QPCR과 RNA‑seq의 비교를 통해 HLA 발현 정량화의 어려움이 드러남 파트 1
May 25, 2023
추상적인
인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I 및 II 유전자좌는 선천성 및 후천성 면역의 필수 요소입니다. 이들의 기능에는 세포 및 체액 면역 반응을 유도하는 T 세포에 대한 항원 제시 및 NK 세포의 조절이 포함됩니다. 질병 결과에 대한 그들의 예외적인 영향은 이제 게놈 차원의 연관성 연구에 의해 분명해졌습니다. 펩티드 결합 그루브를 암호화하는 엑손은 질병 감수성/병인에 대한 HLA 효과를 결정하기 위한 주요 초점이었습니다. 그러나 HLA 발현 수준은 또한 질병 결과와 관련이 있으며, 개인 간 면역 반응의 가변성에 영향을 미치는 HLA의 극단적인 다양성에 또 다른 차원을 추가합니다.
백혈구 항원과 면역 사이에는 밀접한 관계가 있습니다. 백혈구 항원은 다른 세포 유형과 병원체를 식별하고 구별할 수 있는 인간 백혈구 표면의 분자를 말합니다. 그것은 인간 면역 체계의 중요한 부분이며 면역 반응의 중요한 조절자입니다.
백혈구 항원의 차이는 다른 면역 반응과 질병 감수성을 초래할 수 있습니다. 예를 들어, 특정 백혈구 항원은 자가면역 질환, 전염병 및 종양과 관련이 있습니다. 특정 백혈구 항원의 발현은 면역 세포의 기능 및 양과도 관련이 있습니다.
따라서 개인의 백혈구 표면의 분자적 특성을 이해하는 것은 개인의 면역 상태와 질병의 위험 및 예후를 평가하는 데 매우 중요합니다. 동시에 맞춤형 치료 및 예방 조치의 공식화에도 도움이 됩니다. 이런 관점에서 우리는 면역력을 향상시켜야 합니다. Cistanche는 면역력 향상에 상당한 효과가 있습니다. Cistanche는 비타민 C, 카로티노이드와 같은 다양한 항산화 물질이 풍부합니다. 이러한 성분은 자유 라디칼을 제거하고 산화 스트레스를 줄이며 면역 체계의 저항력을 향상시킬 수 있습니다.
HLA 발현을 추정하기 위해 면역 유전학 연구는 전통적으로 정량적 PCR(qPCR)에 의존합니다. RNA-seq와 같은 대체 고처리량 기술의 채택은 HLA 유전자의 극단적인 다형성으로 인한 기술적 문제로 인해 방해를 받아 왔습니다. 그러나 최근에는 RNA-seq 데이터로부터 HLA 발현을 정확하게 추정하기 위한 다양한 생물정보학적 방법이 개발되었습니다. 이것은 대규모 데이터 세트에서 HLA 발현을 정량화할 수 있는 흥미로운 기회를 제공하지만 RNA-seq 결과가 qPCR에 의한 결과와 비교할 수 있는지에 대한 질문도 제공합니다. 이 연구에서는 (a) RNA-seq, (b) qPCR 및 (c) 세포 표면 HLA-C 발현과 같은 일치하는 개인 세트에 대한 HLA 클래스 I 유전자에 대한 세 가지 클래스의 발현 데이터를 분석합니다. HLA-A, -B 및 -C({{10}}.2 rho 이하 0.53 이하 ). 다른 분자 표현형에 대한 정량화를 비교하거나 다른 기술을 사용할 때 설명해야 하는 기술적 및 생물학적 요인에 대해 논의합니다.
키워드
HLA · 발현 · PCR · RNA-서열.
