Echinacoside는 AKR1B10/ERK 신호 변환을 조절하여 유방암 MCF-7 세포의 악성 진행을 방해합니다.

초록: 이 연구는 다음의 영향을 분석합니다.에키나코사이드(ECH)의 증식, 전이 및 아드리아마이신(ADR) 저항성유방암(BC) MCF{{0}} 세포는 aldo-keto reductase family 1 member 10(AKR1B10)/세포외 신호 조절 키나아제(ERK) 경로의 조절을 통해 이루어집니다. ECH의 화학 구조가 먼저 확인되었습니다. MCF-7 세포를 다양한 농도(0, 10, 20, 40 ug·mL-1 )의 ECH로 48시간 동안 처리하였다. Western blotting은 AKR1B10/ERK pathway-associated protein의 발현을 분석하기 위해 사용되었고 cell counting kit-8 (CCK-8) assay는 세포 생존력을 결정하기 위해 사용되었습니다. MCF-7 세포를 수집하여 대조군, ECH군, ECH+Ov-NC군, ECH+OvAKR1B10군으로 분류하였다. 그런 다음 Western blotting을 사용하여 AKR1B10/ERK 경로 관련 단백질의 발현을 분석했습니다. 세포 증식을 검사하기 위해 CCK-8 및 5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU) 분석을 사용했습니다. 세포 이동은 스크래치 분석, 트랜스웰 분석 및 웨스턴 블로팅으로 평가하였다. 결국, MCF-7 세포는 ADR 저항성을 유도하기 위해 48시간 동안 ADR로 처리되었다. 세포 생존력은 CCK-8 assay로 시험하였고, 세포자살은 terminaldeoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling (TUNEL) assay와 Western blotting으로 추정하였다. PDB(Protein Data Bank) 및 분자 도킹을 기반으로 AKR1B10에 대한 ECH의 결합 친화도를 평가했습니다. 다양한 용량의 ECH는 용량 의존적으로 AKR1B10/ERK 경로 관련 단백질의 발현을 감소시켰고 대조군에 비해 세포 생존력을 감소시켰다. 대조군과 비교하여 40 ug·mL-1 ECH는 MCF-7 세포에서 AKR1B10/ERK 경로를 차단하고 세포의 증식, 전이 및 ADR 저항성을 억제했습니다. ECH + Ov -NC 그룹과 비교하여 ECH + Ov-AKR1B10 그룹은 MCF-7 세포의 일부 생물학적 행동의 회복을 보여주었습니다. ECH는 또한 AKR1B10을 표적으로 삼았습니다. ECH는 AKR1B10/ERK 경로를 차단하여 BC 세포의 증식, 전이 및 ADR 저항성을 억제할 수 있습니다.

키워드:에키나코사이드; AKR1B10/ERK 신호; 유방암; 아드리아마이신 내성

유방암(BC)은 지금까지 가장 흔한 여성 악성 종양으로, 평균 진단 연령은 약 60세입니다[1]. 중국의 신규 BC 환자 비율은 전 세계 비율의 12.2%를 차지하며, 세계 BC 사망 비율은 9.6%를 차지한다 [2]. 고지방식이, 음주, 신체활동 부족 등 유전적, 환경적 요인이 유방암의 위험요인이다[3-4]. 현대 치료에는 여전히 수술, 방사선 요법 및 약물 요법이 포함됩니다[1]. 일반적인 임상 약물로는 cyclophosphamide, 5-fluorouracil, pirarubicin, tamoxifen citrate 등[5]이 있으며 BC 세포에 약물 내성이 존재하는 것도 BC 치료를 어느 정도 가져온다. 큰 도전 [6] 동시에 BC는 이질적인 종양으로서 뼈, 폐, 간, 뇌와 같은 장기로 전이될 가능성이 더 높기 때문에 전이성 유방암은 거의 치료가 불가능합니다[7]. Cistanche는 우리나라의 전통 약재입니다. 그것은 식물과에 속하며 "사막 인삼"[8]으로 알려져 있습니다.에키나코사이드(ECH)는 Cistanche deserticola에서 추출한 페닐에타노이드 배당체입니다. 최근 연구에서는 다음과 같이 강조하고 있습니다.에키나코사이드강력한 항산화, 항염증 및 항암 특성을 가지고 있습니다. 예를 들어, mTOR/STAT3 경로를 억제함으로써 ECH는 파라세타몰 유발 간 손상에서 염증 반응과 산화 스트레스를 완화할 수 있습니다[9]. 여러 증거에 따르면 ECH는 주로 BC에서 종양 억제 역할을 하며 그 메커니즘은 miR-4306 및 miR-4508 [10]의 발현을 하향 조절하거나 Wnt/-catenin을 차단하는 것과 관련될 수 있습니다. 시그널링 [11].

