글루타티온 대사는 훈련된 면역의 유도에 기여합니다

추상적인:

선천성 면역 체계는 이차적 도전에 대한 더 강한 반응을 특징으로 하는 이종 기억 특성을 나타냅니다. 훈련된 면역이라고 불리는 이 현상은 선천적 면역 세포의 후생유전학적 및 대사 재배선에 의존합니다. 반응성 산소종(ROS) 생산이 훈련된 면역 표현형과 연관되어 있기 때문에 우리는 증가된 ROS 수준과 주요 세포 내 산화 환원 분자인 글루타티온이 훈련된 면역의 유도에 역할을 한다는 가설을 세웠습니다. 여기서 우리는 훈련된 면역의 체외 모델에서 ROS의 약리학적 억제가 세포 반응성에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여줍니다. 글루타티온 수준의 조절은 인간 단핵구에서 전염증성 사이토카인 생산을 감소시켰습니다. 글루타티온 대사에 관여하는 유전자의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)은 훈련된 면역에 따른 전염증성 사이토카인 생산 능력의 변화와 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다.

또한, 혈장 글루타티온 농도는 BCG 백신을 접종한 개인의 단핵구에서 생산되는 훈련된 면역의 바이오마커인 생체외 IL-1 생산과 양의 상관관계가 있었습니다. 결론적으로, 글루타티온 대사는 훈련된 면역의 유도에 관여하며, 인간 질병에서 그 기능적 결과를 탐구하기 위한 향후 연구가 필요합니다.

인간의 면역은 질병과 감염으로부터 우리를 보호하기 때문에 매우 중요합니다. 면역 체계는 많은 다른 세포, 조직 및 기관으로 구성된 복잡한 시스템입니다. 그들은 내부와 외부의 다양한 병원체를 다루기 위해 협력합니다. 연구에서 우리는 Cistanche deserticola 다당류와 verbascoside가 심장 및 뇌 조직 효소의 활동을 개선하고 복강을 강화할 수 있음을 발견했습니다. 세포의 식세포 기능과 림프구의 증식 반응은 면역 개선에 분명한 영향을 미칩니다.

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키워드:

글루타티온; 훈련된 면역; 대식세포; 대사; 선천적 면역 기억.

1. 소개

최근까지 적응 면역은 기억을 유지하고 특정 항원에 대한 T 및 B 세포 반응을 조정하는 능력을 특징으로 하는 숙주 방어의 유일한 구성 요소로 생각되었습니다.

그러나 최근 연구의 성장세는 이종 기억의 특성을 훈련된 면역이라고 하는 과정인 타고난 면역 체계에 기인한다고 합니다[1]. 짧은 기간 동안 칸디다 알비칸스, 곰팡이 세포벽 성분인 글루칸 또는 산화된 저밀도 지단백(ox-LDL)과 같은 무균 자극에 노출된 단핵구는 관련 없는 2차 자극 시 염증 유발 사이토카인의 생산이 향상되었음을 보여줍니다. 초기 자극이 제거되었습니다[2,3].

또한 역학 연구에 따르면 결핵에 대한 Bacillus Calmette-Guérin (BCG) 백신 접종은 선천 면역 세포의 항균 기능을 향상시켜 관련 없는 감염에 대한 비특이적 보호를 유도하고 모든 원인으로 인한 사망률을 감소시키는 것으로 나타났습니다[4].

훈련된 면역은 세포의 전사 기계에 대한 전염증 반응 유전자의 접근성을 조절하는 후성유전학적 변화에 뿌리를 두고 있습니다. 훈련된 선천 면역 세포의 후생적 재배선은 해당 작용, 산화적 인산화 및 콜레스테롤 생합성과 같은 경로를 촉진하는 대사 변화를 동반합니다[5,6]. 이러한 경로에서 파생된 대사산물은 염색질 변형 효소의 활성을 차례로 조절할 수 있는 신호 분자 및 보조인자입니다. 글루타티온(GSH)은 세포내 산화환원 균형을 유지하는 주요 항산화제이며 후생유전학적 변화에 기여하는 것으로 제안되었습니다[7].

또한 BCG와 oxLDL과 같이 훈련된 면역을 유도하는 자극은 2차 자극 시 대식세포의 반응성 산소종(ROS) 생성을 증가시킵니다[8-10]. 우리는 훈련된 대식세포의 증가된 대사 활동이 ROS 수준을 증가시키고 GSH를 조절하여 훈련된 면역 반응의 강도에 영향을 미칠 것이라는 가설을 세웠습니다.

