Cistanche Deserticola 다당류는 뼈 흡수에 어떤 영향을 미칩니까?

Cistanche Deserticola 다당류는 RANKL 신호 전달 및 활성 산소 종 생성을 억제하여 파골세포 생성 및 골 흡수를 약화시킵니다.

Dezhi Song et al

골다공증은 골감소증과 골미세구조의 악화를 특징으로 하는 대사성 질환이다. 파골세포는 골기질을 분해하는 1차 효과기 세포로 비정상적인 기능으로 인해 골다공증이 발생합니다. 세포 대사 동안 활성 산소 종(ROS) 축적은 파골 세포 증식 및 분화를 촉진하여 골다공증에서 중요한 역할을 합니다.시스탄체데저스티콜라다당류(CDP) 보유항종양,항염증, 항산화 활성. 그러나 CDPon 파골세포의 영향은 불분명합니다. 본 연구에서는 tartrate-resistant acid phosphatase 염색, 면역형광, 역전사-중합효소 연쇄반응, 웨스턴블롯 분석을 통해 CDP(시스탄체데저스티콜라다당류)파골세포 생성과 수산화인회석 흡수를 억제합니다. 또한 CDP는(시스탄체데저스티콜라다당류)또한 Ctsk, Mmp9 및 Acp5를 포함한 파골세포 마커 유전자의 발현을 억제하였고, 핵인자 κB(RANK) 발현의 수용체 활성화제에는 영향을 미치지 않았다. 기계론적 분석에 따르면 CDP(시스탄체데저스티콜라다당류)항산화 효소의 발현을 증가시켜 파골세포에서 RANKL 매개 ROS 생성을 약화시키고 활성화된 T 세포의 핵 인자 및 미토겐 활성화 단백질 키나제 활성화를 억제합니다. 이러한 결과는 CDP가 과도한 파골세포 활성으로 인한 골다공증 치료의 후보약물이 될 수 있음을 시사한다.

키워드뼈 흡수,시스탄체데저스티콜라다당류, MAPK, 파골세포, 활성산소종

1|소개

조골세포에 의해 매개되는 뼈 형성과 파골세포에 의해 매개되는 뼈 흡수 사이의 균형은 뼈 대사 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다(Manolagas, 2000; Zhuet al., 2018). 골흡수가 골형성을 초과하면 골량 감소와 골 미세구조 손상을 특징으로 하는 골다공증이 발생한다(Ikeda, 2008). 골다공증은 노년층과 폐경 후 여성에게 흔한 질병이며 그 발병기전은 완전히 밝혀지지 않았습니다(Cooper & Melton, 1992). 에스트로겐 결핍은 골다공증의 주요 원인입니다(Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013). 또한, 반응성 산소종(ROS)은 핵 인자 κB 리간드(RANKL)의 수용체 활성화제에 의해 유도될 수 있으며 파골 세포 형성과 연관되어(Yip et al., 2005), 따라서 골다공증의 발병에 기여할 수 있다(Manolagas, 2010). 일부 연구에서는 Nrf2-항산화 결핍이 ROS 수준을 증가시키고 RANKL에 의한 파골세포 분화를 촉진한다는 것을 발견했습니다(Hyeon, Lee, Yang, &Jeong, 2013). 따라서 파골세포 분화 동안 ROS 생성을 감소시키는 것은 골다공증 치료를 위한 치료 전략으로 평가되어야 한다.

파골세포는 단핵구 또는 대식세포 조혈 계통에서 유래하며 골 흡수를 수행하는 유일한 다핵 세포입니다(Teitelbaum, 2000). 따라서 파골세포 형성을 포함하는 연구는 골대사 질환에 대한 효과적인 치료법을 개발하는 데 매우 중요합니다(Lorenzo, 2017). 조골세포와 활성화된 T 세포에서 생성되는 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF)와 RANKL은 파골세포 형성을 조절하는 중요한 사이토카인이다(Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL은 파골세포 형성 동안 활성화되는 중요한 전사 인자인 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFATc1)의 발현을 유도한다(Ishidaet al., 2002). 활성화된 NFATc1은 파골세포 생성 및 파골세포 기능을 조절하는 TRAcP(tartrate-resistant acid phosphatase) 및 CTSK(cathepsin K)와 같은 파골세포 마커 유전자의 발현을 촉진합니다(Balkan et al., 2009; Crottiet al., 2008).

