인간 신장에서 무기물-유기 나노입자의 검출 및 특성화
Feb 22, 2022
왕추이인1,2,*, 우청유1,2,3,* 외
이소성 석회화는 죽상동맥경화증, 암,만성병 환자신장질병, 그리고당뇨병진성. 석회화된 혈관에서 광물성 나노입자가 검출되었지만 인체에서 이러한 입자의 성질과 역할은 아직 명확하지 않다. 여기서 우리는 처음으로 인간이신장말기에서 얻은 조직만성병 환자신장질병또는 신장암 환자는 50~1,500nm의 둥근 다중층 미네랄 입자를 포함하는 반면 건강한 대조군에서는 입자가 관찰되지 않습니다. 미네랄 입자는 주로 세뇨관을 둘러싸고 있는 세포외 기질, Henle의 집합관 및 고리를 모으는 것, 그리고 세뇨관 묘사 세포의 세포질 내에서 발견되며 뼈 및 이소성 석회화에서 발견되는 미네랄과 유사한 다결정질 인산칼슘으로 구성됩니다. 그만큼신장미네랄 나노입자는 알부민, 페투인-A 및 아포지단백 A1을 포함하여 체액의 이소성 석회화를 억제하는 여러 혈청 단백질을 포함합니다. 미네랄-유기 나노입자는 석회화된 퇴적물 내에서 뿐만 아니라 미세한 석회화가 없는 영역에서도 발견되기 때문에 우리의 관찰은 나노입자가 인간의 석회화 및 신장 결석의 전구체를 나타낼 수 있음을 나타냅니다.
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이소성 석회화는 죽상동맥경화증, 암,만성병 환자신장질병및 당뇨병 1-3. 최근 연구에 따르면 동맥경화와만성병 환자신장질병혈관 석회화 징후가 있는 환자는 이환율 및 사망 위험이 증가하여 이소성 석회화가 인간의 건강에 해롭다는 것을 시사합니다1,3. 원치 않는 석회화는 노년층에서도 관찰되며 60세 이상의 대부분의 사람들은 혈관 석회화의 징후를 보입니다4. 이러한 이유로 이소성 석회화를 유발하는 요인을 해독하고 효과적인 치료법을 개발하는 것이 중요한 목표입니다.
이소성 석회화는 체내 석회화 억제제와 유도인자의 불균형으로 정의할 수 있습니다. 석회화 억제제에는 알부민, 페투인-A, 오스테오폰틴 및 기질 GLA 단백질과 같은 혈청 단백질과 피로인산염과 같은 작은 화합물이 포함되는 반면, 고인산혈증 및 염증은 석회화의 주요 유발인자를 나타냅니다. 최근 연구에 따르면 석회화 유도제는 혈관 석회화 동안 뼈 형성과 유사한 세포 과정을 활성화합니다. 발달 중인 뼈에서 광물화를 유도하는 것과 유사한 기질 소포가 석회화된 연조직에서도 검출되었습니다7-9. 이러한 기질 소포는 아마도 석회화를 유도하는 조골 세포와 유사한 세포로 분화하는 혈관 평활근 세포에 의해 방출될 것입니다.
무기질 나노입자(NP)는 이소성 석회화의 징후를 나타내는 연조직에서 검출되었습니다. Price et al. 비스포스포네이트 에티드로네이트 또는 비타민 D로 처리된 쥐의 혈청에는 석회화 억제제 fetuin-A와 기질 GLA 단백질을 함유하는 미네랄-단백질 복합체가 있음을 발견했습니다10,11. 유사하게, Jahnen-Dechent et al. 는 석회화성 복막염 환자의 복수에서 칼슘 단백질 입자(CPP)라고 하는 fetuin-A 함유 미네랄 복합체가 검출될 수 있음을 관찰했습니다12. Bertazzo et al.의 최근 연구. 죽상 동맥 경화증 및 류마티스 열 환자의 대동맥 판막과 관상 동맥에서 미네랄 NP의 존재를 입증했습니다. 미네랄 입자의 형성에 대한 연구는 일반적으로 인간의 심혈관계에 초점을 맞추었지만 입자가 다른 조직에서 발견될 수 있는지 여부와 이러한 물질이 건강이나 질병에 역할을 하는지 여부는 여전히 불분명합니다.