2. 재료 및 방법

2.1. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 단핵구의 분리

건강한 기증자의 버피 코트는 서면 동의서 (Sanquin Blood Bank, Nijmegen, The Netherlands) 후에 얻었습니다. CMO Arnhem-Nijmegen(NL32 357.091.10)에서 윤리적 승인을 받았습니다. 분리는 Ficoll-Paque(GE Healthcare, Chalfont St Giles, UK)를 통한 차등 밀도 원심분리에 의해 수행되었습니다. 이어서, 고삼투압 Percoll(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 밀도 구배 원심분리로 단핵구를 분리하고 발열원이 없는 차가운 인산완충식염수(PBS)로 1회 세척하였다. 세포를 재현탁하고 나중에 5 μg/mL 겐타마이신(Centraform, Etten-Leur, the Netherlands), 2 mM Glutamax(Gibco, Waltham, MA, USA)가 보충된 RPMI 1640 네덜란드 변형 배지(Invitrogen, Waltham, MA, USA)에서 배양했습니다. ), 및 1mM 피루베이트(Gibco). 최대 순도를 보장하기 위해 Percoll에서 분리한 단핵구를 폴리스티렌 평평한 바닥 플레이트(Corning, Sigma-Aldish, New York, NY, USA)에 1시간 동안 37°C 5% CO2에 부착한 다음 따뜻한 PBS로 한 번 세척했습니다.

2.2. 체외 훈련된 면역 모델

부착성 단핵구는 이전에 기술된 바와 같이 배양되었다[11]. 간단히 말해서, 105개의 단핵구를 바닥이 평평한 96-웰 플레이트(Greiner, Kremsmünster, Austria)에 시딩하고 1µg/mL -글루칸 또는 5µg/mL BCG 백신(InterVax, Toronto, ON, Canada)과 함께 배양했습니다. 10% 인간 풀 혈청을 포함한 RPMI. Candida albicans의 -1,3-(D)-glucan (-glucan)은 David Williams 교수(College of Medicine, Johnson City, TN, USA)가 친절하게 제공했습니다.

표시된 경우, 세포를 {{0}}.5µM diphenyleneiodonium(DPI), 50µM α-tocopherol(AT)(Sigma-Aldrich), 0.5µM ascorbic acid(AA), 1mM N-acetyl로 사전 배양했습니다. 시스테인(NAC)(Sigma-Aldrich) 또는 100 μM DL-부티오닌 술폭시민(BSO)(Sigma-Aldrich) -글루칸 첨가 전 1시간 동안. 24시간 후, 세포를 따뜻한 PBS로 한 번 세척하고 5일 동안 10% 풀링 인간 혈청이 보충된 RPMI에서 분화되도록 두었습니다. 배양 3일째에 배지를 새로 고쳤다. 6일째에 대식세포를 추가 24시간 동안 10ng/mL Escherichia coli lipopolysaccharide(LPS; 혈청형 055:B5, Sigma-Aldrich)로 재자극했습니다.

2.3. 반응성 산소종(ROS) 정량화

단핵구/대식세포를 2시간, 24시간 또는 6일 동안 배양하고, 세척하고, 차가운 PBS로 분리하고, PBS에서 5μM H2DCFDA(Life Technologies, Waltham, MA, USA)와 함께 30분 동안 섭씨 37도 세포를 유세포 분석기(CytoFlex, Beckman Coulter, Brea, CA, USA)로 분석했습니다. Kaluza 2.1 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행했습니다. 세포 응집체는 전방 산란(FSC)-높이 대 FSC-면적 플롯을 기반으로 게이트 아웃되었고 단핵구/대식세포 집단은 FSC 및 측면 산란(SSC)에 따라 게이트되었습니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되며 Friedman의 테스트와 Dunn의 다중 비교 테스트로 분석됩니다. 0.05 미만의 p-값은 별표로 표시된 바와 같이 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다(* p < 0.05).

2.4. 체외에서 자극된 인간 단핵구의 RNA 시퀀싱 데이터

in vitro에서 α-glucan에 노출된 단핵구의 유전자 발현 분석은 이전에 발표된 RNA-seq 데이터를 사용하여 수행되었습니다[12]. 간단히 말해서, PBMC는 Ficoll-Paque(GE Healthcare)에서 원심분리에 의해 분리되었습니다. 단핵구는 CD3 플러스(T 세포), CD19 플러스(B 세포) 및 CD56 플러스(NK 세포) 양성 세포(Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)에 대한 비드로 음성 선택을 사용하여 정제되었습니다. 설명된 시험관내 훈련된 면역 모델에 따라 세포를 배양하고 5㎍/mL -글루칸에 노출시켰다. 노출 후 4시간 및 24시간에 단핵구를 수집하였다. 항산화 반응 및 글루타티온 대사와 관련된 유전자는 in vitro 단핵구-대식세포 훈련 면역 모델에서 상당히 역동적인 유전자(p < 0.05, FC > 2.5, RPKM > 1) 목록에서 추출되었습니다. 데이터는 α-글루칸으로 처리된 단핵구와 자극되지 않은 단핵구 사이의 비율의 log10으로 표시됩니다.

