단식과 과식은 내인성 레트로바이러스를 통해 가금류 간의 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현에 영향을 미칩니다

추상적인

영양과 면역력이 연관되어 있다고 알려져 있으나 그 메커니즘은 그다지 명확하지 않습니다. 내인성 레트로바이러스(ERV)는 인간과 마우스 게놈의 8~10%를 차지하며 동물의 일부 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다. 최근 연구에 따르면 ERV의 활성화는 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있으며, ERV의 활동은 영양 요인을 포함한 많은 요인의 조절을 받습니다. 따라서 우리는 영양 상태가 ERV를 통한 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있다고 가정합니다. 이 가설을 검증하기 위해 동물의 영양 상태는 단식 또는 과식으로 변경되었으며 간에서 온전한 ERV(ERVK18P, ERVK25P) 및 면역 또는 염증 관련 유전자(DDX41, IFIH1, IFNG, IRF7, STAT3)의 발현이 변경되었습니다. 정량 PCR을 통해 결정한 후 거위 일차 간세포에서 ERVK25P를 과발현하고 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현을 결정했습니다. 데이터에 따르면, 절식하지 않은 대조군과 비교하여 절식한 닭의 간에서는 ERV 및 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현이 증가한 반면, 절식한 거위의 간에서는 감소한 것으로 나타났습니다. 또한, 정기적으로 섭취한 대조군에 비해 과식한 거위의 간에서 ERV 발현 및 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현이 증가하였다. 또한, 거위 일차 간세포에서 ERVK25P의 과발현은 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현을 유도할 수 있습니다. 결론적으로, 이러한 발견은 ERV가 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현에 대한 단식 및 과식의 영향을 매개하며 매개는 가금류 종에 따라 다르며 ERV 및 면역 또는 염증 관련 유전자가 면역 또는 염증 관련 유전자에 관여할 수 있음을 시사합니다. 거위 지방간의 발달. 이 연구는 영양과 면역 사이의 연관성에 대한 잠재적인 메커니즘을 제공합니다.

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키워드: 영양, 면역, 가금류, 지방간, 내인성 레트로바이러스

소개

내인성 레트로바이러스(ERV)는 외인성 레트로바이러스(프로바이러스)의 잔재로 간주됩니다. 이들 남은 '화석' 서열의 대부분은 숙주 게놈에 통합된 이후 장기적인 진화 과정에서 축적된 여러 돌연변이를 포함하고 있습니다(Cañadas et al., 2018). 이는 거의 모든 포유류 동물(예: 인간, 생쥐, 고양이, 양)과 기타 척추동물(예: 닭)에 존재합니다(Melanie 및 Nair, 2014; Xu et al., 2014). 닭에서 ERV는 닭 게놈의 3% 이상을 차지합니다(Huda et al., 2008). ERV는 동물 게놈에 풍부하지만 많은 ERV는 손상되지 않습니다. 온전한 ERV는 구조가 외인성 레트로바이러스와 쉽게 구별되지 않는 것을 의미합니다. 이러한 ERV는 일반적으로 전사 조절 요소, 바이러스 단백질의 코딩 서열(그룹 특이적 항원[Gag], 역전사효소[Pol] 및 외피 단백질[Env])을 위한 요소가 있는 2개의 긴 말단 반복부(LTR), 폴리퓨린 트랙 서열을 포함합니다. , 그리고 숙주 세포의 짧은 측면 게놈 서열(Jern and Coffin, 2008; Dolei et al., 2015; K€ury et al., 2018). 지금까지 닭 게놈에서 발견된 비교적 온전한 ERV는 약 500개입니다(Bolisetti et al., 2012). 상대적으로 손상되지 않은 ERV 외에도 자가 복제에 필요한 하나 이상의 코딩 유전자(일반적으로 Env 유전자)가 부족한 '슬림' ERV와 '솔로 LTR' ERV를 비롯한 다른 유형의 ERV가 있습니다. '단독 LTR' ERV의 수는 상대적으로 온전한 ERV 수의 약 60배입니다(Bolisetty et al., 2012). 계통발생학적 분석에 따르면 조류 프로레트로바이러스(즉, ERV)는 클래스 I(감마 유사), 클래스 II(알파 및 베타 유사) 및 클래스 III(멀리 스푸마 유사) 프로레트로바이러스로 분류될 수 있습니다. 알파 유사 프로레트로바이러스는 베타 유사, 감마 유사 및 알파벳a 프로레트로바이러스보다 그 수가 많습니다(Bolisetty et al., 2012). 포유류 프로레트로바이러스와 비교하여, 조류 프로레트로바이러스는 더 이질적입니다. 베타 유사 프로 레트로바이러스는 베타 유사에서 알파벳 유사로, 그런 다음 알파 유사 프로 레트로바이러스로 진화적인 전환을 겪었으며 베타 레트로바이러스 마커가 점진적으로 손실되었습니다. 알파벳 프로레트로바이러스는 이전에 인식된 일부 조류 프로레트로바이러스를 포함하여 알파형과 베타형 사이의 중간체입니다. 클래스 III 프로 레트로바이러스가 가장 오래된 것으로 보이며, 베타형 및 감마형 프로 레트로바이러스가 그 뒤를 잇는 반면, 알파벳 및 알파형 프로 레트로바이러스는 가장 어린 것으로 보입니다. 대부분의 프로레트로바이러스는 감각 방향으로 숙주 유전자에 통합됩니다(Bolisetty et al., 2012).