시스탄체데저스티콜라다당류(CDP)는 다육질 줄기에서 분리됩니다.시스탄체면역 조절, 항종양, 노화 방지 및 기타 약리학적 효과를 가지고 있습니다(Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo, & Du, 2012). CDP(시스탄체데저스티콜라다당류)쥐의 미세아교세포(BV-2 세포, Nan et al., 2013)에서 지질다당류로 유도된 산화질소(NO) 생성을 억제하는 효과가 있었습니다. 또한 아페닐에타노이드가 풍부한 추출물(ECD)은시스탄체근육 손상 감소, 젖산 축적 지연, 에너지 저장 개선을 통해 쥐의 수영 능력을 향상시켰습니다(Cai et al., 2010). 그러나 CDP가 파골세포 기능과 활동에 미치는 영향은 아직 알려지지 않았습니다.

이 연구에서 우리는 CDP가(시스탄체데저스티콜라다당류)RANKL에 의한 파골세포 분화와 골흡수를 억제한다. 근본적인 메커니즘은 CDP가(시스탄체데저스티콜라다당류)항산화 효소의 발현을 증가시켜 ROS 생성을 약화시킨 다음 RANKL-activatedNFAT 및 MAPK(mitogen-activated protein kinase)-시그날링 캐스케이드를 억제합니다. 이러한 결과는 CDP가(시스탄체데저스티콜라다당류)과도한 파골세포 골흡수로 인한 골다공증을 치료하는 데 사용할 수 있습니다.

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2|재료 및 방법

2.1|재료

CDP(시스탄체데저스티콜라다당류)(순도 > 98%)는 Solarbio(Beijing, China)에서 구입하여 PBS(phosphate-buffered saline)에서 1mM의 스톡 농도로 준비했습니다. 항체는 c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, 인산화(p)-ERK, p-p38, p-JNK 및 -액틴에 대해 특이적입니다. Cruz Biotechnology(San Jose, CA). V-ATPase d2에 대한 항체는 이전에 설명한 대로 생성되었습니다(H. Feng et al., 2009). 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸륨(MTS) 및 루시퍼라제 분석 시스템은 Promega(Sydney, Australia)에서 구입했습니다. 재조합 M-CSF는 R&D Systems(Minneapolis, MN)에서 구입했습니다. 재조합 GST-rRANKL 단백질은 이전에 기술된 바와 같이 발현 및 정제되었다(Xu et al., 2000).

2.2|세포 배양

RAW264.7 세포(마우스 대식세포)는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)에서 얻었고 10% 소태아혈청, 2mM의 L-글루타민이 보충된 변형 최소 필수 배지(Thermo FisherScientific, Scoresby, Australia)에서 배양했습니다. , 100U/ml의 페니실린 및 100ug/ml의 스트렙토마이신(완전 배지). 골수 유래 단핵구(BMM)는 6주령 C57BL/6J 마우스에서 분리되었으며 웨스턴 오스트레일리아 대학교 동물 윤리 위원회(RA/3/100/1244)의 승인된 절차에 따라 안락사되었습니다. 연조직을 제거하고 골수를 대퇴골과 경골에서 씻어낸 다음 M-CSF(50ng/ml)가 있는 완전 배지에서 배양했습니다.

2.3|파골세포 생성 분석

BMM을 96웰 배양 플레이트에 웰당 6×103세포의 밀도로 플레이팅하고 M-CSF(50ng/ml) 및 GST-rRANKL(100ng/ml)을 포함하는 완전 배지로 처리하였다. 다양한 농도의 CDP(시스탄체데저스티콜라다당류). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>3개의 핵)이 파골세포로 확인되었다.

