식이 요법은 면역 병리학 및 신장 손상의 중증도에 상당한 영향을 미칩니다

연락처: emily.li@wecistanche.com

존 E. 브루스 외

추상적인: 

'식이 요법은 전 세계적으로 이환율과 사망률에 대한 주요 원인 위험 요소이지만 전임상 동물 연구의 설계에서는 거의 고려되지 않습니다. 미국인들에게 보고된 몇 가지 영양 부족은신장건강; 그러나 원인이 되는 기전은 불분명하고 주로 당뇨병이나 고혈압의 발병에 기인합니다. 여기에서 우리는 식단이 수컷 C57Bl/6 마우스의 신장 손상에 대한 감수성에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 시작했습니다. 생쥐에게 표준 식단, 상업적으로 이용 가능한 "서구식" 식단(WD) 또는 새로운 미국식 식단(AD)을 12주 동안 먹였습니다.신장부상엽산 신병증(FAN) 또는 일측성 신장 허혈-재관류 손상(uIRI) 모델을 사용합니다. FAN에서 WD와 AD를 먹인 쥐는 음식을 먹인 쥐에 비해 조직 손상에 대한 더 나쁜 조직학적 증거와 신독성과 관련된 유전자의 더 큰 신장 발현을 보였습니다. 알츠하이머병을 먹인 쥐는 FAN에 따라 더 심각한 신장 비대가 발생했으며, 유전자 발현 데이터는 FAN에 대한 메커니즘이 식이에 따라 다르다는 것을 시사합니다. 한편, WD를 먹인 마우스는 순환하는 인터루킨{1}} 농도가 가장 높았습니다. uIRI에서는 식이 요법 간에 신장 조직 손상에 차이가 관찰되지 않았습니다. 그러나 WD와 AD를 먹인 마우스는 억제된 염증 반응의 증거를 나타냈다. 종합하면, 우리의 데이터는 식이 요법이 질병의 중증도와 병태생리에 직접적인 영향을 미친다는 가설을 뒷받침합니다.신장질병기계적 전임상 동물 연구에서 고려해야 할 중요한 실험 변수입니다.

키워드: 서양식; 생쥐; 심각한신장부상; 식이 품질; 영양물 섭취

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1. 소개

라이프스타일은 전반적인 건강에 대한 주요 기여자이며 유전적 위험에 관계없이 심혈관 질환(CVD)의 결과에 상당한 영향을 미칩니다[1]. 식이는 생활 방식의 주요 구성 요소이며, 전 세계적으로 이환율 및 사망률에 대한 상위 30가지 위험 요소 중 8가지 이상을 잘못된 식이 및 식이 관련 질병이 차지합니다[2]. 그러나 영양 부족이 건강에 어떻게 부정적인 영향을 미치는지 설명하는 메커니즘은 놀랍게도 불분명합니다.

영양 연구의 주요 장벽은 기계론적 전임상 동물 연구에서 인간 식이 습관의 복잡하고 다면적인 특성을 부적절하게 모델링하는 데 어려움이 있다는 것입니다. Chow 다이어트는 높은 영양 품질, 저장 안정성 및 상대적으로 낮은 제조 비용으로 인해 전임상 설치류 연구에서 가장 많이 사용되는 식품 공급원입니다. 고품질 오일과 비타민/미네랄 혼합물로 보충된 곡물 기반 혼합물로 구성된 차우 다이어트는 선진국에서 보고된 상대적으로 낮은 영양 품질을 잘 나타내지 못합니다. 이로 인해 다양한 질병 유발 식단이 만들어졌으며 대부분은 선진국의 고열량 섭취에 초점을 맞추고 야생형 동물에서는 비만과 대사 기능 장애를 유발합니다. 비만과 대사 기능 장애는 전 세계적으로 주요 건강 문제로 남아 있지만 현재 상업적으로 이용 가능한 고칼로리 식단은 서구 사회에서 보고된 복잡한 영양 부족에 대한 극단적이고 매우 좁은 관점을 나타냅니다. 주어진 영양소의 생리학적 효과는 종종 다른 영양소(나트륨-칼륨 비율[3,4]와 같은)의 존재와 풍부함에 따라 달라지며 이러한 상호작용은 상업적으로 이용 가능한 질병 유발 식단에서 고려되지 않습니다. 따라서 영양 연구에서 흔히 볼 수 있는 환원주의적 접근이 설치류에서 인간으로 기계론적 데이터의 성공적인 번역을 의도하지 않게 방해했을 가능성이 있습니다.