cistanche tubeulosa의 장점 - 간 유지

비-LTR 트랜스포존(예: 길거나 짧은 산재된 핵 요소)과 마찬가지로 ERV는 숙주 게놈의 한 위치에서 다른 위치로 DNA 서열의 형태로 스스로 전치될 수 있는 이동 요소입니다. 이 전이는 RNA 중간체에 의해 매개됩니다. 레트로트랜스포존으로서의 ERV는 진화 초기 단계에서 강력한 전이 능력을 가지고 있지만, 현재 대부분은 이 능력을 상실했습니다(Jern and Coffin, 2008). 더욱이, 심층 시퀀싱 연구에 따르면 많은 ERV가 일반적으로 침묵하는 것으로 나타났습니다. 예를 들어, ERV의 약 20%만이 닭 배아 섬유아세포에서 전사되며 이들 중 일부는 생체 내에서도 전사됩니다(Bolisetty et al., 2012). 또한 최근 연구에 따르면 일부 침묵 ERV는 특정 조건에서 활성화되고 발현될 수 있으며(Crichton et al., 2014), 이들의 발현은 세포 유형이나 조직 유형(특히 태반 및 생식 세포)과 같은 많은 요인에 의해 영향을 받습니다. , 세포 분화 및 노화 과정, 사이토카인, 세포의 정상적인 기능을 방해하는 요인, 영양 ​​요인(Taruscio and Mantovani, 2004; Denner, 2016; Elaheh et al., 2018). 최근 수십 년 동안 ERV의 생물학적 기능은 점차 밝혀졌습니다. 1) ERV의 전이는 숙주 게놈을 불안정하게 만들 수 있지만 원래 유전 물질인 ERV는 숙주 동물이 종 간 및 종 내에서 다양성을 증가시키고 환경에 대한 적응성을 향상시키며 지속적인 유지를 가능하게 합니다. 진화(Zhang et al., 2008); 2) ERV의 LTR 영역에 있는 프로모터와 인핸서는 인접한 유전자의 전사에 영향을 미칠 수 있으며 인접한 영역의 후생적 상태(예: DNA 메틸화 및 히스톤 변형)를 변경할 수 있습니다(Thompson et al., 2016). 3) ERV는 Env 단백질을 숙주 수용체에 결합함으로써 외인성 바이러스가 동일한 수용체에 결합하는 것을 차단할 수 있으며, 따라서 숙주 세포에 외인성 바이러스에 저항할 수 있는 능력을 제공합니다(Nadeau et al., 2015). 4) ERV 전사체는 선천적 면역 체계를 활성화하고 이중 가닥 RNA 의존성 TLR3/MDA5 신호 전달 경로를 통해 IFN과 같은 사이토카인의 생성을 유도하여 종양을 억제할 수 있습니다(Chiappinelli et al., 2015). 5) ERV는 노화, 자가면역, 퇴행성 신경질환 등 일부 질병의 발생 및 발달에도 관여한다(Mager and Stoye, 2015; Nadeau et al., 2015).