우리는 이전에 미네랄-유기 NPS가 인간과 동물의 체액에서 자발적으로 형성된다는 것을 관찰했습니다. 이 미네랄 나노입자는 처음에 나노박테리아(NB)로 기술되었으며 지구상에서 가장 작은 세포29 뿐만 아니라 알츠하이머병, 죽상동맥경화증, 암,신장결석형성, 다낭성신장질병, 전립선염30-32. 그러나 우리의 결과는 NB가 실제로 형태, 성장, 증식 및 하위 배양 측면에서 일반적인 박테리아를 모방하는 무생물 미네랄 NP임을 보여주었습니다. 소위 NB와 유사한 광물 입자가 인간 조직에서 발견될 가능성과 이러한 입자가 질병에서 역할을 하는지 여부는 여전히 조사되어야 합니다.
본 연구에서 우리는 질병에 걸린 인간의 미네랄-유기 나노입자를 검출하고 분석하기 위한 나노물질 접근법을 개발했습니다.신장조직. 우리는 말기 만성 신장 질환 및 신장암 환자의 신장 조직이 시험관 내 체액에서 자발적으로 침전되는 생체모방 미네랄 입자와 유사한 다중층 미네랄 NP를 포함한다는 것을 보여줍니다. 우리의 결과는 이러한 미네랄-유기 입자의 생화학적 구성, 형성 메커니즘 및 생물학적 기능에 관한 중요한 통찰력을 보여주고 인체에서 이소성 석회화 및 질병의 시작 메커니즘에 대한 정보를 제공합니다.
결과
우리는 말기 만성 신장 질환(n=2) 또는 신장암(n=18)이 있는 인간 환자로부터 외과적으로 제거된 신장 조직을 조사했습니다. 표 1 참조. 신장암 샘플의 경우 비 - 조직의 암성 부분). 건강한 대조군으로서 우리는 외상이나 혈종이 있지만 이전에 비정상적인 신장 기능이 없었던 환자로부터 얻은 신장 생검을 연구했습니다(n=2, 표 1).
건강한 개인의 신장 조직은 정상적인 조직학적 특징을 보였고 von Kossa 염색 후 이소성 석회화는 관찰되지 않았습니다(그림 1A, B). 반면에, 질병에 걸린 개인에게서 얻은 신장 조직을 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색한 결과 조직 손상의 증거가 나타났으며(그림 2A-C, 화살표로 표시됨) 검사된 질병 조직의 80%가 다음과 같이 광물화된 침전물을 보여주었습니다. von Kossa 염색(그림 1C-T, 그림 2E, F, 석회화는 검은색 화살표로 표시된 검은색 물질로 볼 수 있음, 표 1 참조). 원위 세뇨관, 근위 세뇨관, 집합관 및 Henle 루프를 둘러싼 세포외 공간, 그리고 세관과 덕트를 묘사하는 세포의 세포질을 포함하여 피질과 수질에서 석회화된 침전물이 관찰되었습니다(그림 1C-T 및 그림 2E, F). 신소체에서는 석회화가 발견되지 않았다(Fig. 2D).
광물 침전물의 성질을 조사하기 위해 투과전자현미경(TEM)으로 관찰할 수 있는 초박형 신장 절편을 준비했습니다. 미세한 무기물 침전물이 포함된 검체에서 신상피세포의 세포질, 기저막 아래의 세포외 기질, 근위 및 원위 세뇨관 내강 내에서 광물 입자 또는 과립이 검출되었다(그림 3A, B, 입자가 확대됨). 패널 A1–A4 및 B1–B4). 미네랄 NP는 Henle 루프와 집합관을 감싸는 세포 내에서도 관찰되었습니다(그림 3C, D, 패널 C1, C2 및 D1에서 확대). 일부 입자는 신장 세포의 세포내 소포 내에서 발견되었습니다(그림 3A, 패널 A1 및 A2). 여기에 사용된 전자 현미경 접근 방식을 통해 광물 입자의 내부를 시각화할 수 있었습니다. 일부 입자는 빛의 전자 투과성 층과 교대로 전자 밀도가 높은 고리를 가지고 있습니다(그림 3A, 패널 A3 및 A4, 그림 3C, 패널 C1). 직장 혈관(신장의 직선 동맥)과 같은 여러 혈관은 많은 수의 미네랄 NP로 둘러싸여 있습니다(그림 3D, 패널 D1). 따라서 미네랄 NP는 이소성 석회화의 징후를 나타내는 모든 인간 신장 조직의 다양한 위치에서 발견되었지만 검사된 건강한 대조군에서는 입자가 발견되지 않았습니다.