이 문제를 해결하기 위해 우리는 미국인에게서 보고된 몇 가지 영양 부족을 포함하는 새로운 미국식 식단(AD)을 개발하고 있습니다[5]. AD는 곡물 기반 펠릿과 합성 "단맛 및 짠" 펠릿으로 구성된 2개의 펠릿 식단으로 식이 선호도를 연구하기 위해 개발되었으며 전통적인 고칼로리 설치류 식단의 보고된 부작용을 상쇄할 수 있습니다. ]. 흥미롭게도 알츠하이머병에서 만들어진 몇 가지 영양소 변형은신장건강직접 또는 간접 방식으로 [7-10].신장기능 장애CVD의 주요 원인이며 다음과 같은 식이 유발 질병의 일반적인 결과입니다.당뇨병그리고고혈압. 최근의 분석에 따르면 식이의 질이 좋지 않으면 발병률이 증가합니다.신장부상그리고질병[11]; 그러나 책임이 있는 메커니즘은 여전히 ​​불분명합니다. 따라서 우리는식이 요법이 두 가지 다른 마우스 모델의 신장 손상 결과에 유의미한 영향을 미치는지 확인하기 시작했습니다.

2. 재료 및 방법

2.1. 동물과 다이어트

모든 동물 실험은 Liberty University Institutional Animal Care and Use Committee에서 승인한 프로토콜과 실험 동물의 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었습니다[12]. 젖을 뗀({1}}주령) 수컷 C57Bl/6 마우스를 잭슨 연구소에서 구입하고 옥수수 속대 깔개, 표준 설치류 먹이(Teklad Global 18%, # 2018), 탄소 여과 수돗물. 1-주 순응 기간 후 마우스는 다음 세 가지 식단 중 하나에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. chow(Teklad Global 18%, #2018, n=14) " #TD.88137, n=13) 또는 우리의 소설 "AD"(n=14).

AD는 AD chow(TD.17{16}}651) 및 ADsynthetic(TD.170698 및 TD.170699)이라고 하는 두 개의 펠릿으로 구성됩니다. AD 차우 펠릿은 지용성 비타민(A, D, E)과 불용성 섬유(중성 세제 섬유)가 감소된 변형된 차우 기반 펠릿입니다. 합성 식이요법은 칼륨과 오메가{7}} 다중불포화 지방산을 감소시키면서 과잉 자당, 과당, 포화 지방, 콜레스테롤, 오메가{5}} 다중불포화 지방산, 트랜스 지방산, 나트륨 및 인을 포함하도록 공식화되었습니다. . 트랜스 지방산은 여전히 ​​천연 공급원(예: 쇠고기)에서 소비되기 때문에 제형에 포함되었지만 ADsynthetic pellet에 포함된 것은 다른 이전 연구에서 사용된 것보다 훨씬 낮았습니다[13-16]. 각 영양소의 포함은 미국 농무부의 최근 보고서를 기반으로 한 생쥐와 사람의 실제 섭취량과 권장 섭취량의 백분율 차이(부록 A 표 A1 참조)를 기준으로 합니다[5,12]. 각 펠릿의 영양소 조성은 미국인의 보고 및 권장 섭취량의 계산된 백분율 차이를 기반으로 하고 이 백분율 차이를 마우스 영양소 요구량에 적용했습니다[13]. 그런 다음 각 펠릿의 최종 제형은 AD 합성 및 ADchow 각각 2 및 0.5g의 평균 일일 소비량을 설명하도록 추가로 조정되었습니다. 또 다른 합성 펠릿인 ADsythetic2는 8주 이후의 식단 선호도 변화를 수용하도록 제형화되었으며, 생쥐는 매일 ADchow와 ADsynthetic2를 거의 같은 양(1.5g) 섭취했습니다. 이 연구에 사용된 식단의 요약은 표 1에 나와 있습니다.

2.2. 급성 신장 손상(AKI)의 마우스 모델

마우스는 유도 전 12주 동안 실험 식단을 유지했습니다.신장부상엽산 유발 신병증(FAN) 또는 일측성 허혈 재관류 손상(uIRI) 모델. 이 모델은 문헌에서 일상적으로 사용하고 강력한신장부상용량 의존적 방식으로 [17]. FAN 모델은 수정된 이전 간행물[18-21]을 기반으로 수행되었습니다. 식이 그룹 간의 체중 차이로 인해 우리는 연구에서 가장 작은 마우스(25g)에 대해 25{14}}mg/kg 용량을 계산하고 모든 그룹에 동일한 용량(6.25mg/500µL)을 투여했습니다. 짧은 이소플루란 마취(100% 산소 중 3%, 600mL/분) 하에 있는 마우스. 대조군 마우스(각 식이에 대해 n=4)는 FAN(각 식이에 대해 n=4)을 받은 마우스와 동일한 부피(500µL)의 0.3mM 중탄산나트륨 비히클을 받았습니다. uIRI 모델의 경우 마우스(각 식이에 대해 n=5-6)를 이소플루란으로 마취하고 옆구리를 절개하고 왼쪽 동맥과 정맥신장주변 결합 및 지방 조직에서 분리되어 미세 혈관 클램프로 차단되었습니다. 45분 후 클램프를 제거하고 혈류의 회복을 육안으로 확인하였다. 4.{2}} 실크 봉합사로 근육을 봉합하고 외과용 스테이플로 피부 절개를 봉합했습니다. 표면 체온은 열 램프와 가열 패드를 사용하여 28–30 ºC로 유지되었습니다(정상 표면 체온 ~30ºC). 동물이 의식을 회복하기 시작하면 부프레노르핀(0.1 mg/mL, 100 μL 피하 주사)을 진통제로 투여했습니다.