2.5. 글루타티온 정량

세포내 환원(GSH) 및 산화(GSSG) 글루타티온의 정량 분석은 이전에 기술된 바와 같이 핵 자기 공명(NMR) 분광법을 사용하여 수행되었습니다[13].

요약하면, 성장 배지를 제거하고 배양된 세포를 따뜻한 PBS(37℃)로 세척하고 액체 질소로 켄칭하여 대사를 정지시켰다. 이어서 세포를 플레이트에서 긁어내고 메탄올/클로로포름/물, 8.1:0.9:1(vol/vol/vol)의 차가운(-80 ◦C) 용액을 사용하여 추출했습니다. . 추출물은 최소 30분 동안 드라이아이스에서 동결된 상태로 유지되었고 이후 18,{{1{30}}}}× g에서 20분 동안 원심분리되었습니다. -4 ºC에서. 단백질 펠릿은 단백질 정량화를 위해 보관하는 한편, 세포내 대사물을 함유하는 상등액은 부드러운 질소 흐름 하에서 건조시키고, NMR 샘플은 건조된 물질을 0.05M 포스페이트 완충액(pH 7.4) 0.22mL를 함유하는 중수소화수에 용해시켜 제조하였다. NMR 참조 및 정량화를 위한 내부 표준으로서의 mM 트리메틸실릴 프로피온-d4-나트륨 염. noesygppr1d 펄스 시퀀스(Topspin v3.0, Bruker Biospin Ltd, Karlsruhe, Germany)를 사용하여 14.1 T(1H의 경우 600 MHz) Bruker Avance II NMR에서 각 샘플에 대해 1D 1H NMR 스펙트럼을 수집했습니다. 모든 스펙트럼은 글루타티온의 정량화를 위해 Chenomx NMR 제품군 8.4(Chenomx NMR 제품군, v8.0, Edmonton, AB, Canada)에서 처리 및 가져왔습니다.

모든 농도는 각 샘플의 총 단백질 질량으로 정규화되었습니다. 후자는 단백질 펠릿을 완충액(1:1, 1% SDS: 8M Urea(0.25M Tris pH:8))에 초음파 처리하여 용해시켜 정량화했습니다. 그런 다음 설명서에 따라 PierceTM BCA 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 단백질 농도를 측정했습니다.

2.6. 유전 및 대사 분석을 위한 체외 및 생체 내 훈련 면역 모델

시험관 내 모델에서 부착성 단핵구는 음성 대조군으로서만 배양 배지, 2 μg/mL의 -1,3-(D)-글루칸 또는 5 μg/mL BCG(300BCG 코호트)와 함께 배양되었습니다. : BCG-Bulgaria 균주, Intervax, Canada), 10% 풀링된 인간 혈청이 있는 상태에서 37ºC에서 24시간 동안. 6일째에 세포를 200 μL RPMI 또는 LPS 10 ng/mL(혈청형 055: B5; Sigma-Aldrich)로 24시간 동안 재자극했습니다.

In vivo 모델에서 건강한 성인을 대상으로 표준 용량의 0.1 mL BCG를 왼쪽 상완에 피내로 접종하고 접종 전과 14일, 90일 후에 혈액을 채취했습니다. 방문할 때마다 5 × 105 PBMC를 열로 죽인 황색포도상구균(106 CFU/mL)으로 자극하거나 5% CO2로 37ºC에서 자극하지 않은 상태로 두었습니다. 분비된 사이토카인은 자극 24시간 후에 두 모델 모두에서 측정되었고, 훈련 자극에 의해 유도된 사이토카인 반응성의 배수 증가는 훈련된 면역에 대한 척도로 사용되었습니다[14].

2.7. 유전자 분석

유전자 분석은 Human Functional Genomics Project [15]에서 서유럽 혈통의 건강한 개인 코호트를 사용하여 수행되었습니다. 300BCG 코호트는 네덜란드 성인 325명(남성 44%, 여성 56%, 연령 범위 18~71세)으로 구성되었습니다. 이 연구는 지역 윤리 위원회 CMO 지역 Arnhem-Nijmegen, NL58553의 승인을 받았습니다.091.16. 개인(n=325)의 DNA 샘플은 시판되는 SNP 칩인 Illumina의 Infinium Global Screening Array MD v1.0을 사용하여 유전형을 분석했습니다. 광학 0.7.0은 기본 설정으로 유전자형 호출에 사용되었습니다[16]. 호출 속도가 0.99 이하인 샘플은 Hardy-Weinberg 평형(HWE)이 0.0001 이하이고 MAF(minor allele frequency)가 이하인 변이체와 마찬가지로 제외되었습니다. 0.001까지. Genotype Harmonizer[17]를 사용하여 1000 Genome 참조 패널에 대해 변이체 가닥을 정렬하고 식별했습니다. 그런 다음 인간 참조 컨소시엄(HRC r1.1 2016)을 참조 패널로 사용하여 미시간 전치 서버에서 샘플을 전가했으며 전가 품질에 대해 R2 < 0.3 및 MAF < 5%인 유전 변이를 필터링했습니다. [18] 후속 QTL 매핑을 위한 약 400만 개의 단일 염기 다형성(SNP)이 생성되었습니다. 300 BCG 코호트에서 총 267명의 개체에 대해 체외 훈련 면역 반응에 대한 유전자형 및 사이토카인 데이터를 모두 얻었습니다. 3개의 샘플은 약물 사용으로 인해 제외되었으며(그 중 1개는 유전적 특이치로 확인됨), 1개의 샘플은 연구 기간 동안 제1형 당뇨병의 발병으로 인해 제외되었습니다.