aldo-keto reductase superfamily의 구성원인 Aldo-keto reductase 1B10(AKR1B10)은 산화 환원 반응을 통해 독성 물질을 무독성 물질로 전환하고 해당하는 알코올을 생성하여 숙주 세포에 보호 효과를 발휘할 수 있습니다[12]. 연구에 따르면 AKR1B10은 주로 결장 및 소장과 같은 정상 인간 조직에서 발현됩니다[13]. 더 많은 연구에서 AKR1B10은 주로 유방암에서 발암유전자로 작용하며 유방암의 잠재적 바이오마커가 될 수 있음이 밝혀졌습니다[14-16]. MAPK 계열의 핵심 구성원인 세포외 조절 단백질 키나아제(ERK)는 후생동물에서 진화적으로 보존된 다양한 세포 과정을 제어하며 ERK 조절 장애는 다양한 질병을 유발할 수 있습니다[17]. LI J 등[18]은 AKR1B10이 ERK 신호를 활성화하여 유방암 진행을 촉진할 수 있음을 밝혔습니다. 더 흥미롭게도 SwissTargetPrediction 웹사이트는 AKR1B10을 echinacea의 잠재적 표적으로 예측했습니다. 그러나 ECH가 AKR1B10/ERK 신호 전달을 매개하여 유방암 진행에 관여하는지 여부는 알려져 있지 않습니다.

이 연구는 BC 악성 세포의 표현형에 대한 ECH의 특정 효과를 탐색하고 BC 세포에서 ECH와 AKR1B10/ERK 경로 사이의 관계를 설명하는 데 중점을 두었습니다.

1 재료

인간 정상 유방 상피 세포주 MCF-10A 및 인간 유방암 세포주 MCF-7는 중국 과학 아카데미 상하이 생물학 연구소의 세포 자원 센터에서 제공했습니다. MCF-7 ADR 저항성 세포는 Shanghai Huzhen Industrial Co., Ltd.에서 구입했습니다. DMEM/F1 배지(배치 번호 PM150310), 말 혈청(배치 번호 164215) 및 태아 소 혈청(배치 번호 164210)을 구입했습니다. 무한 수익 기술 Co., Ltd.에서; ECH(배치 번호 07668)는 미국 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다. ADR(로트 번호 KGA8181)은 Jiangsu Kaiji Biotechnology Co., Ltd.에서 구입했습니다. RIPA 용해 용액(로트 번호 R0020)은 Beijing Soleibao Technology Co., Ltd.에서 구입했습니다. BCA 단백질 정량 시약(로트 번호 CX0013S)은 Kangwei Century Biotechnology Co., Ltd.에서 구입했습니다. CCK-8 시약(배치 번호 C0037)은 Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.에서 구입했습니다. Lipofectamine 2000 형질감염 시약(배치 번호 11668019)은 Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.에서 구입했습니다.