2.4|세포독성 분석

BMM을 96웰 플레이트에 웰당 6 × 103 세포로 시딩하고 밤새도록 부착했습니다. 다음날, 세포를 다양한 농도의 CDP로 배양하였다.(시스탄체데저스티콜라다당류). 추가 48시간 후, MTS 용액(20㎕/웰)을 첨가하고 2시간 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 흡광도 490 nm는 마이크로플레이트 판독기(MultiscanSpectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2.5|면역형광 염색

BMM은 M-CSF(50ng/ml)의 존재 하에 밤새 웰당 6 × 103 세포의 밀도로 시딩되었습니다. 그런 다음 성숙한 파골세포가 형성될 때까지 세포를 M-CSF 및 GST-rRANKL(100ng/ml)로 자극했습니다. 그런 다음 파골세포를 다양한 농도의 CDP로 처리했습니다.(시스탄체데저스티콜라다당류)48시간 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 0.1% Triton X-100–PBS로 투과성으로 만들고, PBS 중 3% 소 혈청 알부민으로 차단합니다. 준비된 세포를 로다민 결합 팔로이딘과 함께 45분 동안 F-액틴에 대한 염색에 어둡습니다. 그런 다음 세포를 PBS로 세척하고 핵을 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 대조염색하고 공초점 현미경을 위한 커버슬립으로 장착했습니다.

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2.6|수산화인회석 흡수 분석

파골세포 활성을 측정하기 위해 6웰 콜라겐 코팅 플레이트(BD Biocoat; ThermoFisher Scientific)에서 배양된 BMM(웰당 1 x 105개 세포)을 GST-rRANKL(100ng/ml) 및 M-CSF(50ng/ml)로 자극했습니다. ) 성숙한 파골세포가 생성될 때까지(Zhou et al., 2016). 그런 다음 세포 해리 용액(Sigma-Aldrich)을 사용하여 플레이트에서 세포를 부드럽게 분리하고 동일한 수의 성숙한 파골 세포를 수산화인회석으로 코팅된 96웰 플레이트(Corning Osteoassay, Corning, NY)의 개별 웰에 접종했습니다. 성숙한 파골세포는 CDP가 있거나 없는 GST-rRANKL 및 M-CSF가 포함된 배지에서 배양되었습니다.(시스탄체데저스티콜라다당류)표시된 농도에서. 48시간 후, 웰의 절반을 TRAcP 활성에 대해 면역조직화학 염색하여 위에서 설명한 바와 같이 웰당 다핵 세포의 수를 평가합니다. 나머지 웰을 10분 동안 표백하여 세포를 제거하고 재흡수된 영역을 측정했습니다. 흡수된 영역은 표준 광학 현미경으로 사진을 찍고 Image J 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD)를 사용하여 파골 세포에 의해 표면에 흡수된 수산화인회석의 면적 백분율을 정량화했습니다.

2.7|루시퍼라제 리포터 분석

NFATc1 전사 활성화를 조사하기 위해 RAW264.7 세포를 NFATc1 반응성 루시퍼라제 리포터 구조로 안정적으로 형질감염시켰다(Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). 형질감염된 세포를 48웰 플레이트에서 밀도1로 배양했습니다. 웰당 .5 × 105개 세포 및 다양한 농도의 CDP로 전처리됨(시스탄체데저스티콜라다당류)1시간 동안 전처리 후, 세포를 GST-rRANKL(100ng/ml)로 24시간 동안 자극하고, 제조사의 프로토콜(Promega)에 따라 루시퍼라제 리포터 분석 시스템을 사용하여 루시페라제 활성을 측정하였다.

2.8|정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 분석

제조사의 프로토콜(Thermo Fisher Scientific)에 따라 Trizol 시약을 사용하여 세포로부터 총 RNA를 분리했습니다. Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase와 1ug의 RNA template와 oligo-dT primer를 이용하여 상보적 DNA를 합성하였다. 특정 서열의 중합효소연쇄 반응 증폭은 5분 동안 94도, 이어서 40초 동안 94도, 40초 동안 60도, 40초 동안 72도의 30 사이클 및 5분의 최종 확장 단계를 사용하여 수행되었습니다. 72도 . 특정 프라이머의 자세한 정보는 표 1에 나와 있습니다. 상대적 메신저 RNA 수준은 하우스키핑 유전자 Hmbs의 발현에 대한 정규화에 의해 계산되었습니다.

table 1

2.9|웨스턴 블롯 분석

BMM을 6웰 플레이트에 M-CSF가 포함된 완전 배지에서 배양하고 명시된 시간 동안 GST-rRANKL(100ng/ml)로 자극했습니다. 세포를 방사성면역침전 용해 완충액에 용해시키고 단백질을 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분해하고 폴리(비닐리덴 플루오라이드) 막(GE Healthcare, Silverwater, Australia)으로 옮겼다. 막을 5% 탈지유에서 1시간 동안 차단한 다음 4도에서 밤새 부드럽게 흔들어 다양한 특정 1차 항체로 프로브했습니다. 멤브레인을 세척한 다음 양고추냉이 퍼옥시다제 결합 이차 항체와 함께 배양했습니다. 그런 다음 항체 반응성이 향상된 화학발광 시약(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)으로 검출되었고 Image-quant LAS 4000(GE Healthcare)으로 시각화되었습니다.