내인성 레트로바이러스 그룹 K(ERVK)는 다양한 ERV 그룹(ERVW, ERVH, ERVK 등) 중에서 가장 최근에 내생화된 그룹입니다. 이는 기능성 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하므로 가장 온전하고 생물학적으로 활성인 ERV 그룹으로 간주됩니다(Hohn et al., 2013). ERVK의 상향조절된 발현은 염증성 질환, 신경 질환, 자가면역 질환 등과 연관되어 있습니다(Haraguchi et al., 1992; Tolosa et al., 2012). 최근 연구에 따르면 DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제인 ​​5-aza-2-deoxycytidine에 의한 ERVK 활성화가 세포 선천 면역을 향상시킬 수 있는 것으로 나타났습니다(Nogues et al., 2018). 구성원이 많은 인간 ERVK와 비교하여 조류 ERVK는 GenBank에 주석이 달린 구성원이 몇 개뿐입니다. 닭과 거위가 공유하는 주석이 달린 ERVK 멤버는 ERVK18P(LOC106029425) 및 ERVK25P(LOC106046236)입니다. 현재 조류 ERVK의 생물학적 또는 병리학적 역할은 아직 알려지지 않았습니다. 영양과 에너지 상태는 동물의 성장, 번식, 면역력에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. 앞서 언급한 바와 같이, 영양 요인은 ERV의 발현을 활성화할 수 있으며, ERV는 다양한 방식으로 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현을 조절할 수 있습니다. 따라서 우리는 영양이나 에너지 수준이 ERV를 통한 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있다고 추측합니다. 이 추측을 검증하기 위해 실험용 닭이나 거위의 단식이나 과식을 통해 영양 상태를 변경한 다음 간에서 ERV 및 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현을 결정했습니다. 또한, ERV와 면역(또는 염증) 관련 유전자의 관계를 밝히기 위해 거위 일차 간세포에서 ERVK25P의 과발현도 수행되었습니다. 이 연구는 영양과 면역 사이의 연관성에 대한 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.

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재료 및 방법

실험동물

모든 동물 프로토콜은 연구에서 농업 동물 사용에 대한 기관 지침에 따라 이루어졌으며 중국 양저우 대학교 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

동일한 부화 배치의 Jurong Siji 새끼 기러기는 Mali 실험 농장(Jurong, Jiangsu, China)에서 자연 채광 및 전통적인 축산 관리 하에 지상에서 사육되었습니다. 70일령에 16마리의 건강한 거위를 무작위로 2개의 그룹으로 나누었습니다: 단식 그룹(거위는 24시간 동안 물을 자유롭게 섭취)과 대조군(절식 없음, 사료와 물에 자유롭게 접근). 24시간 동안 금식시킨 후, 모든 실험 개체를 희생시키고, 간 샘플을 수집하여 액체 질소에 급속 냉동시킨 후, 보관을 위해 270℃로 옮겼다. 마찬가지로, 단식 실험을 위해 20-주령의 건강한 로드 아일랜드 레드 닭 16마리를 희생시켰습니다. 단식과 대조적으로 16{9}}일된 건강한 Landes 거위(Licheng Animal and Poultry Co., Ltd., Huaian, Jiangsu, China 제공)를 무작위로 균등하게 과급급(과식 24일)으로 나누었습니다. 대조군(일상적으로 먹이주기). 과잉 공급에 대한 프로토콜은 Geng et al., 2016a에 의해 이전에 설명되었습니다. 과식 24일째에 대조군과 과식 그룹 모두에서 간 샘플을 채취하여 270℃에 보관했습니다.

거위 일차 간세포의 분리 및 배양 및 ERV의 과발현

거위 일차 간세포는 Osman et al., 2016에 의해 이전에 설명한 대로 부화 22일 또는 23일에 거위 배아로부터 분리 및 배양되었습니다. 거위 LOC106046236 유전자(또는 ERVK 구성원 25 Pol 단백질 유사, ERVK25P)의 맞춤형 과발현 벡터 ) 및 빈 벡터는 Suzhou Jima Gene Co., Ltd.(Suzhou, China)에서 구입했습니다. 과발현 벡터는 CMV 프로모터와 ERVK25 폴리머라제 유전자의 코딩 서열인 삽입된 DNA 단편을 포함하는 pcDNA3.1 벡터를 사용하여 구축하였다. 과발현 벡터와 빈 벡터를 별도로 분리하여 Lipofectamine 2000(cat# 11,668-019, Invitrogen, Co., Ltd., Camarillo)을 사용하여 24시간 동안 배양한 거위 일차 간세포에 형질감염시켰다. 형질감염 32시간 후, 정량적 형광 PCR에 의한 유전자 발현 분석을 위해 세포를 수집하였다. 형질감염은 Geng et al., 2013에 의해 이전에 설명된 대로 수행되었습니다.

RNA 정제 및 cDNA 합성

TRIzol 키트(cat# DP424, Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd., Beijing, China)를 사용하여 간 샘플로부터 총 RNA를 분리했습니다. 정제된 RNA 샘플을 HiS criptTM Q RTSuperMix 역전사 키트(cat# R123-01; Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, China)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰습니다. 제조사의 지시에 따라 역전사를 수행하였다.