Ov-AKR1B10 및 Ov-NC 플라스미드는 Chongqing Youbao Biotechnology Co., Ltd.에서 제공했습니다. EdU 시약(로트 번호 C00003) 및 TUNEL 키트(로트 번호 C11026-1)는 Guangzhou Ribo Biotechnology Co., Ltd.에서 구입했습니다. DAPI(로트 번호 40727ES10)는 Shanghai Yisheng Biotechnology Co., Ltd.의 Guangzhou Ribo Biotechnology Co., Ltd.에서 구입했습니다. Matrigel(Lot No. 354230) 및 트랜스웰 챔버(Lot No. 3450)는 미국 Corning Company에서 구입했습니다. 파라포름알데히드(Lot No. 158127), Crystal Violet(Lot No. C0775) 및 Triton X-100 용액(Lot No. T8787)은 미국의 Sigma Company에서 제공했습니다. 토끼 AKR1B10(배치 번호 ab192865), 인산화 ERK1/2(p-ERK1/2, 배치 번호 ab278538), ERK1/2(배치 번호 ab184699), E-cadherin(E-cadherin, Lot ab212059), N-cadherin(N -cadherin, lot ab76011), 달팽이(lot ab216347), B 세포 림프종-2(Bcl-2, lot ab182858), Bcl-2 관련 X 단백질(Bcl-2- 연관된 X, Bax, 배치 번호 ab182733) 항체 및 HPR-표지된 염소 항-토끼 2차 항체(배치 번호 ab6702)는 미국 Abcam에서 구입하였고; ECL 발광 키트(배치 번호 SL1350)는 Beijing Cool Lamb Technology Co., Ltd.에서 구입했습니다. Image-Pro Plus 소프트웨어는 미국 Media Cybernetics에서 구입했습니다. Leica DM1000 형광 현미경 및 Leica DM ILLED 도립 현미경은 독일의 Leica Microsystems에서 구입했습니다. SPSS 22.0 소프트웨어는 미국 IBM에서 구입했습니다.

2가지 방법

2.1 세포 배양 및 취급

MCF{0}}A 세포는 5% 말 혈청, 20ng·mL-1 표피 성장 인자, 0.5ug·mL-1 코르티솔, 10ng을 함유하는 DMEM/F12에서 배양되었습니다. ·mL-1 인슐린, 100ng·mL-1 콜레라 독소 배양 배지; MCF-7 및 MCF-7/ADR 셀은

10% FBS가 포함된 DMEM/F12 배지에서 배양되었습니다. 모든 배지는 1% 이중 항체로 보충되었고 5% CO2가 있는 가습 분위기에서 37도에서 보관되었습니다. 그 후, MCF-7 세포에 다양한 농도(0, 10, 20, 40 ug·mL-1)로 48시간 동안 ECH를 개입시켰습니다. MCF-7/ADR 세포의 약물 내성을 유지하기 위해 1.0 mg·L-1 ADR을 적용하였다. 섹스. 2.2 Western blot 방법 RIPA lysate로 MCF-7 세포의 단백질을 추출하고 BCA 시약으로 단백질 농도를 측정하였다. 10% SDS-PAGE로 분리된 단백질은 PVDF 멤브레인을 사용하여 전달되었습니다. 상온에서 2시간 동안 5% 탈지유로 차단한 후 멤브레인은 /10 000), E-cadherin(1/10 000), N-cadherin(1/5 000)이었습니다. , Snail(1/1 000), Bcl-2(1/1 000), Bax(1/1 000) 1차 항체를 4도에서 밤새 배양한 다음, 실온에서 1시간 동안 HPR-표지된 염소 항-토끼 2차 항체(1/2 000) 첨가. ECL 발광 키트를 추가하여 표적 단백질을 검출하고 Image-Pro Plus 소프트웨어로 단백질 풍부도를 분석했습니다.

유방암 치료를 위한 풍부한 Echinacoside Cistanche 커피

2.3 세포 생존력에 대한 CCK-8 검정

MCF{0}}A 및 MCF-7 세포를 96-웰 플레이트에 배양(5×103개 세포/웰)하고 24시간 후 , 다양한 농도(0, 10, 20, 40 ug·mL-1)의 ECH를 적용했습니다. 개입 후 48시간 후 10% 부피 분율의 CCK-8 시약으로 처리하고 세포 생존율은 2시간 후에 검출되었다. ECH가 MCF-7 세포의 생존력에 미치는 영향을 더 알아보기 위해 형질감염 또는 형질감염되지 않은 MCF-7 세포를 24시간 동안 배양하고 다양한 농도(0, 10, 20, 40ug· 개입을 위해 ECH의 mL-1)를 사용했습니다. , 24, 48, 72시간에 각각 10% 부피분율의 CCK-8 시약을 첨가하였고, 세포 생존율 검출 방법은 상기와 동일하였다. ECH가 MCF-7 세포의 독소루비신 내성에 미치는 영향을 알아보기 위해 MCF-7/ADR 내성 세포를 ECH와 48시간 동안 공배양한 후 CCK-8 작업 용액을 세포 생존력을 감지하기 위해 추가되었습니다.