2.10|세포내 ROS 검출

세포 내 ROS 수준은 2',7'-dichlorofluorescein diacetate 세포 ROS 검출 분석 키트(Abcam, Melbourne, Australia)를 사용하여 검출되었습니다. BMM(웰당 5×103 세포)을 96웰 플레이트에서 배양하고 RANKL(100ng/ml), M-CSF(50ng/ml) 및 CDP로 72시간 동안 처리했습니다. 세포 내 ROS 수준은 2',7'-dichlorofluorescein diacetate를 사용하여 측정되었으며, 이는 ROS의 존재 하에 형광 DCF로 산화됩니다. 세포를 Hank 완충액으로 세척하고 10 μM의 DCFH-DA와 함께 암실에서 30분 동안 배양했습니다. 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 얻었습니다.

2.11|통계 분석

모든 데이터는 달리 표시되지 않는 한 세 번 이상 반복적으로 수행된 실험을 나타냅니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 결과 간 차이의 유의성을 결정하기 위해 Student-Newman-Keulspost hoc 테스트가 뒤따른 일원 분산 분석을 사용했으며 p < 0.05는="" 유의미한="" 것으로="">

3|결과

3.1|CDP는 RANKL 유도 파골세포 생성 및 파골 세포 융합을 억제합니다

CDP 여부를 확인하려면(시스탄체데저스티콜라다당류)RANKL 유도 파골세포 형성을 억제할 수 있기 때문에 먼저 마우스 BMM을 사용하여 파골세포 형성 분석을 수행했습니다(Liu et al., 2013; Song et al., 2016). BMM은 CDP 농도를 증가시키면서 5일 동안 RANKL 및 M-CSF로 처리하였다. CDP 농도가 높을 때 CDP는 TRAcP 양성 다핵 세포의 수를 감소시켰습니다.(시스탄체데저스티콜라다당류)5 μM 이상에 도달했습니다(그림 1a,b). CDP를 평가하려면(시스탄체데저스티콜라다당류)독성을 확인하고 이러한 결과가 세포 사멸 또는 수를 반영하지 않았음을 확인하고 MTS 분석을 수행했습니다. BMM은 다양한 용량의 CDP로 48시간 동안 RANKL 및 M-CSF로 처리되었습니다.(시스탄체데저스티콜라다당류). CDPhad는 15 μMor 미만의 농도에서 BMM 증식에 영향을 미치지 않습니다(그림 1c).

CDP의 효과를 테스트하려면(시스탄체데저스티콜라다당류)파골 세포 융합에서 파골 세포는 다양한 용량의 CDP를 사용하거나 사용하지 않고 RANKL 및 M-CSF 처리로 유도되었습니다.(시스탄체데저스티콜라다당류). 파골세포를 로다민-팔로이드 및 DAPI로 염색하여 파골세포당 핵 수를 평가했습니다(그림 2a). 파골세포 수와 평균 핵 파골세포 수는 CDP 이후 감소했습니다.(시스탄체데저스티콜라다당류)처리(5-10 μM, 그림 2b,c). 따라서 CDP(시스탄체데저스티콜라다당류)RANKL에 의한 파골세포 형성과 파골세포 융합에 대한 억제 효과가 용량 의존적이었다.

3.2|CDP(시스탄체데저스티콜라다당류)RANKL에 의해 유도된 파골세포 수산화인회석 흡수 활성을 약화시킵니다.