첫째, 훈련된 세포와 훈련되지 않은 세포 사이의 사이토카인 생산의 배수 변화를 훈련된 면역 반응의 크기에 대한 측정값으로 사용했습니다. 사이토카인 분포에 대한 품질 검사 후 유전적 이상값을 배제한 후, 우리는 사이토카인 생산의 배수 변화 분포를 수정하기 위해 나이와 성별을 공변량으로 하는 선형 회귀 모델을 사용하여 사이토카인 생산의 로그 변환된 배수 변화를 유전자형 데이터에 매핑했습니다. 우리는 훈련된 면역 반응에 영향을 미치는 암시적인 양적 특성 유전자좌(QTL) 연관성을 식별하기 위해 p < 9.99 × 10-3의 컷오프를 사용했습니다. 생체 내 훈련된 면역 모델을 사용하여 총 296명의 개체에 대한 유전자형 및 사이토카인 데이터를 모두 얻었습니다.

시험관내 QTL 매핑에 대해 기술된 특이치에 더하여, 18명의 저녁 백신 접종자가 제외되었고, 그 결과 QTL 매핑 전에 278개의 샘플이 생성되었습니다. 먼저, 원시 사이토카인 수준을 로그 변환하고 방문 사이의 사이토카인 생산 비율을 사이토카인 생산의 배수 변화로 취했습니다. 사이토카인 생산의 배수 변화는 연령과 성별을 공변량으로 하는 선형 회귀 모델을 사용하여 유전자형 데이터에 매핑되었습니다. 우리는 훈련된 면역 반응에 영향을 미치는 암시적인 QTL 연관성을 식별하기 위해 p < 9.99 × 10-3의 컷오프를 사용했습니다. R-패키지 Matrix-eQTL은 사이토카인 QTL 매핑에 사용되었습니다[19].

2.8. 대사체학 분석

BCG 백신 접종 전에 300 BCG 코호트에서 개인의 대사 산물 수준을 측정했습니다. 흐름 주입 비행 시간 질량(흐름 주입 TOF-M) 분광법[20]을 사용하여 General Metabolics(스위스 취리히)에서 대사 기능을 측정하고 주석을 달았습니다. 비표적 대사체는 인간 대사체 데이터베이스(HMDB)에 따라 주석을 달았습니다. 모든 대사 측정은 중복으로 수행되었으며 평균값은 대사 ​​산물 당 각 샘플에 대해 계산되었습니다. Spearman 상관관계 분석은 예방 접종 전 반응에 대한 대사체 및 체외 사이토카인 배수 변화에 대해 수행되었습니다. 글루타티온 수준과 유전자 분석에서 확인된 관심 SNP 간의 관계를 테스트하기 위해 각 SNP에 대해 연령과 성별을 공변량으로 포함하는 선형 회귀 분석을 수행했습니다.

2.9. 사이토카인 정량화 및 분석

IL{0}}, IL-6 및 TNF(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)에 대한 상용 ELISA 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 사이토카인 생산을 결정했습니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되고 양방향 반복 측정 ANOVA와 Sidak의 다중 비교 테스트로 분석됩니다. 0.05 미만의 p-값은 별표로 표시된 바와 같이 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다(* p < 0.05).

3. 결과

3.1. -글루칸 및 BCG로 유도된 훈련된 면역은 지속적인 반응성 산소 종 생산을 유발합니다.

증가된 ROS 방출은 이전에 훈련된 면역 표현형의 특징으로 설명되었습니다[21]. 글루칸 또는 BCG에 2시간 및 24시간 동안 노출된 단핵구는 증가된 ROS를 나타냅니다. 흥미롭게도, 이 증가는 배양 배지에서 5일 동안 휴식한 후에도 지속되고 존재했습니다(그림 1A). 향상된 ROS 수준은 24시간 동안 -글루칸에 노출된 단핵구에서 다양한 항산화 유전자의 전사 변화를 동반합니다(그림 1B). Mitochondrial superoxide dismutase SOD2 및 다른 티올 함유 분자, 즉 thioredoxin-dependent peroxide reductases 1-6(PRDX 1-6) 및 sulfiredoxin 1(SRXN1)이 상향 조절됩니다. 관련 티올 함유 ROS 스캐빈저인 티오레독신(TXN) 및 티오레독신 환원효소(TXNRD)의 발현도 증가합니다.