소개
유전자 발현은 유전적 변이와 질병 상태와 같은 복잡한 표현형 사이의 중간 위치에 있는 분자 표현형을 제공합니다. 유전자 발현의 유전적 기초를 이해하는 것은 자가 면역 및 전염병에 대한 감수성을 포함하여 유전적 변이와 복잡한 표현형(GTEx Consortium 2013; Lappalainen et al. 2013) 사이의 연결을 만드는 데 전략적일 수 있습니다. 인간 백혈구 항원(HLA) 유전자좌 및 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 영역 내에서 일반적으로 유전적 변이에 대한 연구가 여러 복잡한 질병의 유전적 기초를 분석하는 데 사용되었지만(Trowsdale and Knight 2013; Dendrou et al. . 2018), 특히 유전자 발현과 관련된 분자 표현형의 포함은 비교적 최근에 이루어졌습니다(Apps et al. 2015; Vince et al. 2016; Ramsuran et al. 2018; Johansson et al. 2022).
염색체 6p21의 인간 MHC 영역은 고유한 연관 불균형(LD) 패턴과 극도의 다형성을 가진 높은 유전자 밀도를 나타냅니다(de Bakker et al. 2006; Radwan et al. 2020). MHC 영역은 면역 반응을 유발하고 조절하는 것과 관련된 분자를 암호화하는 HLA 클래스 I 및 II 유전자좌를 포함합니다. HLA 클래스 I 분자는 대부분의 유핵 세포에서 발현되며 일반적으로 CD8 + T 세포에 세포내 펩티드를 제시합니다. 대조적으로, HLA 클래스 II 분자는 주로 전문 항원 제시 세포에 의해 발현되며, 세포내이입에 의해 내재화된 외인성 항원과 함께 CD4에 T 세포에 제시됩니다. 클래스 I 분자는 또한 자연 살해(NK) 세포의 수용체, 즉 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR)에 의해 인식되며, 이는 NK 세포의 교육 및 활성화 모두에 영향을 미칩니다(Colonna and Samaridis 1995; Goodson-Gregg et al. 2020). 서로 다른 HLA 클래스 I 알로타입과 특정 KIR 분자의 짝짓기는 NK 세포(및 CD8 + T 세포의 하위 집합) 활동에 영향을 미쳐 암, 전염병 및 자가 면역에 대한 차등 위험을 초래합니다(Kulkarni et al. 2008에서 검토됨).
HLA 질병 연관성은 주로 펩타이드 결합 홈의 광범위한 다형성으로 인해 항원 제시의 대립유전자 특이적 차이에 기인합니다. 그러나 HLA 발현 수준은 HLA 다형성과 질병 결과 사이에서 관찰되는 연관성 중 일부에 기여합니다. HLA 발현 수준은 자가면역과 암 및 감염에 대한 HLA 매개 면역 반응의 강도에 대한 중요한 수정자입니다(Rene et al. 2016에서 검토됨).
HLA 발현 수준과 바이러스 감염 결과 사이의 연관성에 대한 여러 예가 있습니다. 예를 들어 mRNA 수준과 세포 표면의 단백질 모두에서 더 높은 HLA-C 발현 수준이 HIV-1의 더 나은 제어와 관련이 있다는 것은 잘 문서화되어 있습니다(Thomas et al. 2009; Kulkarni et al. al. 2011; Apps et al. 2013; Parolini et al. 2018; Bachtel et al. 2018), HLA-A 발현 증가는 HIV 통제 장애와 관련이 있습니다(Ramsuran et al. 2018). SARS-CoV-2 감염은 세포 표면에서 HLA-C 유전자 발현(Loi et al. 2022) 및 HLA 클래스 I 발현(Zhang et al. 2021; Arshad et al. 2023) 및 HLA 클래스를 하향 조절합니다. HLA-DPA1, -DPB1, -DRA 및 -DRB1을 포함한 II 유전자 발현(Wilk et al. 2020).