신장 조직에서 발견되는 미네랄 입자는 이전 연구에서 체액에서 자발적으로 형성되는 것으로 설명된 미네랄-유기 나노입자와 매우 유사한 것으로 보입니다. 이 가능성을 확인하기 위해 이전에 설명한 대로 침전 방법을 사용하여 광물성 유기 나노입자(또는 바이온)를 준비했습니다. 이 방법은 칼슘 및 인산염과 같은 침전 이온을 인간 혈청(HS)과 같은 체액이 포함된 세포 배양 배지(Dulbecco의 변형 독수리 배지 또는 DMEM)에 첨가한 다음 세포 배양 조건에서 배양하는 것으로 구성됩니다(방법 참조). 이러한 방식으로 생성된 입자(HS-NPS)는 구형 또는 타원형이었고 매끄럽거나 결정질인 광물 표면을 보여주었습니다(그림 4A-E). 이는 이전에 체액22,23 및 인간 복수12에서 설명한 입자와 유사합니다. 석회화된 동맥13. 미네랄 입자는 전체 형태, 다층 구조 및 표면 특성 측면에서 신장 조직에서 관찰되는 미네랄 NP 또는 과립과 매우 유사했습니다(그림 4F-J). HS 유래 입자와 신장 과립의 크기도 비슷했으며 직경이 50~1,500nm로 다양했습니다(그림 4A-E,F-J). 위에서 언급한 바와 같이 일부 신장 과립은 지질막으로 둘러싸여 있으며 아마도 세포내 화물 소포 또는 세포외막 소포를 나타낼 수 있습니다(그림 4H,I, 막은 화살표로 표시됨). 이러한 막 구조는 시험관 내에서 준비된 HS-NP 표본에는 없었습니다(그림 4A-E). 이러한 관찰은 신장 과립이 혈청에 조립된 무기질-유기 나노입자와 유사함을 시사합니다.
선택된 영역 전자 회절 분석을 사용하여 우리는 시험관 내에서 준비된 HS-NP의 광물상이 다결정질 나노물질로 구성되어 있음을 관찰했습니다(그림 4E, 삽입, 희미한 동심원에 주목). 이전 연구에서 설명한 대로 신장 과립(그림 4J, 삽입)과 뼈 및 이소성 석회화에 대해 유사한 결과가 얻어졌습니다.
우리는 에너지 분산 X선 분광법(EDX)을 사용하여 HS-NP와 신장 과립의 화학적 조성을 연구했습니다. HS-NPs는 인산칼슘 광물의 존재와 일치하는 탄소(C), 칼슘(Ca), 산소(O) 및 인(P)의 주요 피크를 나타냈다(그림 4K). 실리콘(Si)의 낮은 피크는 HS-NP에서도 관찰되었으며(그림 4K), 아마도 작은 입자 구성요소를 나타낼 수 있습니다. 신장 과립은 또한 규소 및 철(Fe)의 추가 피크와 함께 인산칼슘 광물을 나타내는 탄소, 칼슘, 산소 및 인의 피크를 나타냈다(그림 4L). 우라늄 피크(U)는 샘플 준비 동안 대조 시약으로 사용된 우라닐 아세테이트에 기인합니다(신장 과립과 같은 광물 입자의 일부 샘플에는 우라늄이 존재하고 그림 4M의 대조군 조직에는 우라늄이 존재하지 않는 것은 높은 이전에 보고된 바와 같이 인산염에 대한 우라늄의 친화도35). 입자를 둘러싼 신장 조직의 대조 EDX 스펙트럼은 탄소와 산소의 피크를 보여(그림 4M), 칼슘과 인이 주로 광물 입자에서 발견되었음을 시사한다.
HS-NPs와 신장 과립의 칼슘:인(Ca:P) 비율은 0.65에서 1.18까지 다양했습니다. 이 비율은 화학량론적 수산화인회석에서 관찰된 이론값 1.67과 다르지만 다양한 결정화도에서 관찰된 인산칼슘 및 인회석 결정에서 이전에 관찰된 범위 내에 여전히 있습니다. 함께, 이러한 발견은 신장 과립이 인산칼슘 나노입자로 구성되어 있음을 확인시켜줍니다.
다양한 단백질이 신체에서 전신적 방식으로 이소성 석회화를 억제하는 것으로 밝혀졌습니다36,37. 또한 합성 NP의 표면에서 발견되는 단백질 코로나는 생체 내에서 세포에 대한 입자의 생체 분포 및 영향을 결정하는 것으로 믿어집니다38,39. 한편, 인간의 신장 조직에서 발견되는 무기질-유기 나노입자의 단백질 구성은 아직 완전히 이해되지 않고 있습니다. 우리는 이전에 알부민, 페투인-A 및 아포지단백질-A1(apo-A1)이 체액에서 형성된 무기질-유기 나노입자와 상호작용하는 주요 단백질을 나타낸다는 것을 발견했습니다. 여기에서 우리는 면역 골드 라벨링을 사용하여 신장 과립 내에서 이러한 단백질의 존재 및 미세 구조적 위치를 조사했습니다.