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정량적 PCR 분석

GenBank 내 각 유전자의 참조 서열, 관심 유전자 및 내부 참조 유전자에 대한 정량적 PCR 프라이머인 GAPDH를 온라인 Primer 3.0 소프트웨어(Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge)를 사용하여 설계했으며, NCBI 웹사이트의 Primer-BLAST 프로그램(National Center for Biotechnology Information, Bethesda)을 이용하여 서열 특이성을 확인하였다. 프라이머 서열은 표 1에 나열되어 있다. 제조사의 지시에 따라, Vazyme AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 키트(cat# Q{4}}/03; Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, 중국) 및 cDNA 샘플. 관심 유전자의 상대적 발현은 Geng et al., 2016b에서 이전에 설명한 대로 22OOCT 방법을 사용하여 계산되었습니다.

면역블로팅 분석

간 조직 샘플은 50 mmol Tris, pH 7.5, 120 mmol NaCl, 1 mmol EDTA, 15 mmol Na4P2O7, 20 mmol NaF, 1% Nonidet를 포함하는 완충액에서 용해되었습니다. , 0.1% 페닐메틸 설플루오라이드 및 프로테아제 억제제(0.08mmol 아프로티닌, 0.02mmol 류펩틴, 0.04mmol 베스타틴 및 15mmol 펩스타틴). 제조사의 지침에 따라 Bio-Rad RC DC 단백질 분석 키트(카탈로그 번호 500-0119; Bio-Rad, Hercules)를 사용하여 각 용해물의 단백질 함량을 측정했습니다. 조직 용해물로부터의 단백질(10 mg)을 SDS PAGE로 분리한 후 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼고, 이를 0.1% Tween 20을 함유한 PBS 중 5% 우유에서 밤새 배양했습니다. 이어서 막을 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양했습니다. 본 연구에서는 다음 항체를 1:1000 희석하여 사용했습니다: 항-STAT3(카탈로그 번호 bs- 1141R; Beijing Biosynesis Biotechnology Co., Ltd., 베이징, 중국), 항-IFIH1 (카탈로그 번호 bs-18740R; Beijing Biosynesis Biotechnology Co., Ltd., 중국 베이징), 항액틴(카탈로그 번호 bsm-33036M; Beijing Biosynesis Biotechnology Co., Ltd., 중국 베이징) 및 항 GAPDH(고양이 번호 NB300-221; Novus Biologicals Co., Ltd., CO). 서양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 2차 항체를 1:10,000 희석하여 사용했습니다. 단백질은 향상된 화학 발광 및 Western blotting 검출 시스템 (Amersham Biosciences, Beijing, China)에 의해 검출되었습니다.

통계 분석

처리군과 대조군의 유전자 발현 차이에 대한 통계적 유의성을 분석하기 위해 Student t-test를 이용하였으며, P,0.05를 통계적 유의성 기준으로 설정하였다. 모든 데이터는 평균 6 SEM으로 표시됩니다.

결과

단식은 거위 간에서 ERV 및 면역 관련 유전자의 발현을 억제했습니다

거위 ERV 유전자(ERVK18P 또는 LOC1{{1{12}}}}6029425, ERVK25P 또는 LOC106046236)에 대한 정량적 PCR 프라이머는 GenBank의 참조 서열을 기반으로 설계되었습니다. 정량적 PCR 분석은 거위 간에서 ERVK18P의 발현 수준이 ERVK25P와 유사하다는 것을 보여주었습니다(그림 1A). 대조군(절식 없음)과 비교하여, ERVK18P 및 ERVK25P의 발현은 24시간 동안 절식한 거위의 간에서 유의하게 억제되었습니다(P, 0.05 또는 0.01)(그림 1B). 이에 따라 면역 또는 염증 관련 유전자(DDX41, IFIH1, IFNG, IRF7, STAT3)의 mRNA 발현도 억제되었으며, 단식한 거위와 대조 거위 사이의 DDX41 및 IFNG의 mRNA 발현 차이는 통계적으로 유의한 수준에 도달했습니다. (P, 0.05)(그림 1B). 면역블로팅 분석 결과, 단식한 거위의 간에서 IFIH1의 단백질 수준이 대조 거위의 수준보다 낮은 것으로 나타났습니다(보충 그림 1).

표 1. 정량적 PCR을 위한 프라이머 서열 목록.