또한, HLA-DPA1(Ou et al. 2019) 및 HLA-DPB1(Thomas et al. 2012; Ou et al. 2021) 발현 수준과 HBV 제거 간의 연관성이 있습니다. 인간 세포주에서 박쥐 인플루엔자 A 바이러스 감염에 취약한 HLA-DRA 발현(Karakus et al. 2019); HLA-DQA1, -DQB1, -DQB2, -DRB1 및 -DRB5를 포함한 HLA 클래스 II 유전자의 조절 변이체와 발현 수준 사이의 광범위한 연관성과 다수의 우세한 바이러스에 대한 항체 반응(Kachuri et al. 2020).
HLA 유전자좌의 발현 수준은 또한 자가면역과 관련이 있습니다(검토를 위해 Johansson et al. 2022 참조). 세포 표면의 HLA-C 발현 수준(Apps et al. 2013; Kulkarni et al. 2013)과 세포 표면 및 혈장의 HLA-G 수준(da Costa Ferreira et al. 2021)은 관련이 있습니다. 염증성 장 질환의 위험이 있습니다. 세포 표면에서 증가된 HLA-B27 발현이 강직성 척추염 환자에서 관찰되었으며(Cauli et al. 2002), 그레이브스병 환자에서 전반적인 HLA 클래스 I 발현이 관찰되었습니다(Weider et al. 2021). HLA 클래스 II 발현 수준도 자가면역 상태의 위험에 영향을 미칩니다.
HLA-DQA1 및 -DRB1 유전자 발현과 세포 표면의 DQ 및 DR 분자 발현은 백반증 환자의 말초 혈액 단핵구에서 증가합니다(Cavalli et al. 2016). 더 높은 HLA-DQA1, -DQB1 및 -DRB1 유전자 발현과 관련된 조절 변이와 세포 표면의 DQ 및 DR 발현은 전신성 홍반성 루푸스의 위험과 관련이 있습니다(Raj et al. 2016); HLA-DRB5 유전자 발현은 간질성 폐 질환이 있는 경피증 환자에서 더 높습니다(Odani et al. 2012). 특정 HLA-DRB1 대립 유전자는 류마티스 관절염 환자에서 높게 발현됩니다(Houtman et al. 2021). 그리고 DRB1*15:01의 높은 발현은 다발성 경화증의 위험과 관련이 있습니다(Alcina et al. 2012). 따라서 개인 간 HLA 발현의 변이와 HLA 발현 수준을 조절하는 메커니즘을 이해하는 것이 질병 표현형의 유전적 기초를 밝히는 데 핵심이 될 것입니다.
전통적으로 HLA 발현은 세포 표면에서의 발현 수준에 대한 항체 기반 기술(Thomas et al. 2012; Apps et al. 2013) 또는 mRNA 전사 수준에 대한 정량적 PCR(qPCR 또는 RT-PCR)에 의해 추정되었습니다(Bettens et al. 외 2014, Ramsuran 외 2015, 2017). 각 분석 및 각 HLA 유전자좌에 대해 서로 다른 실험 절차가 사용되기 때문에 여러 연구에서 결과를 비교하거나 심지어 동일한 연구 내에서 별개의 HLA 유전자좌를 비교하는 것은 어려운 일입니다. 이로 인해 qPCR에서 증폭 효율이 달라지거나 유세포 분석에서 항체 친화도가 달라질 수 있습니다.
RNA-seq와 같은 고처리량 기술은 HLA 유전자를 포함하여 게놈의 모든 유전자에 대한 발현 추정치를 제공하므로 게놈 차원에서 HLA 발현을 평가할 수 있습니다. 그러나 이러한 기술은 HLA 유전자의 발현 수준을 추정하는 데 사용될 때 많은 문제를 야기합니다. RNA-seq 분석과 관련된 잘 문서화된 편향(예: 배치 효과, 라이브러리 준비, GC 함량('t Hoen et al. 2013)) 외에도 HLA 유전자에 대한 발현 수준 추정의 어려움은 정량화가 HLA 대립 유전자 다양성의 완전한 표현을 제공하지 않는 참조 게놈에 대한 짧은 읽기의 정렬을 포함합니다.