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2.3. 동물 안락사, 조직학적 분석 및 신장 기능의 혈청 측정

동물은 짧은 이소플루란 마취 하에 경추 탈구에 의해 24시간(uIRI) 또는 48시간(FAN) 후에 안락사되었습니다. 심장을 적출하고 간혈액을 채취하여 실온에서 1분 동안 방치한 다음 2500g에서 1분 동안 원심분리했습니다. 혈청을 수집하고 상업적으로 이용 가능한 분석을 사용하여 크레아티닌(Crystal Chem), 혈액 요소 질소(BUN, Arbor Assays) 또는 인터루킨-6(IL6, Biolegend)에 대해 분석할 때까지 -80℃에서 동결했습니다. 신장을 해부하고 캡슐을 제거하고 중앙 시상 섹션을 10% 인산염 완충 포르말린으로 고정하고 파라핀에 포매하고 5μm 섹션을 절단하고 H&E 또는 Picro Sirius Red(ABCAM)로 염색했습니다. H&E 염색 섹션에서 급성 세뇨관 괴사의 중증도는 0-4 척도를 기반으로 한 실험 설계에 눈을 멀게 한 개인에 의해 평가되었으며, 여기서 (0)은 손상의 증거가 없음을 나타내고, (1)은<25% of="" the="" identifiable="" tissue="" area="" consists="" of="" injury,="" (2)="" 25–50%,="" (3)="" 50–75%,="" and="" (4)="">75퍼센트 . 이전 연구[22]와 유사하게 "세뇨관 손상"은 세뇨관 확장, 단백성 캐스트 및 명백한 세뇨관 간질 리모델링으로 구성됩니다. Picro Sirius 염색 섹션에서 tubulointerstitial fifibrosis의 정도를 평가했습니다.

2.4. 신독성 PCR 어레이

약 30-100mg의 캡슐이 제거된 조각신장조직RNAlater™ 용액(Thermo)에 보관했습니다. FAN 연구에서 각 식이 그룹의 단일 대표 샘플은 각 치료 그룹의 혈청 크레아티닌, BUN 및 조직학 점수에 대한 그룹 평균과 매우 유사한 것으로 선택되었습니다. 그런 다음 선택한 샘플을 처리하여 제조업체(Qiagen)에서 권장하는 RT2 ProfilerTM PCR Array—Mouse Nephrotoxicity(#PAMM-094Z)를 사용하여 신독성과 관련된 84개 유전자의 발현을 정량화했습니다. RNeasy® 키트를 사용하여 total RNA를 분리하고, DNA 절단으로 게놈 DNA를 제거하고, RT2 First Strand Kit를 사용하여 0.5ug의 total RNA를 cDNA 합성에 사용했습니다. cDNA 혼합물을 RT2 SYBR® Green Mastermix 및 뉴클레아제가 없는 물과 혼합한 다음 RT2 플레이트에 적용하고 Lightcycler™ 96 기기(Roche)를 사용하여 권장된 대로 분석했습니다. 각 처리군에 대한 ∆Ct 값은 하우스키핑 유전자의 발현을 기반으로 다음 방정식을 사용하여 계산되었습니다. . 대조군 마우스(비히클 처리가 있는 음식을 먹인 마우스)와 비교하여 발현의 퍼센트 차이를 각 유전자에 대해 계산하였다. FAN과 식단에 의해 잠재적으로 영향을 받는 유전자를 식별하기 위해 제조업체(Qiagen)에서 제공한 분석을 수정했습니다. 대조군 마우스와 2-배 이상의 차이가 있는 유전자가 확인되었으며 이 목록에서 WD와 AD를 먹인 마우스 간에 25% 이상의 차이가 있는 유전자를 확인했습니다. 이 방법을 사용하여 6개의 유전자를 확인하고 이들의 신장 mRNA 발현을 기존의 실시간 RT-PCR을 사용하여 정량화했습니다.

2.5. 신독성, 염증 및 조직 재형성과 관련된 유전자에 대한 RT-PCR

제조업체의 권장 사항에 따라 시판 키트(Qiagen 및 BioRad)를 사용하여 RT-PCR을 위해 신장 및 비장을 처리했습니다. 신독성 또는 백혈구 특이적 마커와 관련된 유전자에 대한 인트론 스패닝 프라이머는 BioRad에서 구입하거나 Primer3 소프트웨어를 사용하여 만들었습니다[23-25]. 프라이머 정보는 부록 C 표 A2에 나와 있습니다. 그런 다음 iTaq Universal SYBR Green Supermix(BioRad)를 사용하여 10 μL RT-PCR 반응을 수행하고 각 유전자에 대한 ∆CT 값을 계산했습니다. 모든 데이터는 각 제어 그룹의 평균으로 정규화되어 표시됩니다.신장부상모델(FAN에 대해 비히클이 주입된 음식을 먹인 쥐 또는 IRI에서 음식을 먹인 쥐의 반대쪽 신장).