CDP의 효과를 확인하기 위해 수산화인회석 재흡수 분석을 수행했습니다.(시스탄체데저스티콜라다당류)파골 세포 기능 (그림 3a). 24시간 배양 후 웰당 파골세포의 수는 변화하지 않은 반면 수산화인회석 흡수 면적은 대조군과 비교할 때 5 및 10 μM CDP 처리에 의해 유의하게 감소되었습니다(그림 3b,c). 이러한 결과는 CDP가(시스탄체데저스티콜라다당류)세포 독성 효과 없이 파골 세포 형성과 파골 세포 흡수 활성 모두에 강력한 억제 효과가 있습니다.

3.3|CDP(시스탄체데저스티콜라다당류)파골세포 마커 유전자 발현 억제

CDP의 억제 효과를 더 조사하려면(시스탄체데저스티콜라다당류)파골세포 형성 및 파골세포 골 흡수에 대해 다양한 농도의 CDP를 사용하여 BMM을 RANKL 및 M-CSF로 5일 동안 처리했습니다.(시스탄체데저스티콜라다당류)그런 다음 .RT-PCR을 수행하여 파골세포 마커 유전자의 발현을 검출했습니다. 파골세포 형성 과정에서 중요한 전사 인자인 Nfatc1의 발현은 CDP에 의해 억제되었습니다.(시스탄체데저스티콜라다당류)용량 의존적 방식으로(그림 4a). 또한 CDP는(시스탄체데저스티콜라다당류)(5 및 10 μM) Mmp9, Ctsk 및 Acp5를 포함한 골 흡수 관련 유전자의 발현을 하향 조절했습니다(그림 4b-d).

3.4|CDP는 NFATc1 활성 및 다운스트림 단백질 발현을 억제합니다.

CDP의 효과를 조사하기 위해(시스탄체데저스티콜라다당류)RANKL에 의해 유도된 NFATc1 활성에 대해 aluciferase report assay를 시행하였다. CDP로 치료(시스탄체데저스티콜라다당류), 5 μM 이상의 농도는 RANKL 유도 NFATc1 활성을 유의하게 억제했습니다(그림 5a). 또한 Western blot 분석 결과 CDP가(시스탄체데저스티콜라다당류)RANKL과 M-CSF를 3일과 5일 동안 처리한 BMM에서 NFATc1과 c-Fos의 단백질 발현을 유의하게 억제했습니다(그림 5b). 또한, V-ATPase-d2 및 CTSK와 같은 파골 세포 기능 관련 단백질의 발현은 CDP의 존재하에 하향 조절되었습니다.(시스탄체데저스티콜라다당류)대조군과 비교. 그러나 CDP는 RANK 발현에 영향을 미치지 않았습니다(그림 5b).

3.5|CDP는 RANKL 유도 파골세포 생성 동안 ROS 생성을 소거하기 위해 항산화효소의 발현을 촉진합니다

CDP 의존성 파골세포 형성 억제의 기본 메커니즘을 조사하기 위해 BMM을 PBS 또는 CDP와 함께 RANKL(100ng/ml) 및 M-CSF(50ng/ml)로 처리했습니다.(시스탄체데저스티콜라다당류)72시간 동안 RANKL에 의해 자극된 세포 내 ROS 생성에 대한 CDP의 효과를 조사했습니다. 세포 내 ROS 수준은 CDP(5 및 10 μM, 그림 6a)에 의해 감쇠된 RANKL 처리에 의해 증가되었습니다. ROS 양성 세포의 수와 ROS 염색의 강도는 모두 용량 의존적으로 CDP 처리에 의해 감소되었다(그림 6b,c). 웨스턴 블롯 분석은 CDP가(시스탄체데저스티콜라다당류)3일 동안 RANKL 및 M-CSF로 처리된 BMM에서 유도성 산화질소 합성효소(NOS2)의 발현을 억제하면서 티오레독신(TRX1) 및 글루타티온 환원효소(GSR) 발현을 촉진했습니다(그림 6d).

CDP인지 자세히 알아보려면(시스탄체데저스티콜라다당류)ROS 생성을 줄임으로써 파골 세포 분화를 억제 한 다음 BMM에 과산화물 (10 μM)을 처리하여 세포에서 높은 ROS 상태를 모방했습니다. BMM은 RANKL과 M-CSF에 의해 3일 동안 유도되었고 Westernblot 분석과 RT-PCR 결과 과산화물이 대조군에 비해 NFATc1과 c-Fos 발현을 촉진하는 것으로 나타났다. 그림 5의 결과와 일치하게, NFATc1과 c-Fos의 발현은 CDP에 의해 억제되었습니다.(시스탄체데저스티콜라다당류)과산화물은 CDP의 억제 효과를 구출했습니다(그림 6e, f). 이 데이터는 CDP가 ROS 생성을 소거함으로써 NFATc1 및 c-Fos의 발현을 억제함을 나타냅니다.