따라서 참조 게놈과 관련된 많은 차이로 인해 일부 읽기가 정렬되지 않을 수 있습니다(Brandt et al. 2015). 또한 HLA 유전자는 연속적인 복제 후에 형성된 유전자 패밀리의 일부이며 종종 paralog 간에 매우 유사한 세그먼트를 포함하므로 유전자 간 교차 정렬 및 발현 수준의 편향된 정량화를 초래합니다. 이러한 어려움은 정렬 단계에서 알려진 HLA 다양성을 설명하고 HLA 유전자에 대한 정확한 발현 수준을 제공하는 것으로 나타난 계산 파이프라인(검토를 위해 Johansson et al. 2022 참조)의 개발에 동기를 부여했습니다(Boegel et al. 2012; Lee et al. 외 2018, Aguiar 외 2019, Gutierrez-Arcelus 외 2020, Darby 외 2020).
RNA-seq 및 qPCR 접근법 모두 전사체의 양을 정량화하여 HLA 발현을 추정하지만, 이 방법에는 서로 다른 실험 및 생물 정보 처리 절차가 포함됩니다. 우리가 아는 한, RNA-seq 결과와 HLA 유전자에 대한 qPCR 결과의 정량적 비교는 수행되지 않았습니다. 이 연구에서 우리는 HLA 클래스 I 발현의 정량화를 위한 다양한 기술과 분자 표현형을 비교하고자 했으며, 어떤 기술도 표준으로 간주될 수 없다는 점을 염두에 두었습니다. 서로 다른 연구의 비교에서 기술 및 생물학적 변이의 영향을 줄이기 위해 qPCR 발현 추정치가 가능한 96명의 개체 집합에 대해 RNA-seq 분석을 수행했습니다(HLA-A, -B, -C의 경우). HLA-C 항체 기반 세포 표면 발현이 가능한 하위 집합에 대해. RNA-seq 정량화는 단일 참조 게놈에 의존하는 표준 접근법의 편향을 최소화하면서 정확한 발현 추정을 허용하는 HLA 맞춤형 파이프라인으로 수행되었습니다.
재료 및 방법
견본
FNLCR(Frederick National Laboratory for Cancer Research)의 자발적 기증자 프로그램에 등록된 96명의 건강한 헌혈자로부터 혈액 샘플을 채취했습니다. 모든 피험자로부터 서면 동의서를 얻었고 국립 암 연구소의 IRB 승인 절차에 따라 표본을 익명화했습니다. RNeasy Universal 키트(Qiagen)를 사용하여 새로 분리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 RNA를 추출했습니다. 게놈 DNA 제거를 위해 RNA를 RNAse-free DNAse로 처리하였다. PBMC에서 추출한 총 RNA는 HT RNA Lab Chip(Caliper, Life Sciences)을 사용하여 정량하였다. 8보다 큰 RNA 품질 점수를 보인 모든 샘플을 유전자 발현 분석에 사용했습니다.