그림 1. 훈련된 단핵구의 증가된 ROS 수준은 향상된 전염증성 사이토카인 생산에 기여하지 않습니다. (A) 단핵구를 -글루칸 및 BCG에 노출한 후 2시간, 24시간 및 6일 후 ROS 수준(n=6/9 기증자, 2/3 독립 실험에서 모음. Fridman 테스트 Dunn의 다중 비교 테스트) . (B) 자극받지 않은 세포와 비교하여 24시간 동안 α-글루칸에 노출된 단핵구에서 항산화 방어에 관여하는 유전자의 발현 수준. 식은 log10(비율)로 표시됩니다. TNF 및 IL-6은 (C) 0.5μM DPI(n=6 기증자, 2개의 독립적인 실험에서 풀링됨) 및 (D ) 1mM NAC, 50μM AT 또는 0.5μM AA(n=6 기증자, 두 개의 독립적인 실험, 양방향 ANOVA, Sidak의 다중 비교 테스트에서 모음). (평균 ± SEM, * p < 0.05).

그러나 DPI(diphenyleneiodonium)로 주요 ROS 생성자 NADPH 옥시다제를 억제하거나 α-glucan과 함께 배양하기 전에 항산화 분자인 --tocopherol(AT) 및 ascorbic acid(AA)를 추가해도 증가된 대식세포 반응성을 조절하지 못했습니다. -글루칸에 노출된 대식세포에서 LPS 재자극 24시간 후 TNF 및 IL-6 분비는 이 약리학적 접근법에 의해 수정되지 않았습니다(그림 1C, D).

그러나 DPI 단독 노출은 LPS 자극 시 IL-6 생산을 증가시켰습니다. (그림 1C). 일반 ROS 스캐빈저 N-아세틸 시스테인(NAC)으로 전처리하면 글루칸에만 노출된 세포와 비교할 때 TNF 및 IL-6 생성이 감소했습니다(그림 1D). 종합하면, 우리는 증가된 ROS 생산이 α-글루칸 유도된 훈련된 면역의 증가된 사이토카인 생산에서 작은 역할을 한다는 것을 보여줍니다. 또한 NAC는 ROS 스캐빈저일 뿐만 아니라 글루타티온 합성의 전구체 역할을 할 수 있기 때문에 훈련된 면역 지속 증가된 ROS 수준은 세포 항산화제인 글루타티온의 조절과 관련이 있을 수 있습니다.

3.2. 글루타티온 대사는 훈련된 면역 반응에 영향을 미칩니다

24시간 동안 -글루칸에 노출된 단핵구는 이 시점에서 발견된 더 높은 ROS 수준에 의한 글루타티온(GSSG)의 산화된 형태의 더 높은 수준을 나타냅니다(그림 2A). 휴식 기간 후, 환원된 형태의 글루타티온(GSH)은 산화된 형태의 농도 변화 없이 훈련된 대식세포에서 증가하는 경향이 있습니다.

그림 2. 글루타티온 수치는 글루칸 노출 시 조절됩니다. (A) 1 μg/mL -글루칸으로 24시간 노출 후 및 휴식 기간 5일 후 단핵구에서 감소 및 산화된 글루타티온 세포내 수준(n=4 기증자, 2개의 독립적인 실험에서 풀링됨). (B) α-글루칸에 4시간 및 24시간 동안 노출된 단핵구에서 글루타티온 대사에 관여하는 유전자의 발현. 식은 log10(비율)로 표시됩니다. (C) 100 μM BSO(n=9 기증자, 3개의 독립적인 실험에서 풀링됨, * p < 0.05 양방향 ANOVA로 1시간 전처리 후 -글루칸 훈련된 대식세포에 의해 생성된 TNF 및 IL-6 , Sidak의 다중 비교 테스트)(평균 ± SEM).

속도 제한 효소 글루타메이트 시스테인 리가제(GCLC 및 GCLM)의 소단위를 암호화하는 유전자는 대조군 단핵구에 비해 글루칸 자극 후 4시간에 증가된 발현을 나타냅니다. 글루타티온 환원효소(GSR), 글루타티온 퍼옥시다제 7(GPX7) 및 글루타레독신 계열(GLRX, 2, 5)의 효소도 24시간 시점에서 상향조절됩니다(그림 2B). 글루타티온 재활용률. -glucan 노출 전에 buthionine sulfoximine(BSO)으로 GCL의 활성을 약리학적으로 억제하면 LPS 재자극 후 IL-6 생성이 감소합니다(그림 2C). 따라서, 전구체 NAC의 첨가에 의한 보충 또는 BSO로 효소 GCL을 차단함으로써 감소하는 글루타티온 수준의 외인성 조절은 α-글루칸을 약화시켜 이차 자극에 대한 반응성을 증가시켰다.