2.6. 통계 분석

모든 연구는 완전 무작위 설계를 사용하여 수행되었습니다. FAN 연구에서 "다이어트"와 "치료"는 3가지 수준(식단, WD, AD)을 갖는 "다이어트"와 2가지 수준(차량 또는 FAN)을 갖는 "치료"와 함께 독립 변수였습니다. 유사한 분석이 uIRI 연구에서 사용되었으며, 여기서 "치료"는 허혈성 신장의 유전자 발현 데이터를 비허혈성, 반대측 대조군 신장과 비교함으로써 결정되었습니다. 모든 데이터는 GLM 분석 전에 검토되었으며 이상치는 탐색 기능을 사용하여 식별되고 SPSS(IBM)의 일반 선형 모델 절차를 사용하여 분석되었습니다. 값은 p가 0보다 작거나 같음으로 유의미한 것으로 간주되었습니다.0Tukey Post Hoc 분석에서 5, 경향은 p가 0.1보다 작거나 같음으로 정의되었습니다.

3. 결과

3.1. 잘못된 식단은 FAN의 조직 손상을 악화시킵니다.

WD를 먹인 쥐는 AD를 먹인 쥐에 비해 총 체중(37.4 ± 4.1g)이 가장 컸습니다(30.3 ± 1.{14}}, p=0.{{ 17}}01) 및 사료를 먹인 마우스(26.8 ± 1.1, p < {{2{22}}}}.{24}}01).="" 비만도="" 그룹="" 간에="" 차이가="" 있었는데,="" wd를="" 먹인="" 쥐의="" 부고환="" 지방="" 패드="" 무게가="" 가장="" 높았습니다(2.0="" ±="" {{30}}.6="" g,="" p="">< 0).="" 001)="" 사료를="" 먹인="" 마우스(0.4="" ±="" 0.08,="" p="">< 0.001)="" 및="" ad(0.7="" ±="" 0.3,="" p="">< 0.001)와="" 비교했습니다.="" 알츠하이머병을="" 먹인="" 마우스에서="" 관찰된="" 신체="" 및="" 지방="" 중량의="" 증가는="" 또한="" 음식을="" 먹인="" 마우스에서보다="" 더="" 컸습니다(각각="" p{34}}.001="" 및="" p="">< 0.001).="" 지방="" 조직="" 무게는="" 비히클="" 또는="" fan="" 처리="" 그룹의="" 마우스="" 간에="" 차이가="">

흥미롭게도 AD를 먹인 쥐는 음식을 먹인 쥐(p < {0}}.{11}}01)와="" wd(p="" {{2="" }}.01)="" (표="" 2).="" 신장="" 무게는="" 음식이나="" wd를="" 먹인="" 마우스="" 간에="" 차이가="" 없었고(p="0.1)," 이="" 데이터는="" 체중이="" 공변량으로="" 사용될="" 때="" 일관되었습니다(p="0.52)." 순환="" 크레아티닌(p="">< 0.001)="" 및="" bun(p="">< 0.001)은="" fan에="" 반응하여="" 유의하게="" 증가했지만="" 둘="" 다="" 식이요법에="" 의해="" 유의하게="" 영향을="" 받지="" 않았습니다(각각="" p{13}}.74="" 및="" 0.67).="" 그러나="" 식이요법은="" wd(p="0.001)" 및="" ad(p{19}}.004)를="" 먹인="" 쥐의="" 현미경으로="" 평가한="" 조직="" 손상의="" 심각도에="" 상당한="" 영향을="" 미쳤습니다.="" 먹이를="" 먹인="" 쥐(표="" 2="" 및="" 그림="" 1).="" 신장="" 손상의="" 주된="" 조직학적="" 특징은="" 세뇨관="" 확장과="" 급성="" 세뇨관="" 괴사였으며,="" 이는="" ad="" 및="" wd를="" 먹인="" 마우스의="" 피질="" 전체에="" 걸쳐="" 더="" 심각하고="" 널리="" 퍼졌습니다.="" picro="" sirius="" 염색="" 섹션에서="" 식이군="" 간에="" 신장="" 섬유화증의="" 차이는="" 관찰되지="" 않았습니다(부록="" c="" 그림="" a1).="" fan은="" 순환="" 인터루킨-6(il6)의="" 상당한(p="0.005)" 증가를="" 유발했으며,="" 이는="" ad(p{28}}.01)를="" 먹인="" 마우스와="" 비교하여="" wd로="" 더욱="" 악화되었습니다.="" 차우(p="0.006," 표="" 2).="" 마찬가지로,="" fan은="" 신장="" il6="" mrna="" 발현의="" 급격한="" 증가를="" 일으켰습니다(p="">< 0.001).="" 그러나="" 식이군="" 간에는="" 유의한="" 차이가="" 없었다(p="">