인간 혈청 알부민(HSA), 인간 혈청 페투인-A(HSF), 인간 apo{1}}A 및 전체 HS에 대한 폴리클로날 항체를 사용하여 HS-NP 및 신장 과립에서 혈청 단백질의 존재를 조사했습니다. 다클론 항체(앞서 설명한 대로 준비됨25)의 특이성은 웨스턴 블롯팅을 사용하여 확인되었습니다(그림 5). 각각의 다클론 항체는 시험관 내에서 준비된 HS-NP 및 인간 신장 조직에서 발견되는 미네랄 과립과 긍정적으로 반응했습니다(그림 6A, B, 패널 A1-A3 및 B1-B3, 검은 점). 항체는 주로 전자 밀도 층 또는 HS-NP 및 신장 과립의 어두운 코어와 반응하여 이러한 어두운 영역이 전자 투과 영역에 비해 더 높은 수준의 단백질을 포함할 수 있음을 나타냅니다. 1차 항체 없이 수행된 음성 대조군은 반응을 일으키지 않았습니다(그림 6A, B, 패널 A4 및 B4, 대조군). 우리는 신장 과립이 형태 및 미네랄 구성뿐만 아니라 혈청에 존재하는 주요 석회화 억제제에 대한 결합을 기반으로 하여 HS-NP와 유사한 미네랄-유기 나노입자를 나타낸다고 결론지었습니다.
면역형광 현미경을 사용하여 병든 인간의 신장에서 HSA 및 HSF를 함유하는 미네랄 과립의 존재를 확인했습니다. 이 기술을 사용하여 인간의 신장 조직은
신세뇨관을 둘러싸고 있는 간질과 세뇨관 묘사 세포의 세포질을 포함하는 다양한 영역에서 두 단백질에 대한 양성 염색(그림 7A, 패널 A1 및 A2). 알부민과 페투인-A를 모두 포함하는 단백질 응집체도 단일 단백질의 염색에 비해 적은 양이지만 이 영역에서 관찰되었습니다(그림 7A 및 패널 A3, 병합된 염색은 노란색). 특히, 우리는 면역형광에 의해 검출된 단백질 염색이 von Kossa 염색을 사용하여 관찰된 이소성 석회화 패턴과 밀접하게 겹친다는 것을 알아차렸습니다(그림 7A,B, 석회화는 B에서 화살표로 표시된 검은색 물질로 보입니다). 이러한 결과는 검사된 인간 신장 조직에서 무기질-유기 입자의 존재에 대한 추가 지원을 제공합니다.
논의
합성 나노입자와 인간 세포 사이의 상호작용에 대한 이해는 발전했지만 체액에서 자발적으로 형성되는 무기물-유기 나노입자의 영향에 대해서는 훨씬 덜 알고 있습니다. 우리의 이전 연구는 칼슘과 인산염의 농도가 포화를 초과할 때 이러한 입자가 생물학적 유체에서 형성된다는 것을 보여주었습니다15,16. 우리는 또한 이러한 입자가 면역 세포에 의해 내재화되지만 큰 입자만이 전-염증성 면역 반응을 유도한다는 것을 관찰했습니다. 그러나 이들 입자의 인체 조직 내 분포와 체내에서 생리적 또는 병리학적 역할을 하는지 여부는 지금까지 조사되지 않았다.
현재 연구에서 우리는 말기 신장 질환 또는 신장암으로 고통받는 인간 환자의 신장에서 광물유기 나노입자를 처음으로 검출했습니다. 검출된 무기질-유기 나노입자에는 뼈의 무기질과 유사하게 결정화되지 않은 인산칼슘과 체액에서 전신 석회화 억제제로 작용하는 알부민, 페투인-A 및 아포-A1이 포함되어 있습니다. 우리의 결과는 혈관 조직과 체액에서 미네랄 단백질 복합체의 존재를 설명하는 이전 보고서와 일치합니다12,13,34,40. 우리가 관찰한 입자는 미세한 석회화가 없는 영역에서 발견되었기 때문에 우리의 관찰은 입자가 인간 조직에서 이소성 석회화의 전구체를 나타낼 수 있음을 시사합니다. 미네랄-유기 나노입자가 우리의 이전 연구에서 설명한 대로 유리한 조건에서 점차적으로 크기가 커지고 입자에서 필름으로 전환될 가능성을 감안할 때, 여기에 제시된 관찰은 미네랄 전구체가 더 큰 입자의 형성으로 이어질 수 있음을 시사합니다. Randall의 플라크 및 신장 결석과 같은 생체 내 광물 침전물.