2.4 플라스미드 형질감염

MCF-7 세포를 6-웰 ​​플레이트(5×104/웰)에 시딩하고 배양했습니다. 세포가 60%~70% 융합에 도달했을 때 Ov-AKR1B10 및 Ov-NC를 Lipofectamine 2000 형질감염 시약의 지침에 따라 일시적으로 형질감염시켰습니다. 각 그룹의 세포를 형질감염시켰고, 형질감염은 48시간 후에 완료되었다.

2.5 세포 증식을 검출하기 위한 EdU 염색

MCF{0}} 세포를 ECH로 처리하고 플라스미드로 형질감염시킨 후, 각 웰에 20 μmol·L-1 EdU를 첨가하고 37도에서 2시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 각각 4% 파라포름알데히드 및 ​​0.5% 트리톤 X-100로 고정 및 투과화시켰다. 마지막으로 DAPI로 염색된 EdU 양성 세포를 형광현미경으로 검출하였다.

2.6 세포 이동을 검출하기 위한 상처 치유 분석

MCF{{0}} 대수 성장기 세포를 6-웰 ​​플레이트에 추가하고 세포가 90% 합류에 도달하면 200µL 멸균 피펫 팁을 사용하여 줄무늬를 만들고 세척합니다 3 PBS로 시간. 도립현미경으로 0시간과 48시간에 상처폭을 측정하여 이식된 세포의 수를 측정하였다.

2.7 세포 침입을 검출하기 위한 트랜스웰 분석

ECH 처리 및 플라스미드 형질감염된 MCF-7 세포를 Matrigel이 포함된 트랜스웰의 상부 챔버에 접종하고, 트랜스웰의 하부 챔버에 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 500μL를 첨가했습니다. 24시간 후 표면 세포를 면봉으로 닦아내고 파라포름알데히드와 크리스탈 바이올렛으로 각각 고정 및 염색한 후 침습 세포를 현미경으로 계수하였다.

2.8 아폽토시스를 검출하기 위한 TUNEL 염색

15 μmol L-1 ADR로 개입한 후, ECH 처리 및 플라스미드 형질감염된 MCF-7/ADR 내성 세포를 96-웰 플레이트에 접종하고 4% 파라포름알데히드 및 ​​{{ 8}}.5% Triton X-100 투과화 처리 후 TUNEL 검출용액을 첨가하고 키트 설명서의 안내에 따라 37도에서 45분간 반응을 진행하여 DAPI 세포핵을 염색하였다. . 형광 현미경으로 세포 사멸을 관찰하기 위해 5개의 시야를 무작위로 선택했습니다.

2.9 분자 도킹

AKR1B10 단백질(PDB ID: 1ZUA)의 3차원 구조는 PDB 데이터베이스(https://www.rcsb.org/)에서 얻었습니다. PyMOL 2.2.0 소프트웨어를 사용하여 활성 성분에서 물을 제거하고 관련 없는 원래 리간드를 제거한 다음 ECH의 화학 구조를 OpenBabel 2.2.1 소프트웨어(http://openbabel.org/wiki)로 mol2 형식으로 변환하고 마지막으로 Autodock을 사용합니다. 4.2는 분자 도킹을 수행하고 시각화를 위해 자유 에너지가 가장 낮은(-10.8 kcal·mol-1) 포즈를 선택합니다.

2.10 통계 분석

본 연구에서는 SPSS 22.0 소프트웨어를 사용하여 실험 데이터를 분석 및 처리하였으며 평균 ± 표준편차(x ± s)로 표현하였다. 단방향 분산 분석은 그룹 간 비교에 사용되었습니다. 때 P<0.05, the difference was statistically significant.

3개 결과

3.1 ECH는 MCF-7 세포에서 AKR1B10/ERK 신호 전달을 억제합니다. 먼저 Western blotting 결과 ECH 노출량이 증가함에 따라 MCF{{11 }} 세포가 감소하였고, 하향 추세는 용량 의존적 P<0.001) (Fig. 1). It can be speculated that ECH may participate in the malignant progression of BC by regulating AKR1B10/ERK signaling.