단식은 닭 간에서 ERV 및 면역 관련 유전자의 발현을 유도했습니다

정량적 PCR 분석 결과 대조군(공복 없음)과 비교하여 단식 유도 닭 간에서 ERVK18P 및 ERVK25P의 mRNA 발현이 통계적으로 유의한 수준에 도달한 것으로 나타났습니다(P,0.{{5} }5 또는 0.01) (그림 2). 유사하게, 단식은 이러한 면역 또는 염증 관련 유전자의 mRNA 발현을 유도했으며, 그룹 간 IFIH1, IFNG, IRF7 및 STAT3의 mRNA 발현 차이는 통계적으로 유의한 수준(P, 0.05 또는 0.01)에 도달했습니다(그림 2). ). 면역블롯팅 분석 결과, 단식한 거위의 간에서 IFIH1의 단백질 수준이 대조 거위보다 높은 것으로 나타났습니다(보충 그림 1).

과잉 공급은 거위 간에서 ERV 및 면역 관련 유전자의 발현을 유도했습니다

정량적 PCR 분석 결과, 대조군(일상적으로 급여한)과 비교하여 24일 동안 과식한 거위의 간에서 ERVK18P 및 ERVK25 P의 mRNA 발현이 증가한 것으로 나타났으며, 대조군과 과식한 거위 사이의 ERVK18P mRNA 발현의 차이는 통계적으로 유의미한 수준(P, 0.05)(그림 3). 따라서 과식한 거위의 간에서 면역 또는 염증 관련 유전자의 mRNA 발현도 증가했으며, 대조군과 과식한 거위 사이의 IRF7 mRNA 발현 차이는 통계적으로 유의한 수준에 도달했습니다(P, 0.05). 그림 3). Immunoblotting 분석 결과, 과식한 거위의 간에서 IFIH1의 단백질 수준이 대조군 거위의 단백질 수준보다 높은 것으로 나타났습니다 (보충 그림 1).

그림 1. 거위 간에서 ERV 및 면역 관련 유전자의 발현은 단식에 의해 억제되었습니다. ERV와 면역 관련 유전자의 상대적 발현은 정량적 PCR에 의해 결정되었습니다. (A) 정상 성체 거위의 간에서 ERVK18P 및 ERVK25P의 발현. (B) 단식한 거위의 간에서 ERVK18P, ERVK25P, DDX41, IFIH1, IFNG, IRF7 및 STAT3의 발현은 대조군(단식 없음)에 대한 배수 변화, n5 6으로 표시됩니다. *,**는 각각 P, 0.05, 0.01 대 대조군을 나타냅니다. 모든 데이터는 평균 6 SEM으로 표시됩니다. 약어: ERV, 내인성 레트로바이러스.

내인성 레트로바이러스 과발현은 면역 관련 유전자의 발현을 유도했습니다

빈 벡터 또는 거위 ERVK25P의 Pol 유전자의 코딩 서열을 포함하는 과발현 벡터로 거위 일차 간세포를 형질감염시킨 후 32시간 후에 과발현 벡터로 형질감염된 세포에서 Pol 유전자의 mRNA 발현이 약 97배 이상 증가하였다. 빈 벡터(P, 0.01)로 형질감염된 세포에서(그림 4). 예상한 대로 ERVK25P의 과발현에 의해 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현이 유도되었으며, IFIH1, IFNG, IRF7, STAT3의 유도는 통계적으로 유의한 수준(P, 0.05 또는 0.01)에 도달하였다. (그림 4).

논의

영양과 에너지 수준은 동물의 성장, 번식 및 면역력에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. 기아(또는 단식) 및 섭식은 영양 또는 에너지 수준에 영향을 미치는 두 가지 전형적인 상태이므로 동물의 생리적 기능에 대한 영양 또는 에너지 조절을 설명하기 위한 연구 모델로 자주 사용됩니다. 예를 들어 단식이나 섭식은 성장, 생식, 면역과 관련된 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있습니다(Volkoff et al., 2016; Smati et al., 2020). 그러나 단식이나 식이요법이 ERV를 활성화하고 ERV를 통한 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있는지 여부는 불분명합니다. 또한, 단기적인 과식(3~4주)은 거위 지방간(흔히 푸아그라로 알려져 있음)을 형성할 수 있는데, 이는 인간과 설치류의 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)과 유사합니다(Nahum et al. , 2010; Wang et al., 2019), 그러나 ERV가 과잉 공급에 의해 활성화되고 거위 지방간 발생에 관여하는지 여부는 알려져 있지 않습니다. 본 연구에서는 단식이나 과식으로 동물의 영양이나 에너지 상태를 변화시킨 후 거위나 닭의 간에서 ERV 및 일부 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현을 확인하여 영양(또는 에너지) 상태와 ERV 발현 및 면역(또는 염증) 관련 유전자를 규명할 수 있다. 또한 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현이 ERV에 의해 영향을 받는지 확인하기 위해 거위 일차 간세포에서의 ERVK25P 과발현도 수행되었습니다. 실제로, 이 결과는 영양소나 에너지 상태가 가금류에서 ERV를 통한 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현을 조절할 수 있다는 개념을 뒷받침하는 강력한 증거를 제공했습니다. 흥미롭게도 단식이 ERV의 mRNA 발현과 간의 면역 또는 염증 관련 유전자에 미치는 영향은 가금류 종에 따라 다양했습니다. 즉, 닭 간에서 유전자의 mRNA 발현은 거위 간과 반대였습니다. . 더욱이, 단식한 거위의 간에서 유전자의 mRNA 발현은 과식한 거위의 것과 반대였습니다. 또한, 데이터는 면역 또는 염증 관련 유전자가 거위 지방간(또는 푸아그라) 발생에 대한 ERV의 조절을 중재할 수 있음을 시사합니다.