3.6|CDP(시스탄체데저스티콜라다당류)RANKL 유도 파골세포 형성 동안 MAPK 경로 억제

다음으로 CDP의 효과를 조사했습니다.(시스탄체데저스티콜라다당류)RANKL 매개 TRAF6 발현 및 MAPK 경로 활성화에 대한 치료. 무혈청 배지에서 2시간 동안 인큐베이션한 후 BMM을 RANKL로 60분 동안 CDP 없이 또는 CDP로 자극했습니다. CDP(10 μM)를 사용한 자극은 TRAF6 발현에 영향을 미치지 않았고 10분 및 20분에 JNK2 및 ERK1/2의 인산화를 약화시켰습니다(그림 7). 또한, p38 인산화는 CDP에 의해 유의하게 억제되었습니다.(시스탄체데저스티콜라다당류)대조군과 비교하여 60분의 치료(그림 7). 이 데이터는 CDP가(시스탄체데저스티콜라다당류)파골세포 형성 및 활성에 대한 억제 효과와 일치하는 RANKL 유도 MAPK 신호 전달 경로를 억제합니다.

4|논의

"사막 인삼"으로 알려진 Cistanche는 노화 및 산화 스트레스 동안 면역을 조절하고 보호 작용을 하는 능력으로 최근 많은 주목을 받았습니다(Jia et al., 2012; Snytnikovaet al., 2012). Cistanche의 주요 활성 성분인 Phenylpropanoid 치환 배당체는 대식세포의 NO활성을 억제하는 것으로 나타났습니다(Ahn, Chae, Chin, & Kim, 2017). 또한,시스탄체추출물은 허혈 후 재관류 심근에서 산화 스트레스를 감소시키고 심장 보호로 이어지는 세포 사멸 경로의 억제에 중요한 역할을 했습니다(Yu, Li, & Cao, 2016). Cistanche의 중요한 구성 요소로, CDP(시스탄체데저스티콜라다당류)다양한 약리학적 기능을 가지고 있다. 우리의 현재 연구는 CDP가 NFAT 및 MAPK 활성화뿐만 아니라 ROS 생성을 약화시킴으로써 RANKL 활성화 파골세포 분화 및 활성화를 억제한다는 것을 발견했습니다.

산성 포스파타제로서 TRAcP는 다양한 세포에 존재하며 파골세포 및 폐포 대식세포에 풍부하다(Snipes, Lam, Dodd, Gray, & Cohen, 1986). TRAcP는 파골세포의 특징적인 효소로서 그 발현은 파골세포 활성 및 골흡수의 지표로 간주되는 파골세포 기능과 밀접한 관련이 있다(Minkin, 1982). Inour 연구, CDP(시스탄체데저스티콜라다당류)TRAcP 양성 세포의 수를 억제하여 RANKL 유도 파골세포 형성이 CDP에 의해 차단되었음을 나타냅니다.(시스탄체데저스티콜라다당류). 파골세포에 의한 뼈 기질의 분해는 카텝신 K(CTSK) 및 MMP에 따라 다릅니다(Gruber, 2015). 여기서, CDP는 Mmp9, Ctsk 및 Acp5와 같은 파골세포 기능 유전자의 발현을 유의하게 하향조절하였다.