글루타티온 대사에 관여하는 유전자의 유전적 변이가 훈련된 면역에 영향을 미치는지 여부를 추가로 조사하기 위해 325명의 건강한 개인 코호트를 사용하여 QTL 매핑을 수행했습니다. 우리는 글루타티온 대사와 관련된 유전자에서 MAF(minor allele frequency) > 0.05를 갖는 일반적인 SNP가 -글루칸 및 BCG 시험관 내 훈련 시 단핵구의 전염증성 사이토카인 생산 능력의 변화와 관련이 있는지 테스트했습니다(그림 3A, 씨).

유사하게, 우리는 또한 278명의 건강한 개인의 BCG 백신 접종에 의해 유도된 생체 내 훈련된 면역에 대한 이러한 유전적 변이의 영향을 평가했습니다(그림 3B, C). 글루타티온 대사에 관여하는 유전자의 250kb 창 내의 여러 SNP는 훈련 후 IL-1 , TNF 및 IL-6 분비의 상향 조절과 암시적으로 연관되어 있었습니다(p-값 < 9.99 × 10-3 ). (그림 3A, B).

동일한 코호트에서 BCG 백신 접종 전에 글루타티온 대사에 관여하는 혈장 대사 산물을 측정했습니다. 시험관 내 및 생체 내 분석에서 확인된 SNP는 순환 글루타티온 농도와 유의하게 연관되었습니다(p-값 < 0.05)(그림 3D). 또한, BCG 백신 접종 90일 후 이종 자극인 Staphylococcus aureus에 대한 체외 노출 시 혈장 글루타티온 농도와 체외 IL-1 생산 사이의 긍정적인 연관성을 발견했습니다(그림 3E). BCG 백신 접종에 의한 IL-1 생산의 상향 조절은 또한 메티오닌, 시스테인, 글루타메이트 및 글리신과 같은 글루타티온 대사에 관여하는 다른 대사 산물의 순환 농도와 양의 관계가 있습니다(그림 3E). 전반적으로, LPS(그림 3A) 또는 S. aureus(그림 3B)에 대한 선천적 이종 반응에 대한 QTL을 포함하는 글루타티온 대사에 관여하는 유전자와 글루타티온 혈청 수준과 생체 외 IL-1 생산 사이의 상관관계는 둘 다 다음을 가리킵니다. 훈련된 면역의 확립에서 이 경로의 역할.

그림 3. 글루타티온은 훈련된 면역 기능과 관련이 있습니다. 글루타티온 대사에 관여하는 유전자에 매핑된 SNP와 (A)-글루칸 및 BCG(IL-6에 대한 n=251 건강한 지원자 및 TNF에 대한 n=238 건강한 지원자) 및 (B) 생체 내 BCG 훈련 반응(n {{10}} 건강한 자원봉사자). (C) 분석당 최저 p-값 SNP의 박스플롯(rs7768134, rs35568915). (D) rs2233294(GPX3) 및 rs10136944(GLRX5, n=302)에 대한 유전자형으로 계층화된 글루타티온 혈장 수준(연령 및 성별에 대해 보정됨)을 보여주는 박스플롯. 각 SNP에 대한 p-값은 관심 SNP를 독립 변수로, 글루타티온(연령 및 성별에 대해 보정됨)을 종속 변수로 사용하는 선형 회귀 모델에서 파생됩니다. (E) 글루타티온 대사와 관련된 기준선에서의 순환 대사물 대 PBMC 유래 S. 아우레우스 유발 IL-6, IL-1 및 TNF 반응의 배수 변화 사이의 Spearman 상관관계는 14일 또는 90일 후에 측정되었습니다. 기준선과 비교한 BCG 백신 접종(n=297명의 건강한 지원자). 이 표는 각 상관관계에 대한 Spearman의 rho를 나타내며 빨간색으로 표시된 상관관계는 유의미한 양의 상관관계를 강조합니다(* p < 0.05, ** p < 0.01). 0일과 비교하여 90일에서 글루타티온 농도와 IL-1 생산의 배수 변화 사이의 상관관계는 산점도의 예로서 제공됩니다.

4. 토론

대식세포는 다양한 환경 자극에 대한 표현형을 적응시키는 플라스틱 세포입니다. 훈련된 대식세포는 증가된 해당작용, TCA 주기 및 산화적 인산화와 함께 고에너지 대사에 의존하여 향상된 전염증성 사이토카인 생산으로 반응을 시작합니다[6,22].