3.2. 식이 요법은 FAN에서 신독성 및 백혈구 특이적 유전자의 신장 mRNA 발현에 상당한 영향을 미칩니다

우리는 다음으로 WD와 AD를 먹인 마우스에서 조직 손상의 악화에 책임이 있는 잠재적인 메커니즘을 확인하기 시작했습니다. 각 식단의 대표적인 샘플을 선택하고 신독성과 관련된 84개 유전자의 발현을 상업적으로 이용 가능한 PCR 어레이를 사용하여 스크리닝했습니다(원시 데이터는 부록 E 표 A3에 나와 있음). 비히클 처리된 먹이를 먹인 마우스와 비교하여, 57개의 신독성 유전자가 FAN으로 발현의 50% 이상 변화를 갖는 것으로 확인되었으며, 이들 중 6개는 식이에 따라 다른 것으로 확인되었습니다(부록 F 표 A4). 신독성 분석으로 확인된 6개의 유전자 중 Btg2(p{8}}.03), Cdkn1a(p{11}}.01) 및 Spp1(p{14}}.001)의 신장 발현은 유의하게 기존의 RT-PCR을 사용하여 결정된 식단의 영향을 받습니다. WD를 먹인 마우스는 chow와 AD를 먹인 쥐에 비해 Btg2와 Spp1의 발현이 더 높았고, AD를 먹인 쥐는 chow와 WD를 먹인 쥐에 비해 Cdkn1a가 더 많이 발현되었습니다(부록 F 표 A4 및 그림 2). . 우리는 또한 4개의 백혈구 특이적 마커(CD3e, CD19, CCR2 및 Ly6G)의 신장 mRNA 발현을 정량화했으며, 이들 모두는 FAN의 영향을 크게 받았습니다(부록 F 표 A4). 그러나 식이 요법은 신장에서 백혈구 특이적 마커의 발현에 유의미한 영향을 미치지 않았습니다.

우리는 이전에 비장이 신장 손상의 면역 병리학에 상당한 영향을 미치는 것으로 나타났습니다[26-28]. 따라서 우리는식이 요법이 FAN에서 동일한 백혈구 특이적 마커의 비장 mRNA 발현을 수정하는지 확인하기 시작했습니다. FAN은 T 세포 마커 Cd3e(p= 0.001) 및 B 세포 마커 Cd19(p < 0.001)의="" 비장="" mrna="" 발현을="" 크게="" 감소시켰습니다(그림="" 3="" 및="" 부록="" f="" 표="" a4).="" 식이와="" 관련하여,="" ad를="" 먹인="" 마우스는="" cd3e(p{13}}.01)="" 및="" cd19(p{16}}.009)의="" 비장="" mrna="" 발현이="" wd를="" 먹이지="" 않은="" 마우스와="" 비교하여="" 더="" 낮았습니다(p{16}}.009).="" 0.2="" 이상).="" 비장="" il6="" 발현에="" 대한="" 식이="" 요법(p="0.8)" 또는="" fan(p="0.1)의" 유의한="" 영향은="" 없었습니다(데이터는="" 표시되지="">

3.3. 식이 요법은 uIRI에서 백혈구 특이적 유전자 발현에 상당한 영향을 미칩니다

FAN 데이터의 일반화 가능성을 평가하기 위해 uIRI 모델에서 식단 연구를 반복했습니다. 식이 치료군 간에 비만도의 유의한 차이에도 불구하고 치료군 간에 수술 시간(~5분)에는 유의한 차이가 없었습니다(p=0.5). 식이요법은 H&E-(p=0.7, 그림 4) 또는 Picro Sirius로 염색된 슬라이드(부록 D 그림 A2)의 정량화에 의해 결정된 바와 같이 조직 손상의 심각도에 영향을 미치지 않았습니다. AD-fed 마우스는 FAN 연구에서 더 큰 신장 무게를 가졌던 반면, uIRI 연구에서는 식단이 신장 무게에 영향을 미치는 경향(p=0.07)만 있었습니다. 비허혈성 반대측 신장에서, 음식을 먹인 마우스는 AD(168 ± 14) 및 WD(186 ± 15)를 먹인 마우스와 비교하여 더 낮은 수치적 신장 무게(160 ± 22 mg)를 보였습니다. 허혈성 신장에서 유사한 수치 경향이 관찰되었는데, 이 경우 음식을 먹인 마우스(173 ± 24 mg) 또는 AD를 먹인 마우스(170 ± 12)가 WD를 먹인 마우스(195 ± 32)에 비해 수치적 신장 무게가 더 낮았습니다. 이러한 데이터는 손상이 있는 신장 무게에 대한 식단의 효과가 사용된 모델에 의존함을 시사합니다.

신장에서 정량화된 모든 신독성 및 백혈구 특이적 유전자는 Cd3e를 제외하고 uIRI에 의해 유의한 영향을 받았습니다(p=0.1, 부록 G 표 A5). 그러나 FAN 연구에서 확인된 신독성 유전자 중 어느 것도 식이에 의해 유의한 영향을 받지 않았습니다. 백혈구 특이적 유전자의 발현과 관련하여, 신장 Cd19 mRNA 발현에 대한 uIRI의 효과는 식이 섭취에 크게 의존했으며(p=0.008), WD 및 AD를 섭취한 마우스는 약 4배 음식을 먹인 마우스와 비교하여 uIRI 후 더 높은 신장 Cd19 발현이 나타났습니다(그림 5). 또한 음식을 먹인 마우스는 uIRI 후 신장에서 Ly6g 발현이 더 큰 경향이 있었습니다(p=0.06, 부록 G 표 A5). 흥미롭게도 WD(p{17}}.006)와 AD(p{19}}.004)를 먹인 쥐는 먹이를 먹인 쥐에 비해 순환 IL6 농도가 현저히 낮았습니다(그림 5).