HLA 타이핑
HLA 대립 유전자는 Sanger 시퀀싱에 의해 결정되었습니다. 또한 HLApers(Aguiar et al. 2019) 및 Kourami(Lee and Kingsford 2018)를 실행하여 RNAseq에서 직접 HLA 대립유전자를 추론하고 Sanger 시퀀싱 기반 호출과 일치하는지 확인했습니다. HLAper와 Kourami 사이의 일관된 호출을 고려하면 288개의 비교(3 loci×96 개인) 중 Sanger 호출과 불일치가 10개만 관찰되었습니다. 그들 중 대부분(n=5)은 Sanger 시퀀싱에 의해 결정된 것과 매우 가까운 대립유전자에 대해 RNA-seq의 지원을 보였으므로 RNA-seq 기반 호출을 유지하기로 결정했습니다. 3가지 유전자형에 대해 하나의 대립유전자가 발현되지 않았기 때문에 RNA-seq에서 동형접합 호출을 관찰하고 Sanger 시퀀싱에서 호출을 유지했습니다. RNA-seq를 통해 감지되지 않은 대립유전자에 정렬된 읽기가 없기 때문에 이것은 발현 추정에 영향을 미치지 않습니다. 하나의 유전자형에 대해, Sanger 시퀀싱이 동형 접합체라고 불리는 반면 이형 접합체 호출에 대한 좋은 지원을 관찰했습니다. 이 경우 관찰된 읽기를 더 잘 설명하기 때문에 RNA-seq 기반 호출을 유지했습니다. 하나의 대립 유전자 호출에 대해 읽기 범위가 충분하지 않아 RNA-seq 기반 호출 오류를 고려했습니다.
정량적 PCR(qPCR)
HLA-A, -B 및 -C에 대한 HLA mRNA 전사 수준은 다른 모든 유전자좌의 증폭을 피하면서 각 유전자좌에서 공통 대립 유전자의 편향되지 않은 증폭을 보장하는 분석에서 qPCR로 측정되었습니다. 사용된 프라이머는 HLA-A(F, GCTCCCACTCCATGAGGTAT; R, AGTCTG TGACTGGGCCTTCA); HLA-B(F, ACTGAGCTTGTG GAGACCAGA; R, GCAGCCCCTCATGCTGT); HLA-C(F, CTGGCCCTGAACCGAGACCTG; R, CGCTTGTAC TTCTGTGTCTCC). 역전사는 High-Capacity RNA-to-cDNA 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 수행되었습니다. HLA 및 하우스키핑 유전자 2 마이크로글로불린(B2M) cDNA의 증폭은 ABI 7900HT 기계에서 Power SYBR 그린 마스터 믹스(Applied Biosystems)를 사용하여 수행되었습니다. B2M에 대한 프라이머 서열은 Kulkarni et al.의 표 S4에 설명되어 있습니다. (2013). 각 HLA 유전자의 평균 발현 수준은 B2M의 평균 발현 수준으로 정규화되었고 2-∆∆Ct 방법(여기서 Ct는 역치 주기임)을 사용하여 계산되었습니다.
공통 HLA 대립유전자의 평균 대립유전자 특이적 발현 수준은 Ramsuran et al. (2015). 구체적으로, 우리는 발현을 각 개체에 의해 운반되는 두 대립유전자의 선형 함수로 모델링하고 각 대립유전자가 유전자 발현에 미치는 영향을 추출했습니다. R에서 이 단계를 수행했습니다(코드 가용성 섹션 참조).
표면 표현
HLA-C 세포 표면 발현은 HLA-C 특이적 단클론 항체 DT9를 사용하여 유동 세포측정법으로 새로 분리된 PBMC의 CD3 플러스 세포에서 측정되었습니다(Apps et al. 2013). A * 03 및 A * 11을 보유한 개인의 하위 집합에서 HLA-A 분석을 위해 항체 0554HA (One Lambda, Inc.)로 세포를 염색했습니다.
RNA‑서열
RNA 준비
RNA-seq은 -80도에 저장된 RNA에서 수행되었습니다. 총 RNA는 Qubit RNA HS 분석(Thermo Fisher)을 사용하여 정량화되었습니다. RNA 품질은 2100 Bioanalyzer 기기와 Agilent 6000 RNA Pico Kit(Agilent Technologies)를 사용하여 평가했습니다. 각 샘플에 대해 500ng의 전체 RNA를 전체 transcriptome rRNA 고갈 라이브러리 준비를 위한 입력으로 사용했습니다. KAPA 제공 프로토콜에 따라 Bioo Scientific NEXTfex™ DNA Barcoded Adapters(BioScientifc, Austin, TX, USA)를 사용하여 KAPA HyperPrep Kit(KAPA Biosystems, Wilmington, MA)로 어댑터 연결 라이브러리를 준비했습니다.