사이토카인 생산에 더하여, 재자극된 BCG로 훈련된 대식세포에서 빠른 ROS 생산과 함께 산화 폭발이 증가합니다[8]. BCG 처리 마우스에서 분리한 비장 호중구도 증가된 ROS 생산을 나타냅니다[23]. 증가된 대사율과 산화적 폭발을 일으키기 위한 증가된 용량에 따라 α-글루칸 또는 BCG에 노출된 단핵구와 대식세포가 기초 ROS 생산의 증가를 나타내는 것을 관찰했습니다. ROS 방출의 유사한 증가는 이전에 oxLDL로 훈련된 단핵구에서 보고되었습니다[9]. ROS는 병원균 제거에 효과기 기능을 가지고 있지만 신호 전달을 중재할 수도 있습니다[24]. ROS 생성 효소 NOX의 약리학적 억제 또는 항산화 분자인 -tocopherol 및 ascorbic acid로의 처리는 -glucan 증가된 사이토카인 생산을 제거하지 못했습니다. 그러나 ROS 스캐빈저 NAC는 -glucan에 의해 강화된 TNF의 생성을 억제하여 훈련된 면역에서 ROS의 가능한 역할을 나타냅니다.

흥미롭게도 NAC는 항산화 분자일 뿐만 아니라 주요 내인성 항산화 분자인 글루타티온의 전구체 역할도 합니다. 두 가지 주요 세포 산화환원 시스템, 즉 NAD + /NADH와 같은 피리딘 뉴클레오티드와 글루타티온 및 티오레독신을 포함하는 티올 시스템이 있습니다. NAD + /NADH 비율은 우리가 ROS 수준에 대해 보고한 것과 유사하게 훈련된 대식세포에서 분화 기간 후 지속적인 방식으로 글루칸에 노출된 단핵구에서 증가합니다[22]. 여기서 우리는 GSH 농도가 훈련된 면역에서도 조절된다는 것을 보여줍니다.

가장 놀랍게도, GSH 감소 형태의 농도는 분화된 훈련된 대식세포에서만 강화되는 반면, 산화된 GSSG의 수준은 안정적입니다. 이것은 훈련된 대식세포가 NAD + /NADH와 달리 지속적인 ROS 생산과 협력하지 않는 GSH 저장을 증가시켰음을 시사합니다. 훈련된 면역에 대한 글루타티온 대사의 기여는 건강한 개인 코호트(300BCG)의 유전 및 대사 분석을 통해 더욱 강화됩니다. GSH 관련 유전자 내의 일반적인 유전자 다형성은 시험관 내 및 생체 내에서 훈련된 면역에 대한 사이토카인 생산의 크기에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌습니다(p < 9.99 × 10-3 ). 또한, 이들 QTL 유전자좌 중 두 개, chr5의 GPX3 및 chr14의 GLRX5가 GSH 혈장 농도와 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다(p < 0.05).

GSH는 항산화 분자이지만 다양한 후생유전학적 기전을 통해 유전자 발현을 조절하는 것으로도 알려져 있다. GSH는 뉴클레오솜 단백질 히스톤 H3의 S-글루타티오닐화에서 관찰되는 바와 같이 번역 후 변형에 참여하고 궁극적으로 s-아데노실 메티오닌(SAM) 생산을 유도하는 메티오닌 경로에 의해 구동됩니다. SAM은 DNA와 히스톤 메틸화에 사용되는 주요 메틸 기증자입니다[7]. TCA 회로 대사산물인 fumarate는 훈련된 대식세포에 축적되며, 그 유도체인 monomethyl fumarate는 훈련된 면역 표현형을 유도합니다[5]. 성상세포에서 파생된 dimethyl fumarate에 대한 급성 노출은 세포 내 GSH를 고갈시키지만 나중에 총 GSH를 증가시킵니다[25]. 훈련된 면역은 장기 기억을 부여하는 후성적 변형에 의해 고정됩니다[26]. 여기에서 관찰된 훈련된 대식세포의 증가된 GSH 함량은 선천적 면역 기억의 확립에 필요한 후생적 재배선을 촉진할 수 있습니다.

여기에서 우리는 글루타티온의 약리학적 조절과 세포의 산화환원 상태가 대식세포의 이종 반응을 감소시킨다는 것을 보여줍니다. 이는 BSO 또는 NAC가 글루칸 강화 사이토카인 생산에 미치는 영향으로 볼 수 있습니다. 또한, 건강한 개인 집단에서 GSH 대사는 훈련된 면역 특성과 관련이 있습니다. GSH 대사에 의해 형성되는 훈련된 면역 메커니즘은 더 탐구되어야 하지만, 대사 및 후생유전학 환경 모두의 잠재적 관련성은 이 대사 허브를 향후 연구에서 조사할 흥미로운 방법으로 만듭니다. 이러한 통찰은 훈련된 면역의 대사 및 후생유전적 연결을 밝히는 데 기여하여 건강과 질병에 대한 선천적 면역 영향을 더 잘 이해할 수 있게 합니다. 궁극적으로 더 나은 이해는 선천적 면역 과정의 조절 장애를 특징으로 하는 질병에서 치료의 새로운 목표를 식별하는 데 도움이 될 것입니다.