식이 요법은 Cd19(p=0.{29}}08), Ccr2(p =0.004) 및 Ly6g(p {{7})의 비장 mRNA 발현에 상당한 영향을 미쳤습니다. }.03) uIRI(그림 6 및 부록 G 표 A5)를 따릅니다. 음식을 먹인 쥐는 이 마커의 비장 발현이 가장 높았으며, Ccr2는 WD(p{12}}.02)와 AD(p{14}}.005)를 먹인 쥐보다, Cd19 발현은 먹인 쥐보다 훨씬 더 컸습니다. AD(p=0.007), WD는 아님(p=0.4), 그리고 AD를 먹인 마우스(p=0.04)보다 Ly6g 발현이 더 높고(p=0.04) WD를 먹인 마우스에서 더 큰 발현(p=0.07). WD 또는 AD를 먹인 마우스 간에 백혈구 특이적 마커의 발현에는 차이가 없었습니다(Ccr2, Cd19 또는 Ly6g에 대해 각각 p=0.9, 0.8 및 0.1).

4. 토론

여기, 우리는 전임상 마우스 모델에서 신장 질환의 중증도 및 면역 병리에 대한식이 요법의 영향을 보여주는 데이터를 제시합니다. WD와 AD를 먹인 쥐는 음식을 먹인 쥐에 비해 조직 손상의 정도가 높았고 FAN 후 신독성 유전자의 발현이 차등적이었습니다. AD가 아닌 WD를 먹인 마우스도 FAN 후 IL6의 순환 수준이 상당히 더 높았습니다. uIRI에서 우리는 조직 손상의 심각성 또는 유사한 신독성 유전자의 신장 발현에 대한 식이요법의 유의한 효과를 관찰하지 못했습니다. 그러나 순환 IL{1}}과 WD 및 AD를 먹인 마우스의 신장과 비장에서 백혈구 특이적 유전자의 발현이 유의하게 감소하는 것을 관찰했습니다. 종합하면, 이러한 데이터는 식이 요법이 신장 손상의 두 가지 개별 마우스 모델의 면역 병리학에 상당한 영향을 미친다는 것을 시사합니다.

신장 손상의 결과에 대한식이 요법의 영향을 다루는 연구는 놀랍게도 거의 없습니다. 9주 동안 고지방식이를 먹인 C57Bl/6 쥐는 먹이를 먹인 쥐에 비해 시스플라틴으로 인한 신장 손상이 더 심했습니다[29]. 이 연구에서 시스플라틴의 용량은 체중을 기준으로 했으며 결과적으로 고지방식이 마우스가 시스플라틴의 절대량을 더 많이 받았다는 점에 유의해야 합니다. 이것은 식이 연구에서 일반적인 합병증이며 모든 마우스에 동일한 부피와 절대량의 FA를 투여한 근거였습니다.

식이 요법이 신장 질환의 결과에 미치는 영향을 설명하는 논문은 제한적이지만 설치류에서 신장 손상의 감수성과 진행에 대한 당뇨병의 영향을 설명하는 상당한 문헌이 있습니다[3{14}}-33]. 우리 연구실에서 진행 중인(미공개) 연구에 따르면 WD와 AD를 먹인 쥐는 음식을 먹인 쥐(12kcal/일)에 비해 일일 칼로리 섭취량이 더 높습니다(각각 16kcal 및 15kcal/일). 흥미롭게도, WD를 먹인 쥐만이 인슐린 저항성의 증거를 나타냈으며, 식이 요법 시작 후 빠르면 8주에 공복 저혈당증(12{17}}.3 mg/dL)이 관찰되었고 공복 순환 인슐린이 4배 증가했습니다( 4.2ng/mL) 24주 후. 먹이를 먹인 쥐와 알츠하이머병은 비슷한 시점에서 거의 동일한 공복 혈당(각각 166 및 167 mg/dL)과 인슐린 수준(각각 0.6 및 1.0)을 나타냅니다. 이러한 데이터의 역학을 감안할 때, 우리는 AD가 중등도의 영양 부적절함을 성공적으로 모델링하고 현재 연구 기간 동안 대사 기능 장애가 없다고 생각하는 반면, WD를 먹인 마우스는 인슐린 저항성을 개발할 가능성이 있습니다.