미네랄 이소성 석회화와 미네랄-유기 나노입자가 신장의 다양한 해부학적 구조에서 발견된다는 우리의 관찰은 이 기관에서 이소성 석회화의 이전 발견과 일치합니다. Evan et al.의 관찰은 신결석 환자의 신장에서 광물화가 시작되고 Henle 루프의 간질 조직에서 주로 발생할 수 있음을 나타냅니다40,42. 이 저자들은 이 영역에 형성되는 광물 침전물이 요로피의 기저부에서 돌출되어 신장 결석을 형성할 수 있음을 관찰했습니다. 우리의 관찰에 따르면 Henle의 고리 외에도 다른 신장 영역에 미네랄 NP가 포함될 수 있으며 이는 결국 인간의 신장에 큰 미네랄 침전물을 형성하도록 진화할 수 있습니다. 우리는 또한 혈액 순환에서 형성되는 미네랄 NP가 신장 조직으로 이동하여 신장에서 이소성 석회화 및 결석 형성을 유발할 가능성을 조사하고 있습니다.
본 연구에서 검출된 여러 신장 과립은 세포내 또는 세포외 소포 내에서 발견되며(그림 4H, I), 이는 뼈와 치아에서 석회화를 유도하는 것으로 나타난 기질 소포와 유사합니다7,8. 우리는 최근 인간 및 동물 혈청에서 분리된 소포가 시험관 내에서 미네랄 NP 및 미세한 침전물의 형성을 유도한다는 것을 관찰했습니다. Schlieper et al.34은 또한 동맥에서 발견되는 광물 입자가 막 구조와 연관되어 있음을 관찰하고 기질 소포 또는 세포 사멸체가 이러한 조직에서 광물 입자의 핵자를 나타낼 수 있다고 제안했습니다. 유사하게, Khan et al. 는 특발성 신장 결석이 있는 인간 환자의 신장에서 발견되는 인산칼슘 침착물이 콜라겐 섬유 및 기질 소포와 관련이 있다고 보고했습니다. 이러한 결과는 신장 조직에서 검출된 무기물-유기 나노입자가 동맥경화성 동맥에서 관찰되는 것과 유사한 상황인 막 소포를 포함하는 메커니즘을 통해 형성될 수 있음을 시사합니다. 한편, 최근 연구에 따르면 여성 유방 동맥에서 발견된 이소성 석회화는 골형성 또는 세포 사멸 세포 마커43와 관련이 없었으며, 이는 석회화 기전이 관련된 기관 또는 생물학적 맥락에 특이적일 수 있음을 시사합니다. 또한, 여기에 설명된 것과 같은 무기물-유기 NP는 이온(예: 칼슘 및 인산염) 및 석회화 억제제(예: 알부민, 페투인-A 및 아포)의 생리학적 농도를 유지하지 못하기 때문에 형성될 수도 있습니다. -A1) 인간의 체액에서.
우리의 결과는 무기물-유기 나노입자의 전자 밀도 층과 코어가 입자의 전자 투과 영역에 비해 더 높은 수준의 단백질과 유기 분자를 포함할 수 있음을 시사합니다(그림 6A, B). 이러한 전자 밀도 층은 TEM에서 이 물질의 결정질 특성으로 볼 때 광물화된 것으로 보입니다(그림 4A-J 참조). Ryall41과 Evan et al.44를 포함한 다른 저자들은 전자 투과층이 광물을 나타내는 반면 전자 밀도 층은 유기 분자에 해당할 수 있다고 제안했습니다. 이러한 해석은 적어도 부분적으로 각 연구에서 샘플이 처리되고 검사된 방식과 사용된 시작 조직의 특성 때문일 수 있습니다.
무기질-유기 입자는 이소성 석회화에 역할을 하는 것 외에도 신장 조직에 염증을 유발할 수 있습니다. 우리는 최근에 무기물-유기 NP가 인간 대식세포에 의한 전염증성 인터루킨{3}}의 분비를 유도하지 못하는 반면, 1 μm보다 큰 무기물 응집체는 그렇게 할 수 있음을 보여주었습니다23. 결정질 물질에 대한 반응으로 인터루킨-1의 방출은 인플라마솜(inflammasomes)이라고 하는 세포 내 분자 복합체의 활성화에 의존하는 것으로 나타났습니다45-47. 또한, 종양이 있는 신장에서 미네랄 입자가 검출되었으며 암과 염증 사이의 연관성이 이제 잘 알려져 있습니다48. 응집된 미네랄 입자가 인플라마좀을 활성화하고 신장이나 다른 조직에서 염증과 암의 발병에 기여할 가능성은 아직 조사되지 않았습니다.
