트 판독기로 405 nm에서 측정하였다. 세포 내 멜라닌 함량은 세포의 처리되지 않은 대조군에 대한 백분율로 표시되었습니다. 알부틴(100 mg/mL)을 양성 대조군으로 사용했습니다.
4.5. 세포성 티로시나아제 활성
L-DOPA의 도파크롬 형성 속도를 측정하여 티로시나제 활성을 평가했습니다. 카베딜롤과 함께 배양한 후, 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 세척하고 티로시나제 용해 완충액(인산염 완충액, pH 6.8, 1% Triton X{ {5}}) 동결/해동 주기를 반복했습니다. 용해물을 15,{7}} rpm에서 4 oC에서 10분 동안 원심분리하여 정화했습니다. 용해물의 단백질 수준을 정량하고 용해 완충액으로 단백질 농도를 조정한 후, 티로시나제 용해 완충액에 10mM L-DOPA 10μL와 혼합된 90μL의 상청액을 37℃에서 배양하였다. 세포 티로시나제 활성은 흡광도를 판독하여 측정하였다. 최소 1시간 동안 10분마다 마이크로플레이트 리더를 사용하여 475 nm. 알부틴(100 mg/mL)은 양성 대조군으로 사용되었습니다.
허바 시스탠치
4.6. 면역조직화학 분석
파라핀이 포매된 인간 피부 조직을 6-μm 두께의 섹션으로 절단하고 Melan-A(Novocastra, Newcastle, UK), Fontana-Masson 키트(ID labs, London, ON, Canada) 및 HMB45(Santa Clara)로 염색했습니다. , CA, USA), 제조업체의 지침에 따릅니다. 멜라닌 지수는 ImageJ 1.52a 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 전체 조직 면적에 대한 염색 면적의 백분율을 측정하여 결정했습니다.
4.7. 통계 분석
데이터는 평균 ± 표준오차(SEM)로 표시되며, 통계적 유의성은 GraphPad Prism5 소프트웨어(San Diego, CA, USA)를 사용하여 unpaired Student's t-test에 의해 결정되었습니다. 본 연구에서는 p < 0.05,="" p="">< 0.01="" 및="" p="">< 0.001을="" 통계적으로="" 유의한="" 것으로="" 간주하고="" *,="" **="" 및="" ***로="" 표시하며,="">
참고문헌
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