그림.1의 효과에키나코사이드MCF-7 세포에서 AKR1B10/ERK 신호 변환(x̄  s, n=3)

3.2 AKR1B10의 과발현은 MCF-7 세포 증식에 ​​대한 ECH의 억제 효과를 역전시켰다

CCK{0}}의 실험 데이터는 MCF-10A 정상 세포와 비교하여 다양한 농도의 ECH(0, 10, 20, 40 ug·mL{{6} }) MCF-7 암세포(P< 0.05), and when the mass concentration of ECH was 40 μg·mL-1, the cell activity decreased most significantly, so 40 μg·mL-1 ECH was used for subsequent experiments. To further verify whether ECH regulates BC development by regulating AKR1B10/ERK signaling, MCF-7 cells were first transfected with the Ov-AKR1B10 plasmid. After transfection of Ov-AKR1B10, the expression level of AKR1B10 was significantly increased (P<0.001). Western blotting results showed that transfection of Ov-AKR1B10 plasmid induced ECH exposure-induced reduced AKR1B10 and p-ERK1/2 protein levels again increased (P<0.001). In addition, the experimental data of CCK-8 and EdU demonstrated that the inhibitory effect of ECH treatment on the proliferation of MCF-7 cells could be alleviated by the up-regulation of AKR1B10 (P<0.05) (Fig. 2). Thus, overexpression of AKR1B10 rescued the inhibitory effect of ECH on the proliferative capacity of BC cells.

Fig.2 echinoside가 AKR1B10 발현 조절에 의한 MCF-7 세포 증식에 ​​미치는 영향 (형광염색, ×200; x̄  s, n=3)

3.3 AKR1B10의 과발현은 MCF-7 세포 이동에 대한 ECH의 억제 효과를 역전시켰다 유사하게, 대조군과 비교하여 ECH 투여는 세포 이동 및 침입의 수를 현저하게 감소시켰다(P<0.001); In contrast, increased expression of AKR1B10 resulted in enhanced cell migration and invasion (P<0.05). In addition, compared with the control group, the protein levels of N-cadherin and Snail were significantly decreased after ECH treatment, while the level of E-cadherin was significantly increased (P<0.001); The protein levels of cadherin and Snail increased, while the level of E-cadherin decreased (P<0.001) (Fig. 3). In conclusion, up-regulation of AKR1B10 expression rescued the inhibitory effect of ECH administration on BC cell migration and invasion.

그림 4 AKR1B10 발현 조절에 의한 MCF-7 세포의 ADR 저항성에 대한 에키노사이드의 효과(형광 염색, ×200; x̄  s, n=3)

4 토론

유방암은 다양한 발암 인자의 작용으로 유선 상피 세포가 통제되지 않고 증식하는 것을 말하며, 여성 암 사망의 주요 원인이기도 하다[1]. 종양 전이는 종양의 가장 위협적인 특성 중 하나이며, 종양의 장기 치료의 근본 원인이기도 하다[19]. 화학 요법은 유방암의 임상 치료를 위한 일반적인 방법입니다[20]. 유방암 치료 방법 및 개념의 지속적인 발전과 업데이트로 유방암의 예후가 크게 개선되었습니다[20]. 그러나 약물 내성의 출현은 약물의 임상적 효과를 크게 제한한다[21]. 연구에 따르면 전이성 유방암 환자의 약 90%와 진행성 유방암 환자의 약 50%가 약물 내성을 갖게 됩니다[22]. ADR은 anthracycline계 항생제로 DNA의 화학적 구조에 작용하여 전이성 또는 재발성 유방암의 임상치료에 널리 사용되며 유방암 환자의 재발률과 사망률을 효과적으로 감소시킬 수 있다[23]. 따라서 본 연구는 BC 세포의 증식, 전이 및 ADR 저항성에 초점을 맞추어 BC 진행의 조절 메커니즘을 심층적으로 밝히고 개입을 위한 잠재적 분자 표적을 탐색했습니다.