Previous work has shown diabetic mice have altered renal hemodynamics [30], exacerbated inflflammatory response [31,32], and altered expression of cell-cycle regulators [33] following kidney injury. Interestingly, we also observed alterations in the immune response and cell-cycle regulators in both WD- and AD-fed mice. Regarding the immune response, mice fed the WD had greater circulating IL6 concentrations than mice fed chow and the AD. This suggests that the overt obesity and developing metabolic dysfunction that is likely developing in the WD-fed mice exacerbates the immune response in FAN. We did not observe a signifificant increase in renal or splenic mRNA expression of IL6 in either the FAN or uIRI model suggesting another tissue source (perhaps the liver [34]) is responsible. The spleen is a reservoir of deployable leukocytes [35,36] and we have previously shown the spleen to play a signifificant role in the pathophysiology of kidney injury with splenic size being inversely correlated with kidney injury [26–28]. Mice fed the WD and AD had a>비장에서 백혈구 마커의 발현이 30% 감소합니다. 이는 비장에서 백혈구 배치가 증가했기 때문에 해석될 수 있습니다. 이것은 WD와 AD를 먹인 마우스에서 염증이 증가했음을 시사합니다. 그러나 순환하는 IL6 데이터는 WD-fed 마우스에서 이 가설만을 뒷받침합니다. 식이 요법이 FAN의 면역학 및 병태 생리학에 어떻게 영향을 미치는지 더 잘 이해하려면 유세포 분석 및 순환 케모카인 및 사이토카인의 광범위한 특성화에 대한 추가 연구가 필요합니다.

세포 주기 진행의 조절인자와 관련하여 식이 요법은 FAN 후 Btg2 및 Cdkn1a(p21)의 mRNA 발현에도 상당한 영향을 미쳤습니다. 녹아웃 연구는 신장 질환에서 Cdkn1a에 대한 보호 역할을 제안하고([37]에서 검토됨) Btg2 발현은 또한 허혈성에서 증가하지만 반대측 대조군인 신장에서는 증가하지 않는 것으로 나타났습니다[38]. 그러나 신장 손상 및 질병에서 Btg2의 상향 조절의 기능과 중요성은 결정되지 않았습니다. Btg2는 NFκB 및 세포 주기 조절자 p53 및 p19의 다운스트림 이펙터로, 다양한 세포 메커니즘을 사용하여 세포 주기 차단을 유발합니다([39]에서 검토). 함께 현재 문헌은 세포 주기 억제제가 초기 신장 손상을 줄이는 데 유익하지만 더 만성 ​​형태의 질병으로의 후속 진행을 향상시키거나 촉진할 수도 있다고 제안합니다[37,38,40-43]. WD와 AD를 먹인 마우스에서 Btg2와 Cdkn1a의 발현 차이는 병적 비만과 영양 부족이 다른 세포 메커니즘을 통해 신장 손상의 병태생리에 영향을 미치고 다른 장기적 결과를 가질 수 있음을 시사합니다. 또한, Btg2 및 Cdkn1a 발현의 차이는 FAN 모델에서 관찰된 신장 비대에 기여할 수 있습니다. FAN 모델은 급성 신장 비대를 유도하는 것으로 나타났으며[20,21], 알츠하이머병은 식이성 미네랄 성분을 가지고 있어 쥐에서 신장 비대 및 손상을 유도하는 것으로 나타났습니다[44,45]. 따라서 알츠하이머병에서 변경된 미네랄 함량(특히 칼슘과 인)이 FAN에서 신장 비대를 악화시키는 원인이 될 수 있습니다. 이 추측과 Btg2 및 Cdkn1a가 관련되어 있는지 확인하기 위한 향후 연구가 필요합니다.

우리는 또한 신장 Spp1 mRNA 발현이 FAN과 식이 모두에 의해 크게 영향을 받는 것으로 나타났으며, AD가 아닌 음식을 먹인 마우스와 비교하여 WD를 먹인 마우스에서 더 높은 발현을 보였습니다. Spp1(오스테오폰틴)은 일반적으로 소변에서 분비되는 당단백질이며 신장, 특히 원위 피질 네프론에서 높게 발현됩니다. Spp1은 식이, 에스트로겐 및 FGF23[7,50,51]에 의존하는 과정인 신장 세뇨관 내에서 칼슘 결정 형성 및 침착을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다[46-49]. 일반적으로 신장 손상 후에 상향 조절됩니다[52]. 그러나, 허혈성 신장 손상에서 Spp1의 역할은 불분명하고 비만 및 질병과 함께 증가된 발현의 생리학적 중요성을 설명하기 위한 추가 연구가 필요합니다.