이소성 석회화 외에도 여기에 설명된 미네랄 과립은 다른 질병 과정에 참여할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 이전에 미네랄 NP가 체액의 다양한 단백질에 결합하여 체액에서 이러한 유기 분자를 고갈시킬 수 있다고 제안했습니다. 반면에 인체는 석회화 억제제와 세망내피계(즉, 대식세포)의 존재에 의존하여 정상적인 상황에서 무기질 나노입자의 형성 및 축적을 방지할 수 있습니다. 따라서 미네랄 NP는 전신 또는 국소 칼슘 항상성이 교란되고 인체에서 보호 메커니즘이 실패한 경우에만 축적될 수 있습니다.
우리는 여기서 개발된 나노물질 접근법이 동물 및 인간 조직에서 무기물-유기 나노입자의 형성을 연구하는 데 사용될 수 있다고 제안합니다. 예를 들어, 알부민, 페투인-A 및 아포-A1과 같은 석회화 억제제 단백질에 대해 생성된 항체는 동물 모델의 조직에서 무기질-유기 NP의 형성을 감지하고 특성화하기 위해 무기물 분석과 함께 사용할 수 있습니다. 이 접근법을 사용하여 얻은 결과는 체내 미네랄 입자 형성 및 이소성 석회화 상태를 반영하는 생물학적 매개변수를 식별하기 위해 인체 체액에 대한 임상 측정에 적용할 수 있습니다. 우리는 이 지식이 이소성 석회화와 관련된 인간 질병 및 상태를 예방하고 치료하기 위한 새로운 치료 전략의 개발로 이어질 수 있기를 기대합니다.
행동 양식
신장 조직.인간 조직의 사용과 이 연구에서 수행된 실험은 Chang Gung Memorial Hospital의 Institutional Review Board의 승인을 받았습니다. 방법과 실험은 승인된 지침에 따라 수행되었습니다. 환자로부터 서면 동의를 얻었습니다. 대조군의 건강한 신장 조직은 신장 질환의 병력이 없는 외상 및 혈종 환자의 생검에서 얻었습니다(n=2). 신장 조직은 또한 신장암 환자(n=20)와 이식 수술 중 신장이 제거되거나 생검된 말기 신장 질환 환자(n=2)로부터 얻었습니다(표 1). 신장암 조직의 경우 조직의 비암성 부분을 절개하여 본 연구에서 분석하였다.
조직학적 분석.신장 조직은 파라핀 블록에 장착되었습니다. 블록을 절단하고 조직 조각을 핫 플레이트에서 70도에서 30분 동안 가열하여 파라핀을 제거했습니다. 절편을 신선한 자일렌 용액에 15분 동안 3회 담가 남아 있는 파라핀을 완전히 제거했습니다. 섹션은 매번 5분 동안 95%, 80% 및 70% 에탄올로 재수화되었습니다. 재수화된 표본을 5분 동안 이중 증류수(ddH2O)로 세척했습니다. 세포 핵을 8분 동안 헤마톡실린으로 염색하였다. 따뜻한 물로 10분 동안 표본에서 염료를 제거했습니다. 신장 표본을 ddH2O로 헹구고 95% 에탄올에 10회 담그었습니다. 에탄올 처리된 표본은 1분 동안 eosin Y로 대조염색되었습니다. 표본은 매번 10분 동안 95% 및 100% 에탄올로 탈수된 후 자일렌에서 10분 동안 탈수 단계가 뒤따랐습니다. 최종 탈수된 신장 표본을 50% 글리세롤이 포함된 유리 슬라이드에 올려 놓고 디지털 카메라가 장착된 광학 현미경으로 관찰했습니다.
파라핀을 제거하고 재수화된 표본을 H&E 염색에 대해 설명한 대로 준비했습니다. 재수화된 부분을 질산은(5%)으로 염색한 다음 20분 동안 자외선에 노출시켰습니다. 용액을 ddH2O로 15분 동안 세척하였다. 섹션을 5분 동안 티오황산나트륨(5%)으로 염색한 다음 ddH2O로 15분 동안 세척했습니다. 섹션을 5분 동안 핵 패스트 레드(Sigma-Aldrich, St. Louis, MI)로 염색했습니다. 염색된 표본을 각각 10분 동안 95% 및 100% 에탄올로 연속적으로 탈수한 후 크실렌에서 10분 동안 탈수시켰다. 신장 표본을 유리 슬라이드에 장착하고 위에서 설명한 대로 검사했습니다.