그림 2. 절식에 의해 닭 간에서 ERV 및 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현이 유도되었습니다. ERV와 면역 관련 유전자의 상대적 발현은 정량적 PCR에 의해 결정되었습니다. 절식한 닭의 간에서 ERVK18P, ERVK25P, DDX41, IFIH1, IFNG, IRF7 및 STAT3의 발현 수준은 대조군(절식 없음)에 대한 배수 변화로 표시됩니다. n {{10}} . *,**는 각각 P, 0.05, 0.01 대 대조군을 나타냅니다. 모든 데이터는 평균 6 SEM으로 표시됩니다. 약어: ERV, 내인성 레트로바이러스.

그림 3. 거위 간의 ERV 및 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현은 과잉 공급에 의해 유도되었습니다. ERV와 면역 관련 유전자의 상대적 발현은 정량적 PCR에 의해 결정되었습니다. 과식한 거위의 간에서 ERVK18P, ERVK25P, DDX41, IFIH1, IFNG, IRF7 및 STAT3의 발현 수준은 대조군(일상 급식)에 대한 배수 변화로 표시됩니다. n {{10}} . *는 P, 0.05 대 대조군을 나타냅니다. 모든 데이터는 평균 6 SEM으로 표시됩니다. 약어: ERV, 내인성 레트로바이러스.

그림 4. 거위 일차 간세포에서 ERV 과발현에 의해 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현이 유도되었습니다. ERV와 면역 관련 유전자의 상대적 발현은 정량적 PCR에 의해 결정되었습니다. ERVK25P 과발현 벡터로 형질감염된 거위 1차 간세포에서 ERVK25P, DDX41, IFIH1, IFNG, IRF7 및 STAT3의 발현은 대조군(빈 벡터로 형질감염된 간세포)에 대한 배수 변화로 표시됩니다. n {{1{{11 }}}}. *,**는 각각 P, 0.05, 0.01 대 대조군을 나타냅니다. 모든 데이터는 평균 6 SEM으로 표시됩니다. 약어: ERV, 내인성 레트로바이러스.

이전 연구에서는 ERV가 일반적으로 숙주 세포에서 DNA 메틸화를 통해 침묵되지만 ERV는 MER48에 의해 활성화될 수 있음이 입증되었습니다(Walsh et al., 1998; Gibb et al., 2015). ERV의 유도는 면역 또는 염증 관련 유전자가 관련된 다발성 경화증과 같은 일부 대사 질환을 포함한 여러 질병에서도 나타납니다(Perron et al., 2000). 메커니즘 연구에 따르면 염증은 일반적으로 영양 또는 에너지 과잉 공급으로 인해 발생하는 대사 질환의 발병에 중요한 역할을 합니다(Eo et al., 2017). 더욱이, 단식이나 과식은 퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체 유전자의 DNA 메틸화 수준을 변화시킬 수 있는 것으로 밝혀졌습니다(Jacobsen et al., 2014; Hjort et al., 2017). 이러한 발견을 바탕으로 영양 변화가 후생적 조절을 통해 ERV의 mRNA 발현을 활성화시키는 것이 가능합니다. 반면, 영양 변화는 일부 면역 또는 염증 관련 유전자의 mRNA 발현을 유도할 수 있습니다(Smati et al., 2020). 이러한 연구 결과에 맞춰 본 연구에서는 단식이나 과식은 ERV의 mRNA 발현과 면역 또는 염증 관련 유전자에 영향을 미치며, ERV의 mRNA 발현은 면역 또는 염증 관련 유전자의 mRNA 발현과 밀접한 관련이 있음을 보여주었습니다. 유전자.