파골세포 분화와 기능은 여러 신호 전달 경로에 의해 조절됩니다(Boyle, Simonet, & Lacey, 2003). RANK에 결합한 후 RANKL은 어댑터 단백질 TRAF6을 모집하여 파골세포 형성에 중요한 전사 인자인 NFATc1의 발현을 활성화하여 TRAcP 및 CTSK를 포함한 파골세포 특이적 유전자 발현에 영향을 미칩니다(X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). 이 연구에서 우리는 CDP가(시스탄체데저스티콜라다당류)파골세포에서 RANK 및 TRAF6 발현에는 영향을 미치지 않았습니다. 그러나 CDP(시스탄체데저스티콜라다당류)BMM의 파골세포 형성 동안 RANKL 유도 NFATc1 활성화를 억제했습니다. 또한 미토콘드리아에서 전자를 전달하는 과정에서 생성되는 ROS가 파골세포의 증식과 분화를 촉진하고 골기질 분해를 조절하는 것으로 나타났다(Ha et al., 2004). 최근 연구에 따르면 RANKL은 Bach1 핵수입을 유도하고 Nrf2 매개 항산화 효소 생산을 약화시켜 마우스에서 세포 내 ROS 발현 및 파골세포 생성을 증가시키는 것으로 나타났습니다(Kanzaki et al., 2017). 또한, 호모시스테인 강화 파골세포 형성 및 활성에 의한 세포 내 ROS 생성 증가(Koh et al., 2006). 우리의 연구는 CDP가 NOS2 발현을 억제하고 TRX1 및 글루타티온 환원효소와 같은 항산화 효소의 발현을 촉진함으로써 파골세포에서 ROS 축적을 감소시킨다는 것을 발견했습니다. NFATc1. 우리는 또한 과산화물이 CDPon NFATc1 발현의 억제 효과를 구제한다는 것을 발견했습니다. 따라서 우리의 데이터는 CDP가 ROS 축적을 억제하여 NFATc1 발현을 억제한 다음 억제 파골 세포 형성 및 기능을 억제함을 시사합니다.

ERK, JNK 및 p38은 파골세포 분화 조절에도 관여하는 MAPK 계열에 속합니다(Seger & Krebs, 1995). RANKL은 ERK, JNK 및 p38의 인산화를 증가시켜 MAPK 경로를 활성화합니다(Mizukami et al., 2002). 우리는 CDP(시스탄체데저스티콜라다당류)MAPK 경로에서 주요 단백질의 RANKL 매개 인산화를 억제하여 파골세포 마커 유전자의 발현에 대한 CDP의 억제 효과에 기여합니다. 우리가 아는 한, 이것은 CDP의 억제 효과를 보여주는 첫 번째 연구입니다.(시스탄체데저스티콜라다당류)ROS 생산, NFAT 및 MAPK 활성화에 관한 것으로, 시험관 내에서 CDP의 새로운 작용 메커니즘을 나타냅니다.

요약하면, 우리는 CDP가(시스탄체데저스티콜라다당류)파골세포 형성 및 수산화인회석 흡수, Ctsk, Mmp9 및 Acp5를 포함한 파골세포 마커 유전자의 발현을 약화시킵니다. CDP(시스탄체데저스티콜라다당류)RANKL 매개 ROS 생성과 NFAT 및 MAPK 활성화를 억제할 수 있었습니다(그림 8). 종합적으로, 우리의 결과는 CDP가(시스탄체데저스티콜라다당류)ROS 과잉생산을 수반하는 파골세포 관련 질환의 치료를 위한 후보 약물을 나타낼 수 있습니다.

그림 8 CDP의 개략도(시스탄체데저스티콜라다당류)파골세포 분화의 기능. CDP(시스탄체데저스티콜라다당류)RANKL 유도 ROS 생성과 NFATc1 및 MAPK 활성화를 억제하여 파골세포 생성을 억제합니다. CDP,시스탄체데저스티콜라다당류; MAPK, 미토겐 활성화 단백질 키나제; NFATc1, 활성화된 T 세포의 핵 인자; RANKL, 핵 인자 κBligand의 수용체 활성화제; ROS, 활성 산소종 [색상 그림은 atwileyonlinelibrary.com에서 볼 수 있음]

감사의 말

이 연구는 중국 자연과학재단(81572164), 중국 국가핵심기술연구개발계획(2017YFC1103300), 광시성 자연과학재단(2016GXNSFAA380295) 및 광시성 대학 과학기술 연구 프로젝트(KY025415YB0)의 지원을 받았습니다. ). 또한 GuangxiScientific Research and Technology Development Plan Project(GKG13349003, 1598013-15), Western Australia Medical & HealthResearch Infrastructure Fund, Arthritis Australia Foundation, TheUniversity of Western Australia(UWA) Research CollaborationAwards, 호주 보건 의료 연구 위원회(NHMRC, 번호 1107828 및 1027932).