RiboErase를 사용한 rRNA 고갈
Ribosomal RNA는 rRNA 서열에 상보적인 프로브로 전체 RNA를 배양하여 고갈되었습니다. 혼성화 후, RNase H를 사용하여 rRNA를 효소적으로 분해했습니다. Kapa 프로토콜에 따라 Kapa Pure Beads 및 DNase를 사용하여 Cleanup 및 DNase 절단을 수행했습니다.
단편화, cDNA 합성 및 라이브러리 구축
rRNA가 고갈된 샘플은 1st 및 2nd strand 합성 및 A-Tailing 반응 전에 마그네슘의 존재 하에 85도에서 4.5분 동안 단편화되었습니다. NEXTfex DNA Barcoded Adapters(1.5 uM)는 각 샘플에 고유한 바코드가 있는 A-tailed cDNA에 결찰되었습니다. Kapa Pure Beads로 제품을 정제하고 8주기의 Library Amplification을 수행했습니다. 증폭 후 최종 라이브러리 정리를 수행하고 2100 Bioanalyzer 기기에서 Qubit DNA HS 분석(Thermo Fisher) 및 Agilent DNA HS 키트를 사용하여 라이브러리 정량화 및 QC를 평가했습니다.
시퀀싱
생성된 다중화된 시퀀싱 라이브러리는 Illumina cBOT(Illumina, San Diego, CA, USA)의 클러스터 형성에 사용되었고 시퀀싱은 Illumina HiSeq 2500을 사용하여 Illumina에서 제공한 2x126 bp 페어드 엔드 시퀀싱 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 각 전사체는 4000만~5000만 판독의 목표 깊이로 시퀀싱되었습니다.
11명의 새로운 샘플에 대한 RNA‑seq
RNA 시퀀싱 전에 -80도에 저장된 물질의 샘플 분해 가능성을 조사하기 위해 qPCR 추정치에 대한 잠재적인 불일치 원인을 조사하기 위해 11명의 기증자로부터 혈액을 다시 채취하고 새 샘플에 대해 RNA-seq를 수행했습니다. 실험은 이전과 동일한 라이브러리 준비 및 방법으로 수행되었지만 2 x 150pb 읽기로 Illumina NextSeq를 사용하여 시퀀싱되었습니다.
RNA‑seq의 발현 정량화
참조 전사체
Gencode v37 데이터베이스에 주석이 달린 모든 전사체의 발현 수준을 추정하기 위해 Salmon(Patro et al. 2017)을 사용했습니다. Salmon에 대한 편향 수정을 위해 모든 옵션을 사용했습니다(GC 편향, 위치 편향 및 시퀀스별 편향).
맞춤형
"Ref transcriptome"과 동일하지만 각 개인이 가지고 있는 HLA-A, -B 및 -C 유전자형에 따라 개인화된 HLA 전사체가 있습니다. 개인화는 참조 게놈의 HLA 대립 유전자에 대한 서열을 게놈에 정렬하여 좌표를 얻는 방식으로 수행되었습니다. 그런 다음 참조 게놈에 존재하는 대립 유전자의 다중 서열 정렬을 다른 모든 대립 유전자와 함께 사용하여(IPD-IMGT/HLA 릴리스 3.43에서 사용 가능0(Robinson et al. 2020)) 모든 HLA 대립 유전자에 대한 위치. 마지막으로 전사체 좌표 정보와 HLA 대립유전자 서열의 조합을 기반으로 개인화된 전사체를 구성했습니다. 이 절차는 Biostrings 패키지(Pagès et al. 2020) 및 tidyverse meta 패키지(Wickham et al. 2019)를 사용하여 R(R Core Team 2020)에서 수행되었습니다.
For more information:1950477648nn@gmail.com