우리는 또한 일방적인 허혈-재관류 손상 모델에서 결과를 평가했습니다. 우리는 uIRI 모델의 FAN 연구에서 확인된 신독성 관련 유전자의 조직학 또는 mRNA 발현의 변화를 관찰하지 못했습니다. uIRI 연구에서 신장 Btg2 및 Cdkn1a 발현의 차이가 없다는 것은 FAN 연구에서 AD를 먹인 마우스에서 신장 비대가 관찰되지 않은 이유를 설명할 수 있습니다. 그러나 식이요법이 신장과 비장의 면역 표지자 발현에 미치는 영향이 있었습니다. B-세포 마커 CD19의 신장 발현은 음식을 먹인 쥐와 비교하여 WD와 AD를 먹인 쥐에서 두 배 이상이었습니다. 허혈성 AKI의 마우스 모델에서 B 세포의 역할은 복잡하고 결과는 여러 요인(아형, 항체 등급 등)에 따라 달라지기 때문에 이 발견의 중요성은 불분명합니다[53-56]. 식단은 또한 비장(Ccr2, Cd19, Ly6g)에서 면역 마커의 mRNA 발현에 상당한 영향을 미쳤습니다. 위에서 언급한 바와 같이, 이것은 비장에서 백혈구의 증가된 배치와 WD 및 AD를 먹인 마우스에서 전신 면역 반응의 악화로 해석될 수 있습니다. 그러나 WD와 AD를 먹인 마우스에서 억제된 순환 IL6은 uIRI 모델에서 이러한 식이의 면역억제 효과를 시사합니다. 신장 질환 모델에서 세포 손상의 다른 분자 메커니즘이 설명되었으며[57-59], 우리 연구는식이 요법이 이러한 메커니즘을 수정할 수 있음을 시사합니다. 이 추측을 확인하고식이 요법이 신장 손상과 관련된 염증 반응 및 세포 사멸 경로를 어떻게 크게 수정하는지 결정하려면 추가 연구가 필요합니다

문헌, 특히 uIRI 연구에서 우리의 데이터를 다른 데이터와 비교할 때 고려해야 할 제한 사항이 있습니다. 우리는 WD 및 AD 공급 마우스의 과도한 지방 조직에서 신장 혈관계를 분리하는 동안 발생하는 합병증을 줄이기 위해 일방적인 모델을 선택했습니다. 따라서, 신장 기능의 혈청 측정은 건강한 비허혈성 반대측 신장의 존재를 감안할 때 uIRI 연구에서 정량화되지 않았습니다. 우리는 또한 비만 마우스가 이 모델에서 일반적으로 사용되는 케타민/자일라진 마취 혼합물을 견디지 못하기 때문에 이소플루란 마취를 사용했습니다[60]. Isoflurane은 IRI에서 신장 손상을 감소시키는 것으로 나타났으며[61] 관찰된 손상을 달성하기 위해 허혈 시간을 30분에서 45분으로 늘려야 했습니다. 이러한 경험은 uIRI 연구의 결과에 대한 우려를 불러 일으켰고 FAN 모델에 초점을 맞춘 근거였습니다. 또한 유전자 발현의 변화가 단백질 생산의 변화와 동일하지 않으며, 단백질 풍부도의 변화와 세포 건강 및 기능의 후속 변화를 검증하기 위한 추가 연구가 필요하다는 점을 강조하는 것도 중요합니다.

Cistanche는 신장 손상을 치료할 수 있습니다

5. 결론

결론적으로, 우리는 신장 손상에 대한 감수성에 대한 식이 요법의 중요성을 뒷받침하는 데이터를 제시합니다. 우리의 연구 결과에 따르면 미국인의 영양소 섭취량의 50번째 백분위수를 모델링하기 위해 만들어진 식단은 상업적으로 이용 가능한 WD에서 관찰되는 것과 유사한 정도로 설치류의 신장 손상을 악화시키기에 충분합니다. 우리의 데이터는 또한 질병 결과를 크게 변경하는 신장 손상의 면역 병리학에서 영양, 염증 및 세포주기 조절 사이의 기계적 연결을 제안합니다. 종합하면, 우리의 연구는 기계론적 전임상 동물 연구에서 영양에 대한 인식과 고려를 높일 필요성을 강조합니다.

저자 기여:

개념화, JCG; 방법론, JCG, JFH, JEB, RL; 공식 분석, JCG; 조사, JEB, DLQ, KJW, BB, HTH, RL, JFH; 자원, JCG, JFH; 데이터 큐레이션, JCG, JFH; 쓰기 - 원본 초안 준비, JCG, JFH; 쓰기 - 검토 및 편집, JEB, DLQ, KJW, BB, HTH, RL, JFH; 감독, JCG, JFH; 프로젝트 관리, JCG, JFH; 자금 조달, JCG 모든 저자는 출판된 원고 버전을 읽고 동의했습니다.

자금:

이 연구는 Liberty University 및 Liberty University College of Osteopathic Medicine의 내부 보조금, American Osteopathic Association의 보조금(보조금 #19133749) 및 국립 보건원(National Institutes of Health)의 보조금(1R01DK113632-01A1)의 지원을 받았습니다. .

기관 검토 위원회 성명서:

이 연구는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침[8]에 따라 수행되었으며 Liberty University의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(#49.190710, 2019년 7월 11일)의 승인을 받았습니다.

감사의 말:

AD 생성에 도움을 준 Teklad Diets(Envigo)의 Jessica Flowers와 조직학 서비스를 위한 버지니아 대학교 조직학 핵심 시설에 감사드립니다.

이해 상충:

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

출처: '식이 요법은 면역 병리학 및 신장 손상의 중증도에 상당한 영향을 미칩니다'존 E. 브루스 외

---영양소 2021, 13, 1521