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ERV는 동물 게놈에 풍부하기 때문에 면역 또는 염증에 대한 영양이나 에너지 조절에서 ERV의 역할은 과소평가될 수 있습니다. 이 연구는 주로 면역 또는 염증 관련 유전자의 mRNA 발현에 대한 단식 또는 과식의 영향을 중재하는 ERVK18 및 ERVK25를 다루었습니다. ERVK 유전자는 현재 거위와 닭 게놈 모두에 주석이 달린 비교적 온전한 ERV입니다. 상대적으로 손상되지 않은 이러한 ERV 외에도 'slender' ERV 및 'solo LTR' ERV는 단식 또는 과다 섭취에 의해 활성화될 수 있으므로 단식 또는 과다 섭취가 면역 또는 염증 관련 유전자의 mRNA 발현에 미치는 영향에도 기여합니다. '슬렌더 ERV' 및 '솔로 LTR' ERV는 일반적으로 일부 숙주 유전자 근처에 위치하므로(Thompson et al., 2016), 단식 또는 과식은 시스 효과를 통해 면역 또는 염증 관련 유전자의 mRNA 발현을 조절할 수 있습니다. ERV를 활성화했습니다. 이러한 관점에서 기초 수준의 면역이 유지되는 것은 부분적으로 활성 ERV의 작은 부분에 기인할 수도 있다. 이전 연구에서는 일부 ERV가 닭 배아 섬유아세포(ERV의 약 20%)와 생체 내에서 모두 정기적으로 전사되는 것으로 나타났습니다(Bolisetty et al., 2012). ERV의 mRNA 발현에 대한 단식 또는 과식의 조절은 앞서 언급한 바와 같이 후생적 변형(예: DNA 메틸화)을 통해 가장 가능성이 높습니다. DNA 메틸트랜스퍼라제의 억제제인 ​​AZA가 세포에서 ERV의 mRNA 발현을 유의하게 유도할 수 있다는 것이 보고되었습니다(Jaenisch et al., 1985; Deborah and Bestor, 2004). ERV의 mRNA 발현은 단식에 의해 닭 간과 거위 간에서 차등적으로 조절되었으며, 이는 닭과 거위 사이에서 ERV 발현을 조절하기 위한 후생적 변형의 정도가 다르다는 것을 시사합니다. 이러한 추론은 ERV의 mRNA 발현이 세포 유형에 따라 다르다는 것을 보여주는 증거에 의해 뒷받침됩니다(Nogues et al., 2018). 그러나 단식이나 과다 섭취가 ERV의 DNA 메틸화에 어떻게 영향을 미치는지는 아직 밝혀지지 않았습니다. 더욱이, 닭과 거위 사이의 유전적 차이는 내부 또는 외부 자극에 대한 전사 인자의 다른 반응과 같이 두 종 사이의 ERV 발현의 차이에 기여할 수 있습니다. 실제로, 우리의 이전 결과는 거위 지방간 대 정상 간에서 많은 유전자의 mRNA 발현이 NAFLD 대 정상 간(Liu et al., 2016)이 있는 인간(또는 마우스)의 mRNA 발현과 상반된다는 것을 보여줍니다. 또한 연령, 사료, 조명 및 기타 사육 조건과 같은 환경 및 기타 요인도 닭과 거위 사이의 ERV 발현 차이에 원인이 될 수 있습니다.