저자 기여:

개념화: AVF 및 JD-A.; 방법론: AVF, VACMK, VM 및 JCA-B., MAG; 공식 분석: AVF, VACMK, VM 및 JCA-B.; 조사 AVF, JCA-B., SK, LCJdB, SJCFMM, VPM 및 BN; 데이터 큐레이션: AVF, VACMK, VM 및 BN; 작문 - 원본 초안 준비, AVF; 쓰기—검토 및 편집: 모든 공동 저자; 감독: MAG, MGN 및 JD-A.; 자금 조달: MAG 및 MGN 모든 저자는 원고의 게시된 버전을 읽고 이에 동의했습니다.

자금 조달:

JD-A. 네덜란드 과학 연구 기구(VENI 보조금 09150161910024)의 지원을 받습니다. MGN. ERC Advanced Grant(833247)와 네덜란드 과학 연구 기구의 Spinoza Grant에 의해 지원됩니다. AVF는 Fundação para a Ciência ea Tecnologia(FCT, Ph.D. 보조금 PD/BD/135449/2017)의 지원을 받습니다. JCAB는 콜롬비아의 COLCIENCIAS 과학, 기술 및 혁신 관리부(756/2016로 전화)의 보조금으로 지원됩니다. BN은 NHMRC(호주) 조사자 보조금(APP1173314)의 지원을 받습니다.

기관 검토 위원회 성명서:

300BCG 연구는 지역 윤리 위원회 CMO 지역 Arnhem-Nijmegen, NL58553.091.16의 승인을 받았습니다.

정보에 입각한 동의서:

윤리 위원회 Arnhem-Nijmegen(nr. 2010-104)의 승인에 따라 연구에 관련된 모든 피험자로부터 사전 동의를 얻었습니다.

데이터 가용성 진술:

이 연구에서 제시된 RNA 시퀀싱 데이터는 수탁 번호 GSE85243으로 NCBI Gene Expression Omnibus에서 사용할 수 있습니다.

감사의 말:

저자는 300BCG 연구에 참여한 모든 지원자에게 감사를 표합니다.

이해 상충:

MGN은 TTxD의 과학적 설립자입니다. 나머지 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다. 자금 제공자는 연구 설계에 아무런 역할도 하지 않았습니다. 데이터 수집, 분석 또는 해석, 원고 작성 또는 결과 출판 결정.

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Anaisa V. Ferreira 1,2,* , Valerie ACM Koeken 1,3,4 , Vasiliki Matzaraki 1 , Sarantos Kostidis 5 , Juan Carlos Alarcon-Barrera 5 , L. Charlotte J. de Bree 1 , Simone JCFM Moorlag 1 , Vera P .Mourits 1, Boris Novakovic 6,7, Martin A. Giera 5, Mihai G. Netea 1,8 및 Jorge Domínguez-Andrés.

1 Radboud University Nijmegen Medical Center, 6500 HB Nijmegen, The Netherlands의 내과 및 Radboud 전염병 센터(RCI);

Valerie.Koeken@radboudumc.nl (VACMK); Vasiliki.Matzaraki@radboudumc.nl (VM);

Charlotte.deBree@radboudumc.nl (LCJdB); Simone.Moorlag@radboudumc.nl (SJCFMM);

Vera.Mourits@radboudumc.nl (VPM); Mihai.Netea@radboudumc.nl (MGN).

2 Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4050-313 Porto, Portugal.

3 TWINCORE, Helmholtz-Centre for Infection Research(HZI)와 Hannover Medical School(MHH) 간의 합작 회사, 30625 Hannover, Germany.

4 Helmholtz-Centre for Infection Research(HZI)와 Hannover Medical School(MHH) 간의 합작 회사인 개별 감염 의학을 위한 전산 생물학과, 개별 감염 의학 센터(CiiM), 독일 하노버 30625.

5 Leiden University Medical Center(LUMC) Proteomics and Metabolomics 센터, 2333 ZA Leiden, The Netherlands; s.kostidis@lumc.nl (SK); jcalarcon_barrera@lumc.nl (JCA-B.);m.a.giera@lumc.nl (MAG)

6 Epigenetics Research, Murdoch Children's Research Institute, Parkville, VIC 3052, Australia;boris.novakovic@mcri.edu.au.

7 소아과, University of Melbourne, Melbourne, VIC 3052, Australia.

8 본 대학교 생명의학연구소(LIMES) 유전체학 및 면역조절학과, 53115 본, 독일.

* 대응: anaisa.validoferreira@radboudumc.nl(AVF); Jorge.dominguezandres@radboudumc.nl (JD-A.); Tel.: 플러스 31-2436-16636 (JD-A.).

For more information:1950477648nn@gmail.com