Echinacea는 천연 허브인 Cistanche deserticola와 Echinacea purpurea의 뿌리줄기에서 추출한 페닐에타노이드 화합물입니다. 항산화제, 항우울제, 항염증제, 항바이러스제, 항종양제, 항균제[24-25] 등 다양한 약리작용이 있다[24-25]. 최근 연구에서는 ECH가 PI3K/Akt 경로를 조절함으로써 난소암 세포의 증식, 전이 및 혈관신생을 억제할 수 있다고 보고했습니다[26]. ECH는 TGF-1/Smad 경로를 활성화하여 간암에서 항암 활성을 발휘할 수 있습니다[27]. ECH는 Wnt/-catenin 신호 전달 경로를 비활성화하여 BC 종양 성장을 방해할 수 있습니다[11]. 이 연구에서 AKR1B10은 SwissTargetPrediction에 의해 ECH의 잠재적 표적이 될 것으로 처음 예측되었습니다. 따라서 저자는 ECH가 AKR1B10- 관련 신호 경로를 조절하여 BC 질병 진행에 참여할 수 있다고 추측합니다. 현재까지 AKR1B10은 다양한 암에서 발현이 증가되어 암을 촉진시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다[28]. 또한 AKR1B10은 ERK 신호를 활성화하여 방광암, 폐 선암 및 BC의 발병을 악화시킬 수 있습니다[18, 29-30]. 유방암 세포에서 AKR1B10의 이소성 발현은 ERK 신호 전달 경로를 활성화하기 위해 ERK 1/2의 인산화를 촉진합니다[18]. ERK 신호 전달 경로는 MMP, 특히 MMP2를 활성화하여 세포외 기질의 분해를 촉진하여 종양 세포 침입 및 종양 전이를 촉진합니다[31-33]. 이 실험의 결과 또한 ECH의 농도를 달리하여 처리한 후에 AKR1B10/ERK 경로 관련 단백질의 발현이 용량 의존적으로 감소하는 것을 보여주었으며 이는 ECH가 AKR1B10/ERK를 억제함으로써 BC의 조절 메커니즘에 참여할 수 있음을 나타냅니다. 좁은 길. 또한, ECH 노출은 또한 BC 세포 생존력의 감소 정도를 변화시켰습니다. 이를 증명하기 위해 본 연구에서는 AKR1B10 과발현 플라스미드를 MCF-7 BC 세포에 형질감염시켰고, AKR1B10/ERK 경로와 세포 증식, 이동 및 침습, 상피-중간엽 전이에 대한 ECH 처리의 억제 효과가 과발현됨을 확인하였다. AKR1B10에 의해 구조되었습니다. 또한, MCF-7/ADR 내성 세포에서 ECH 노출은 IC50 감소 및 세포사멸 세포의 수 증가를 초래했습니다. 반면 이 설정에서 AKR1B10의 과발현은 다시 IC50을 증가시키고 세포사멸 세포 생산을 감소시킵니다. 실험 종료 시 ECH와 AKR1B10 간의 타겟팅 관계도 완전히 검증되었습니다. 위의 실험 결과는 다음을 보여줍니다.

AKR1B10 과발현은 ECH 억제 BC 발달에 대한 길항 효과를 달성합니다.

결론적으로, ECH 투여는 BC 세포의 증식, 이동, 침입, EMT 및 ADR 저항성을 약화시킬 수 있으며, 그 메커니즘은 AKR1B10을 표적으로 하고 AKR1B10/ERK 신호 경로를 억제하는 것과 관련이 있을 수 있습니다. 이 연구는 처음에 BC에서 ECH의 잠재적인 메커니즘을 명확히 했으며 항-BC 약물에 ECH를 적용하기 위한 귀중한 실험적 근거와 이론적 지원을 제공했습니다. 그러나 이 연구에는 여전히 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 이 실험은 ECH가 BC 환자의 생존율 및 예후에 미치는 영향 분석을 포함하지 않았습니다. 둘째, 이 연구는 BC 종양의 성장에서 ECH의 역할을 추가로 확인하기 위한 생체 내 동물 실험이 부족했습니다. 향후 연구에서는 유방암 치료에서 ECH의 임상적 중요성이 더 탐구될 것입니다.

지원하다:

wallence.suen@wecistanche.com 0015292862950