이 연구에서 ERVK25P 과발현은 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현을 증가시켰으며, 이는 단식 또는 과다 섭취가 ERV를 통해 간에서 면역 또는 염증 관련 유전자의 mRNA 발현을 조절한다는 개념을 뒷받침하는 강력한 증거를 제공합니다. 상대적으로 손상되지 않은 ERV의 과발현이 면역 또는 염증 관련 유전자의 mRNA 발현을 증가시키는 2가지 잠재적 메커니즘이 있습니다. 1) ERV 전사체 내에서 형성되거나 안티센스 RNA와 혼성화하여 이중 가닥 RNA가 NFkB 신호 전달을 활성화할 수 있습니다. 이중 가닥 RNA가 수용체(예: TLR3)에 결합하여 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현을 유도하는 경로(Chiappinelli et al., 2015); 2) 상대적으로 온전한 ERV는 또한 암호화된 단백질이나 폴리펩티드를 발현하여 하류 신호 전달 경로의 활성화와 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현을 유도할 수 있습니다. 본 연구에서는 적절한 항체가 부족하여 ERVK18P 및 ERVK25P의 단백질 발현을 검출할 수 없었지만, 이전 연구에서는 일부 ERV, 특히 ERVK가 단백질을 합성하고 신경 세포에서 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현을 유도할 수 있음이 입증되었습니다. 세포(Manghera et al., 2015). 이러한 단백질은 RIG-1, 단백질 키나제 K 및 염증성 신체 분자 NLRP3과 같은 동물 수용체에 의해 감지될 수 있습니다(Mitoma et al., 2013; Mu et al., 2016). 영양(또는 에너지)과 면역(또는 염증) 사이의 연관성은 여러 영양 또는 에너지 관련 장애, 특히 당뇨병 및 NAFLD를 포함한 비만 관련 질병에서 나타났습니다. 많은 염증 관련 유전자(예: 전염증성 사이토카인 종양 괴사 인자-알파, MCP1 및 IL6)가 비만 환자 대 건강한 집단에서 유도되므로 비만은 만성 염증으로 간주되어 왔습니다(Ferreira et al., 2016). 이러한 사이토카인은 인슐린 저항성을 유발하여 비만 관련 대사 장애를 악화시킬 수 있습니다(Li et al., 2019). 본 연구에서는 거위지방간과 정상간에서 ERV와 면역 또는 염증 관련 유전자가 유도되는 것으로 나타났다. 간은 영양분과 에너지 전환에 중심적인 역할을 할 뿐만 아니라 해독과 면역 조절 기능도 가지고 있는 매우 복잡한 기관입니다. 간에는 쿠퍼 세포(상주 대식세포), 자연 살해 세포, 자연 살해 T 세포 등 수많은 면역 세포가 포함되어 있습니다. 간은 또한 보체 성분과 다수의 기타 가용성 병원체 인식 수용체를 합성합니다(Keith et al., 2007). 따라서 간은 현재 중요한 면역기관으로 간주되며 선천면역(또는 염증)에 관여하는 역할을 한다(Xia et al., 2008; Trigger, 2010). ERV 및 이에 의해 유발된 면역 또는 염증 관련 유전자는 간의 생리학적 기능에 필수적일 수 있으며 영양 대사와 면역(또는 염증) 사이의 연결 고리 역할을 할 수 있습니다. 본 연구에서는 거위지방간 대 정상간에서 영양(또는 에너지) 변화가 ERV의 mRNA 발현과 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현을 유도했지만, ERV에 의해 유발된 면역 또는 염증 관련 유전자는 주목할 만하다. 피드백은 영양 대사를 조절할 수 있습니다(Volkman and Stetson, 2014; Cañadas et al., 2018). 따라서 이 연구는 ERV가 면역 또는 염증 관련 유전자를 통해 거위 지방간의 발달에 참여한다는 개념을 뒷받침하는 몇 가지 증거를 제공합니다.

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본 연구에서 우리는 또한 단식한 거위 대 대조 거위, 단식한 닭 대 대조 닭, 과식한 거위 대 대조 거위의 간에서 IFIH1의 단백질 수준을 결정했습니다. IFIH1 단백질 수준의 패턴은 IFIH1 mRNA 수준의 패턴과 유사했지만, 처리군과 대조군 간의 단백질 수준의 차이는 mRNA 수준만큼 뚜렷하지 않았습니다. 가능한 설명에는 IFIH1의 단백질 수준이 전사 후 조절될 수 있다는 것이 포함됩니다. 결론적으로, 영양 또는 에너지 상태는 ERV를 통한 일부 면역 또는 염증 관련 유전자의 발현에 영향을 미치며, 이는 영양(또는 에너지)과 면역(또는 염증) 간의 연관성을 뒷받침하는 잠재적 메커니즘을 제공합니다. 영양이나 에너지 상태는 DNA 메틸화를 통해 ERV의 발현을 조절할 수 있습니다. 이러한 후성유전적 조절은 가금류 종마다 차이가 있으며, 구체적인 메커니즘에 대해서는 추가 연구가 필요합니다. 영양이나 에너지 상태에 영향을 받는 면역 또는 염증 관련 유전자는 선천적 면역 반응에 참여할 수 있을 뿐만 아니라 염증, 동물 성장 및 세포사멸, 영양 또는 에너지 대사의 피드백 조절에도 역할을 할 수 있습니다. 또한 이번 연구에서는 ERV와 이들의 조절된 면역 또는 염증 관련 유전자가 거위지방간의 발생에 관여한다는 사실도 처음으로 밝혀냈다.

참고자료

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