전자 현미경 및 EDX 분석.신장 샘플은 LGPS 해부 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 두께 1mm 미만의 작은 조각으로 절단되었습니다. 조직을 4도에서 밤새 0.1M 카코딜레이트 완충액에 2.5% 글루타르알데히드 및 1% 파라포름알데히드로 고정했습니다. 고정된 샘플은 10분 동안 얼음 위에서 8% 자당(pH 7.2)의 1M 카코딜레이트 완충액으로 3회 세척되었습니다. 세척된 조직을 1% 사산화 오스뮴 및 1.5% 페로시안화칼륨을 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS; 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4)에서 얼음 위에서 2시간 동안 인큐베이션했습니다. 조직을 얼음 위에서 ddH2O로 10분 3회 세척했습니다. 세척된 조직은 얼음 위에서 ddH2O로 3회 세척하기 전에 1시간 동안 ddH2O에 1% 우라닐 아세테이트로 얼음 위에서 염색되었습니다. 신장 조직은 30, 50, 70, 80 및 90% 에탄올로 매번 10분 동안 탈수되었으며, 에탄올이 70%에 도달한 경우를 제외하고는 샘플을 4도에서 밤새 보관하였다. 조직은 5분 동안 95% 에탄올로 탈수하기 전에 15분 동안 95% 에탄올 중 1% 인텅스텐산으로 염색되었습니다. 시편을 40, 57, 67, 100% 에탄올에 각각 10분간 담그고 100% 프로필렌 옥사이드에 5분간 담가 두었습니다. 신장 조직은 매번 1시간 동안 50, 70 및 100% Eponate 812(Ted Pella, Redding, CA)로 침윤되었습니다. Eponate 812-포매된 신장 샘플은 100% Eponate에 두 번 배양하여 준비했습니다. 매립된 샘플을 60도 오븐에서 밤새 인큐베이션하여 수지 중합을 허용했습니다.
상기와 같이 얻은 세척된 HS-NP 펠릿을 4도에서 4시간 동안 ddH2O에서 글루타르알데히드(2.5%) 및 파라포름알데히드(1%)로 고정하였다. 고정된 펠렛은 매번 10분 동안 ddH2O로 3회 세척되었습니다. 펠렛은 30, 50, 70, 80, 90, 95 및 100% 에탄올에서 10분씩 연속 배양하면서 탈수되었으며, 에탄올이 70%에 도달했을 때를 제외하고는 펠렛을 4도에서 밤새 보관했습니다. 다른 에탄올 용액은 펠릿과 10분 동안만 접촉시켰다. 탈수된 펠렛은 각각 30분 동안 에탄올과 LR 배지(3:1, 1:1 및 1:3)의 다른 비율을 사용하여 LR 백색 포매 배지(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)로 침투되었습니다. 펠렛을 중합 전에 밤새 새로운 LR 배지(100%)로 침윤시켰다. LR 배지로 침윤된 펠렛을 60도 오븐에서 2일 동안 인큐베이션하여 수지 중합을 허용하였다. Reichert Ultracut S 마이크로톰(Leica, Wetzlar, Germany)을 사용하여 신장 및 HS-NP 블록을 절단하여 두께 70-100 nm의 슬라이스를 생성했습니다. 조직 섹션은 100kV에서 작동되는 JEM 1230 투과 전자 현미경(JEOL, Tokyo, Japan)으로 가시화되기 전에 4% 우라닐 아세테이트로 염색되었습니다. 동일한 시스템을 사용하여 전자 회절 패턴을 얻었다. 니켈 그리드가 지지체로 사용되었습니다.
EDX 분석을 위해 신장 조직의 얇은 부분을 uranyl acetate로 염색하고 위와 같이 ddH2O로 세척한 후 전자 데시케이터 캐비닛에서 건조시켰다. 표본은 120kV에서 작동되는 고해상도 JEM 2100 투과 전자 현미경(JEOL)에서 관찰되었습니다. EDX 스펙트럼은 INCA Energy EDS 시스템(Oxford Instruments, Abingdon, UK)을 사용하여 삼중으로 얻었다. HS-NP의 얇은 부분은 염색 없이 관찰되었습니다.
무기질 유기 NP의 준비.모든 출발 용액을 pH 7.4로 조정하고 사용 전에 0.2μm 막을 통해 여과하여 멸균했습니다. HS는 기존의 정맥 천자 기술을 사용하여 건강한 인간 지원자로부터 얻었습니다. 이 연구에서 인간 생물학적 유체의 사용은 Linko Chang Gung Memorial Hospital의 Institutional Review Board의 승인을 받았으며 자원 봉사자로부터 서면 동의를 받았습니다. HS-NP는 10% HS를 함유하는 DMEM(Gibco, Carlsbad, CA)에 각각 3mM CaCl2 및 Na2HPO4를 첨가한 후 세포 배양 조건(37도, 5% CO2, 가습 공기)에서 1주일 동안 배양하여 제조하였다. 입자를 4도에서 15분 동안 16,{14}} xg에서 원심분리하여 펠렛화하고 동일한 원심분리 절차를 사용하여 HEPES 완충액(20mM HEPES, 1mM CaCl2, 2mM Na2HPO4, 150mM NaCl)으로 두 번 세척했습니다.
SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅.SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석은 본질적으로 이전과 같이 수행되었습니다. 간단히 말해서, 0 HS 단백질 .2ug(그림 5A,D) 또는 1.2ug(그림 5B,C), 47ug(그림 5A,B,D) 또는 59{13}}ug HS-NP 단백질(그림 5C), 0.1ug의 HSA(그림 5A-D), 0.6ug(그림 5A, C, D) 또는 {{23} }.15ug의 HSF(그림 5B)를 5x "로딩 버퍼"(0.313 M Tris-HCl pH 6.8, 10% SDS, 0.05% 브로모페놀 블루, 50% 글리세롤, 12.5%)에 용해했습니다. mercaptoethanol)을 1x의 최종 농도로 만들고, 5분 동안 95도에서 가열하고 미니-겔 시스템(Hoefer, Holliston, MA)을 사용하여 10% SDS-PAGE에서 변성 및 환원 조건 하에 분리합니다. NP 대조군(그림 5A-D의 레인 1에서 사용)은 DMEM(최종 부피 1ml)에 각각 3mM CaCl2와 Na2HPO4를 첨가한 다음 세포 배양 조건에서 하루 동안 배양하여 준비한 미네랄 NP로 구성되었습니다. 입자를 15분 동안 16,{49}} xg에서 원심분리하여 펠렛화하고, HEPES 완충액으로 2회 세척하고, 50ul의 HEPES 완충액에 재현탁시켰다. 재현탁된 입자 20ul의 분취량을 위와 같이 SDS-PAGE에 대해 처리했습니다. PVDF 멤브레인은 실온에서 5%(w/v) 탈지 우유에서 1시간 동안 차단되었습니다. 앞에서 설명한 대로 사내에서 생성된 1차 항체25를 1:1,{60}}(-apo-A1 및 -HS-NP), 1:3,{68}}(-HSF)의 희석으로 사용했습니다. , 또는 1:6,000 ( -HSA). 염소 항-토끼 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 이차 항체는 제조사(Millipore, Billerica, MA)가 제공한 지침에 따라 사용되었습니다. 얼룩은 향상된 화학발광(Amersham Biosciences, Amersham, UK) 및 자동 방사선 사진 필름을 사용하여 밝혀졌습니다.
면역 골드 라벨링.TEM 관찰을 위해 샘플을 준비했습니다. HS-NP 블록은 두께가 70 nm 미만인 조각으로 절단되었습니다. 그리드의 샘플 섹션은 0.1M HEPES 완충액(pH 8.0)에서 1% 생선 젤라틴(Sigma)으로 25분 동안 차단되었습니다. 그리드를 다음 1차 항체와 함께 인큐베이션했습니다: -HSA, 1:30; -HSF, 1:50; -아포-A1, 1:30; -HS-NP, 1:60. 음성 대조군에는 1차 항체가 포함되지 않았습니다(HEPES 완충액 중 1% 생선 젤라틴). 인큐베이션된 섹션을 15분 동안 HEPES 완충액으로 헹구었습니다. HEPES 완충액에서 1% 생선 젤라틴으로 헹군 부분을 20분 동안 차단했습니다. 표본은 1시간 동안 2차 5-nm-gold-conjugate 염소 항토끼 IgG로 처리되었습니다. 시편은 10분 동안 ddH2O로 세척하기 전에 HEPES 완충액으로 10분 동안 세척되었습니다. TEM 관찰은 위와 같이 수행하였다.
형광현미경.상기와 같이 제조된 조직학적 신장 조직 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 1% 소 혈청 알부민으로 차단하였다. 슬라이드를 1:4 희석액의 1차 다클론 항체와 함께 배양했습니다.000. 세척 단계 후, 샘플을 1:100에서 2차 항체 염소 항-토끼-FITC(492/520nm) 및 염소 항-토끼-TRITC(550/570nm)(Jackson Immuno Research, West Grove, PA)와 함께 인큐베이션했습니다. 1시간. 복합체를 PBST로 15분 동안 세척했습니다. 형광염색 4',{18}}디아미디노{19}페닐인돌(DAPI)을 10ug/ml에서 15분 동안 사용했습니다. DAPI로 염색된 표본을 95% 에탄올과 100% 에탄올로 각각 10분씩 탈수한 후 자일렌에서 10분 더 탈수시켰다. 탈수된 신장 표본을 Vectashield 형광 H{27}} 장착 배지(Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 장착하고 Spot Flex 카메라가 장착된 공초점 현미경(LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰했습니다.
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